杜前進 鄧成儒 趙懷寶 陳川平 曾俊輝

摘 要 使用三亞市美藤果種植基地種植的美藤果種仁的脫脂粉，分別采用酶法除雜濃縮法和堿溶酸沉淀法進一步提取蛋白質(zhì)，分別得到美藤果濃縮法蛋白（PPC）和堿提取的蛋白（PPI）。實驗數(shù)據(jù)表明：其等電點近似為pH 4.5；2種方法提取蛋白粉的溶解性都是隨pH的升高呈先降低后升高的趨勢；在吸水性、吸油性和起泡性方面，PPC比PPI略好；在溶解性和粘度方面，PPI優(yōu)于PPC；在50℃左右PPC和PPI吸油性最大時，分別達到293%和165%。

關鍵詞 美藤果 ；種仁 ；酶法除雜濃縮法 ；堿溶酸沉淀法 ；蛋白質(zhì)功能 ；蛋白質(zhì)性質(zhì)

中圖分類號 TS225.1 文獻標志碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.05.021

Abstract Through enzymatic removal of impurity concentration method and alkali soluble acid precipitation method to extract proteins in Plukenetia volubilis linneo seed from defatted powder， getting protein concentrate （PPC） and protein isolate （PPI）. Results showed that their isoelectric point is pH 4.5. When the value of pH is increasing， the solubleness of protein is decreasing and then increasing. PPI has better solubility and viscosity than PPC. PPC has better water imbibition， oil absorption and foaming ability than PPI. The oil absorption capacities of PPI and PPC reach the highest when temperature was around 50℃， the value are 293% and 165%， respectively.

Keywords Plukenetia Volubilis Linneo ； seed ； enzymatic removal of impurity concentration method ； alkali soluble acid precipitation method ； protein function ； protein property

美藤果（Plukentia volubilis Linneo）為被子植物門雙子葉植物綱大戟目大戟科的木質(zhì)藤本多年生油料作物，又名印加花生、山花生、南美油藤、長壽果、印奇果、星油藤、印加果等，原產(chǎn)南美洲安第斯山脈的亞馬遜河流域巴西的雨林地區(qū)，當?shù)赝林用袷秤昧藥浊闧1-2]。課題組在海南三亞引種種植美藤果，1 年就可以結果。美藤果種仁中不僅含有豐富的不飽和油脂、人體必需蛋白質(zhì)和優(yōu)質(zhì)氨基酸，而且還含有多種維生素和酚。油脂、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、醇等物質(zhì)是組成美藤果種仁的主要部分，也是研究開發(fā)利用的主要方向[2-7]。在其種仁榨完油之后，還剩余大量的美藤果餅粕未被利用，這不符合綠色環(huán)保的理念和可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略[3]。對廢棄的美藤果餅粕來說，不僅是一種資源的浪費，而且還造成環(huán)境污染。目前，對美藤果所含蛋白質(zhì)的研究不多[2，7-11]，工業(yè)上提取蛋白質(zhì)的方法主要有酶法除雜濃縮法[8]和堿溶酸沉淀法[9-12]。本實驗采用這2種生產(chǎn)工藝美藤果的蛋白質(zhì)性質(zhì)進行比較和分析[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

美藤果種仁，采摘于海南啟星生物科技有限公司美藤果種植示范基地，去殼機械榨油后的美藤果餅粕，保存于零下25℃冰箱中備用。

儀器：pH試紙、培養(yǎng)皿、離心管、玻璃棒、量筒、燒杯、錐形瓶、鐵架臺、天平、高速離心機 、紫外可見分光光度計、高速萬能粉碎機、碳氮分析儀、快速干燥機、恒溫水浴鍋、勻漿機、烘箱、奧氏粘度計等。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

1.2.1.1 美藤果餅粕處理

將美藤果種仁餅粕于-25℃的冰箱中取出，自然風干2 h，搗碎包裝好放入烘箱，95℃ 烘干5 h。取出于高速粉碎機中粉碎，過60目篩，所得粉末在45℃水浴鍋下用石油醚浸泡脫脂 6 h，然后置于通風櫥中風干24 h 以上，揮干石油醚所得美藤果種仁脫脂粉，再次放入80℃烘箱中烘干3 h，再用高速粉碎機粉碎，過100目篩，所得美藤果種仁蛋白質(zhì)粉末，于陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 2種美藤果蛋白粉的制備

酶法除雜法提取美藤果蛋白質(zhì)粉末流程：取干燥的美藤果種仁脫脂粉→85%乙醇除去多余的糖→α-淀粉酶除去干擾實驗的雜質(zhì)（淀粉酶用量為1.5%，提取溫度為水浴50℃）→95%乙醇洗滌→高速離心機離心（離心速率4 000 r/min，離心時間20 min）→烘干沉淀（烘干溫度為50℃）→美藤果濃縮蛋白粉末（PPC）[5]。

堿溶酸沉法提取美藤果蛋白粉末流程：取干燥的美藤果種仁脫脂粉→用堿NaOH溶解[其中配置NaOH溶液pH為11.5，NaOH溶液與美藤果種仁脫脂粉液料體積質(zhì)量比為25∶1（mL∶g），提取時間150 min，提取的水浴溫度60℃]→離心機離心（離心速率4 000 r/min，離心時間20 min）→蛋白粉溶液等電點沉淀→靜置分離沉淀→洗滌沉淀→風干干燥→繼續(xù)烘干干燥→美藤果堿提蛋白粉末（PPI）[5]。

1.2.2 項目測定

1.2.2.1 美藤果種仁脫脂粉蛋白等電點測定

美藤果蛋白等電點的測定方法[13]：用天平稱取5.0 g美藤果脫脂蛋白粉末，與蒸餾水按料液質(zhì)量體積比為1∶20（g/mL）的比例于燒杯中混合攪拌均勻，用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至4.5，水浴加熱到50℃，攪拌浸提1 h后，將溶液導入離心管，在室溫下以4 000 r/min離心20 min。取等量上清液，用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液分別調(diào)至一定pH梯度3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7，裝入離心管離心。離心分離后，立即采用考馬斯亮藍法測定上述清液中的蛋白質(zhì)含量。所測蛋白質(zhì)所殘留最低的上清液的pH即是美藤果種仁蛋白的等電點。重復2次，取3次的平均數(shù)。

1.2.2.2 2種不同蛋白粉末的吸水性測定

用分析天平準確稱取0.5 g的美藤果脫脂粉蛋白粉末樣品各11份，分別加入裝有10 mL蒸餾水的離心管中，用1 mol/L的HCl或l mol/L 的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH分別為2～12，并標號，混合均勻后震蕩，室溫下靜置30 min，稱量離心管的重量并記錄數(shù)據(jù)。放入離心機以 3 500 r/min的速度離心20 min，再小心吸除離心管上層水層后，稱量離心管的重量，并記錄數(shù)據(jù)。

根據(jù)公式計算吸水性：吸水性（%） =（m2-m1）/m×100%。重復2次，取3次的平均數(shù)作為結果進行分析。

1.2.2.3 2種不同蛋白粉末的吸油性測定

用分析天平稱取0.5 g蛋白粉末各5份樣品，分別加入含有 10 mL 蒸餾水的離心管中并標號，混合均勻后進行震蕩，并在水浴鍋中以30、40、50、60、70℃水浴30 min之后，稱量離心管的總重量，并記錄數(shù)據(jù)。然后放入離心機以3 500 r/min的速度離心20 min后取出，小心吸出上層油層后，稱量離心管的總重量。根據(jù)公式計算吸油性：吸油性（%）=（m2-m1）/m×100%。重復2次，取3次的平均數(shù)作為結果進行分析。

1.2.2.4 2種不同蛋白粉溶解性測定

測定美藤果蛋白溶解性的方法[21]：分別配制2種1%（m/V）美藤果脫脂粉末蛋白質(zhì)溶液于錐形瓶中，用配置標準的1 mol/L NaOH或者l mol/L HCl 溶液來調(diào)節(jié)溶液的pH，梯度分別為2～12。用玻璃棒不斷攪拌并震蕩，20 min后再裝入離心管，以4 000 r/min的速度離心，30 min后，立即取出于錐形瓶中收集上清液。用凱氏定氮法測上清液和樣品中的蛋白質(zhì)含量，計算樣品中的氮溶解指數(shù)（NSI）。氮溶解指數(shù)（%）=上清液中的含氮（mg）/樣品中的含氮量（mg）×100。

1.2.2.5 2種蛋白質(zhì)粉末起泡性測定

準確稱取1.25 g蛋白樣品各3份，分別加入含50 mL蒸餾水的錐形瓶中，震蕩混合均勻后全部倒入高速勻漿機中，l0 000 r/min攪打2 min后，立即全部倒入500 mL的量筒中，測量泡沫體積并記錄數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)的起泡性按以下公式計算：

起泡性（%）=泡沫停止時所量泡沫體積/美藤果蛋白溶液總體積×100%。

然后，立即將量筒置于30℃恒溫水浴鍋中，分別于10、20、30、40、50、60 min 時段記錄殘留泡沫體積，并計算相應起泡性。2組實驗分別重復3次。

1.2.2.6 2種蛋白質(zhì)粉末黏度測定

準確稱取0.5 g的2種美藤果脫脂蛋白粉末各3份，分別倒入50 mL 含有1.0%（m/V）海藻酸鈉蒸餾水的燒杯中，混合震蕩均勻后，分別置于水浴鍋中水浴加熱，在30、40、50、60、70℃溫度作用下1 h后，用奧氏黏度計測定其黏度，并記錄數(shù)據(jù)，取3次的平均數(shù)作為結果進行分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用碳氮分析儀測定美藤果種仁脫脂粉末中的粗蛋白質(zhì)含量。粗灰分含量測定參照LY/T 1268-1999、粗纖維含量測定參照GB/T 6434-2006、粗脂肪測定參照GB/T 14772-2008、水溶性糖測定參照YC/T159-2002標準進行測定[7]。

2 結果與分析

2.1 美藤果種仁蛋白脫脂粉的化學成分

從圖1可以看出，粗蛋白質(zhì)是美藤果脫脂粉中的主要化學成分，其蛋白質(zhì)含量高達63.62%，在植物中已遙遙領先。水溶性糖含量占樣品總量的9.58%，但對于提取蛋白質(zhì)來說，水溶性糖是生產(chǎn)過程中需去除的雜質(zhì)；粗纖維含量5.47%，粗灰分含量6.32%，含量相近，但也是蛋白質(zhì)除雜工藝必須除去的雜質(zhì)。粗脂肪的含量相對最少，只有2.06%。

2.2 美藤果種仁蛋白的等電點分析

由圖2可知，當美藤果脫脂粉蛋白質(zhì)溶液的pH值在3～4.5時，美藤果脫脂粉蛋白溶液的吸光值隨著pH值的增大而降低，然后又隨著美藤果脫脂粉蛋白質(zhì)溶液pH值的逐漸升高而吸光值也不斷升高，只是升高的趨勢不強。當pH值在4.5左右時，美藤果脫脂粉蛋白質(zhì)吸光度達到最小值，所以，上清液中殘留的美藤果種仁蛋白質(zhì)含量最小，析出的沉淀最多，故此時即為美藤果種仁蛋白的等電點。加酸至等電點是從提取液中分離蛋白的最簡便方法。它能確保提取液中蛋白質(zhì)最大量的沉淀。由圖2可知，美藤果種仁脫脂粉蛋白的等電點pH值約為4.5。這與文冠果（pH在4.6）[14]和茶子樹（pH為4.0）相近，跟趙旻等[3]的云南星油藤種仁蛋白結果一致。

2.3 2種方法得到的蛋白的吸水性比較

圖3顯示，美藤果脫脂粉堿提蛋白（PPI）和濃縮蛋白（PPC）在不同梯度pH下的吸水性。在等電點pH約為4.5時，吸水性最低。其美藤果脫脂粉蛋白質(zhì)分子間作用力此時最強，而美藤果蛋白質(zhì)分子與水分子的結合受到一定限制，就會導致吸水性降到最低。而對于美藤果脫脂粉濃縮蛋白（PPC）并沒有經(jīng)過堿溶解過程，也許還會受到少量粗纖或者維粗脂肪等美藤果組分等因素的影響，所以變化呈現(xiàn)不規(guī)律的現(xiàn)象。對于美藤果脫脂粉堿提蛋白（PPI）而言，以pH=4.5為中間點，pH增高或降低時，吸水性都升高。因為蛋白質(zhì)分子所帶有的凈電荷量增多，結合能力也會隨之增強，從而導致吸水性增大。本試驗研究表明：濃縮蛋白（PPC）在同等條件下，吸水性大于堿提蛋白（PPI）。

2.4 2種方法得到的蛋白的吸油性比較

由圖 4可以看出，美藤果脫脂粉PPI的吸油性低于濃縮蛋白PPC的吸油性。美藤果脫脂粉PPC和PPI的吸油性都達到最大值時的溫度，約50℃，其最大值分別為293%和165%，比趙旻等[3]的云南星油藤種仁蛋白的吸油性稍大，比一般的植物蛋白要高。美藤果PPC具有較好的吸油性，因為其美藤果種仁脫脂粉濃縮蛋白質(zhì)本身的疏水性基團能與油分子表面接觸，使其接觸面積更大，吸油性更好。當溫度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)會出現(xiàn)一定變性，從而使得蛋白質(zhì)凝聚結塊，就會在一定程度上減少與油接觸的表面積，減少吸油量。另外，隨著溫度的升高，油的粘度也會隨之降低，這些因素都會減弱油與美藤果蛋白分子與油分子的結合能力，從而導致蛋白質(zhì)吸油性下降。

2.5 2種方法得到的蛋白的溶解性比較

從圖5看出，在其等電點附近，即pH約為4.5時，美藤果脫脂粉溶解性最差。因為此時美藤果蛋白質(zhì)分子間的作用力最小，而在其凝聚而析出的蛋白質(zhì)沉淀最多，其蛋白質(zhì)的溶解性也達到最低[15-19]。隨著pH增加，美藤果脫脂粉蛋白質(zhì)的溶解性也逐漸升高。在本實驗的pH范圍內(nèi)，PPC比PPI的溶解性更低 。當酸堿度在等電點附近的pH時，可以明顯看出這2種美藤果蛋白溶解性的差異。

2.6 2種方法得到的蛋白的起泡性比較

圖6表示2種不同方法提取的蛋白在不同時間的起泡性，很顯然，PPC的起泡性要明顯高于PPI。這可能是美藤果脫脂粉PPC比PPI更容易吸附在水面上，從而進一步降低了其表面的張力，在受到高速勻漿機的攪打過程中，反而更容易形成泡沫，所以會得出反常的實驗現(xiàn)象[19]。

2.7 2種方法得到的蛋白的粘度性比較

由圖7可知，PPI的黏度要高于PPC。當溫度不斷升高時，2種不同美藤果蛋白溶液的黏度也會隨溫度的升高而降低?？赡苁菧囟壬?，分子間作用減少，粘度降低。而且當溫度升高到一定程度時，美藤果脫脂粉蛋白會產(chǎn)生變性，使疏水作用力不斷增大，從而進一步導致蛋白質(zhì)溶液的黏度下降[20]。2種不同的美藤果脫脂粉蛋白在溫度升高時黏度都會降低。

3 討論與結論

實驗和數(shù)據(jù)分析結果表明，美藤果種仁脫脂粉主要成分為：粗蛋白約63.62%、粗灰分約6.32%、粗纖維約5.47%、粗脂肪約2.06%、水溶性糖約9.58%；其中，粗蛋白含量高，有很大利用價值。美藤果種仁蛋白等電點在pH約4.5左右。研究范圍內(nèi)，在吸水性、吸油性方面，美藤果酶法除雜提取濃縮蛋白粉末（PPC）比堿提取蛋白粉末（PPI）略好；2種方法提取蛋白粉的溶解性都是隨PH的升高呈先降低后升高的特點；PPI比PPC有較好的溶解性，粘度也略高于濃縮蛋白。在起泡性方面，PPC優(yōu)于PPI；PPC和PPI的吸油性都達到最大值時的溫度，約50℃，其最大值分別為293%和165%；如果需要吸水性、吸油性、起泡性等功能性質(zhì)的蛋白質(zhì)時，可以用PPC提取美藤果種仁的蛋白質(zhì)。如果需要溶解性、粘度良好的功能性質(zhì)的蛋白質(zhì)時，可以用PPI方法提取獲得美藤果種仁的堿提蛋白質(zhì)。

致 謝 感謝中國科學院西雙版納熱帶植物園熱帶植物資源可持續(xù)利用重點實驗室的趙晏、張萍、李秀芬、許又凱等老師在論文完成過程中提供的幫助，特此致謝！

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