康曉育 李幗英 趙新紅

摘要：本試驗采用變溫熱處理結合莖尖培養(yǎng)對4個蘋果品種和2種砧木組培苗脫除潛隱性病毒的效應進行了研究。結果表明：不同的蘋果品種和砧木耐熱性不同。其中王林、珠美海棠的耐熱性最強，L—6、金矮生的耐熱性居中，首紅、天汪1號耐熱性最差。在相同處理條件下，不同的蘋果基因型脫毒率存在差異。其中王林脫毒效率最高，3種病毒的同時脫除率達到100%；金矮生ACLSV和ASPV兩種病毒的同時脫除率達到100%；ASGV的脫除率也在80%以上；株美海棠、L—6、天汪1號、首紅的脫除率較低。另外，不同病毒種類脫除的難易程度也存有差異，ACLSV最容易脫除，ASGV最難脫除，ASPV居中。

關鍵詞：蘋果品種；砧木；熱處理；脫毒率

文章編號：1005-345X（2016）04-0001-04 中圖分類號：S661.1 文獻標識碼：A

蘋果是世界四大水果之一，以其豐富的營養(yǎng)價值和較高的經(jīng)濟效益而成為世界上主要栽培的經(jīng)濟果樹。病毒病害是蘋果生產(chǎn)上的主要病害之一，蘋果樹受病毒侵染后，病毒在細胞核內(nèi)增殖，干擾、破壞樹體的正常生理機能，導致生長勢減退，產(chǎn)量下降，品質變劣，因此，果樹無毒化栽培已成為現(xiàn)代果樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向。

蘋果潛隱性病毒包括蘋果莖痘病毒（AS—PV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）。該類病毒雖無明顯癥狀，但可導致果樹樹勢變?nèi)?，果品品質變劣，給果樹生產(chǎn)帶來極大危害。目前主要通過莖尖培養(yǎng)、熱處理結合莖尖培養(yǎng)進行脫除。傳統(tǒng)的病毒檢測一般采用酶聯(lián)免疫法，隨著分子生物學技術的發(fā)展，目前逐漸被先進的RT—PCR方法代替。由于不同的果樹品種有其不同的結構和生理特點，因此脫毒效率各不相同。

本試驗以4個蘋果品種和2種砧木為試材，采用熱處理結合莖尖培養(yǎng)進行脫毒處理，比較不同基因型和砧木在脫毒過程中的反應和脫毒效率，以期為蘋果病毒的脫除方法研究提供指導，同時為蘋果品種和砧木無病毒材料的繁育提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗在天水市果樹研究所植物組培室進行。供試材料為組培室現(xiàn)有蘋果砧木試管苗珠美海棠、L—6，蘋果品種試管苗天汪1號、王林、首紅、金矮生及各品種和砧木田間生長旺梢。試管苗的繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5 mg/L。

1.2試驗方法

1.2.1單純莖尖培養(yǎng) 在新梢生長最快時期（5月中下旬），選擇大田生長健壯的母樹，采集生長旺盛、長約2～3 cm頂梢，去葉后作為外植體，用洗滌劑水浸3 min后，流水沖洗60～90 min；移入超凈工作臺上操作，倒入75%的乙醇浸泡30 s，蒸餾水沖洗后放人0.1%升汞（HgCl₂）中消毒10 min，無菌水沖洗3～5次，用滅菌濾紙吸干表面水分，在解剖鏡下迅速剝?nèi)?.5 mm莖尖進行分離培養(yǎng)。所用培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

1.2.2高溫熱處理結合莖尖培養(yǎng)方法將莖尖培養(yǎng)誘導形成的分化芽轉入MS+6-BA0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)40 d左右時，剪取2～3 cm的芽轉接，每品種接10瓶，每瓶4株。先在室溫（24～26℃）條件下培養(yǎng)10 d，然后轉移到人工氣候箱中，白天14 h，晚上10 h，從25℃開始每天升高1℃，逐漸升溫至32℃。從32℃開始每天升1℃，繼續(xù)升溫至38℃時，控制溫度白天38℃、光照14 h，夜間32℃、10 h，處理30 d。熱處理結束后在無菌條件下對存活的組培苗切取未褐變、壞死的莖尖約0.5 mm接種于再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d。

1.2.3病毒檢測 對熱處理后的瓶苗剪取0.5 mm莖尖繼續(xù)轉接在再生培養(yǎng)基中，以單株系進行擴繁，苗數(shù)達150～200株時，以1個培養(yǎng)瓶為1個樣本，隨機抽取3～4個樣本，每個樣本10～15株，將所選材料送至中國農(nóng)科院果樹研究所中國落葉果樹脫毒中心，利用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT—PCR）檢測方法，檢測蘋果莖痘病毒（ASPV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）。對于單純莖尖培養(yǎng)脫毒的組培苗采用酶聯(lián)免疫分析法進行脫毒檢測。

1.2.4數(shù)據(jù)調(diào)查與結果統(tǒng)計 熱處理28 d后統(tǒng)計莖尖成活率、增殖系數(shù)，觀察記錄植株老葉與新梢的表現(xiàn)癥狀。熱處理后試管苗莖尖成活率統(tǒng)計：增殖系數(shù)=1 cm以上的新梢數(shù)量/存活株數(shù)；莖尖成活率=（轉接的成活莖尖數(shù)/轉接莖尖總數(shù)）×100%。病毒檢測結果進行脫毒率統(tǒng)計：脫毒率=（檢測呈陰性樣本數(shù)/檢測樣本總數(shù)）×100%。

2結果與分析

2.1單純莖尖培養(yǎng)脫毒效果

從田間采集6個樣品共135個莖尖進行分離培養(yǎng)，成活35個，成活率為25.9%。采用酶聯(lián)免疫分析法檢測結果顯示，直接莖尖培養(yǎng)法脫毒效果很低，檢測35個蘋果莖尖，有2個莖尖脫除了蘋果褪綠葉斑病毒，有1個莖尖脫除了蘋果莖痘病毒，莖溝病毒則未能脫除。脫除率僅為8.57%（表1）。

2.2熱處理+莖尖培養(yǎng)脫毒效果

2.2.1高溫熱處理對莖尖成活率及植株生長的影響 試管苗的最初培養(yǎng)溫度為25℃，逐步升溫至38℃，熱處理過程中組培苗長期處于高溫高濕的微環(huán)境中，莖尖特別容易受害褐變死亡，而且死亡程度也各不相同。從表2可看出，不同試材的耐熱性存在差異。王林、珠美海棠試材耐熱性最強，莖尖成活率較高，老葉小部分枯死，新梢生長良好；L—6、金矮生的耐熱性居中，植株老葉受害嚴重，但莖尖沒有受害；首紅、天汪1號耐熱性最差，莖尖成活率低，老葉基本全部枯死，較短新梢莖尖死亡，部分較長新梢生長良好。另外，4個蘋果品種和2種砧木增殖系數(shù)也存在明顯差異。珠美海棠增殖系數(shù)顯著高于其余品種或砧木，天汪1號、首紅則顯著低于其余品種或砧木，且二者之間也存在顯著性差異。

2.2.2不同品種和砧木脫毒率的比較 由表3可以看出，3種病毒脫除的難易程度不同，ACLSV最易脫除，6個待檢樣品其脫除率達到100%；ASPV居中，王林和金矮生脫除率達到100%，其他4個脫除率在80%～95%；ASGV最難脫除，只有王林達到100%的脫除率，其他4個脫除率在65.8%～80.5%。單純莖尖培養(yǎng)脫除病毒也表現(xiàn)了這種趨勢。另外，不同的蘋果基因型脫毒效果存在差別，其中王林脫毒效率最高，3種病毒的同時脫除率達到100%。金矮生ACLSV和ASPV兩種病毒的同時脫除率達到100%，ASGV的脫除率也在80%以上。株美海棠、L—6、天汪1號、首紅的脫除率較低。

3討論

在莖尖脫毒技術中，因外植體大小不同，成活率和脫毒率相互制約，從脫毒這一目標來看，要求莖尖越小越好，但是莖尖太小，自身營養(yǎng)就不足，越難分化，加之切分時機械損傷，所以污染率和死亡率也就越高。因此，應該綜合考慮成活率和脫毒率兩個指標來確定莖尖的大小，本試驗采用的是0.5 mm的長度。目前常用的脫毒方法有兩種：方法1單純莖尖培養(yǎng)和方法2熱處理結合莖尖培養(yǎng)。綜合來說，方法2的脫毒率顯著高于方法1，這說明單獨使用小莖尖培養(yǎng)很難脫除果樹潛隱性病毒，而熱處理與小莖尖結合則可以較好地解決這個問題。這與變溫熱處理結合莖尖培養(yǎng)獲得的苗子脫毒效果較好研究結果一致，晏娜等研究報道，采用38℃/32℃變溫熱處理適合大多數(shù)品種和砧木脫除蘋果潛隱性病毒。因此，該試驗采用38℃/32℃變溫熱處理對6種試材進行脫毒，發(fā)現(xiàn)在相同熱處理條件下，蘋果基因型不同，病毒脫除效率不同。這與程玉琴等的觀點一致。

該研究中，3種病毒各自的脫除率存在顯著差異?？傮w表現(xiàn)為ASGV最難脫，ACLSV最容易脫除，ASPV居中。不同病毒類型脫除率不同的原因，除與熱處理條件和寄主有關外，還可能與病毒本身的特性和結構有直接關系。由3種病毒的病原學研究發(fā)現(xiàn)三者在形態(tài)長度、體外鈍化溫度和體外保存時間均存在明顯差異，且表現(xiàn)出一定的規(guī)律性。如在體外鈍化溫度上，由高到低為ASGV>ASPV>ACLSV；那么這些特性是否與病毒脫除相關，還需要進一步研究。另外研究也表明凡是脫除了ASGV的試材，其他兩種病毒也都是脫除了的，而脫除了ACLSV和ASPV的試材，ASGV未必脫除。因此，對攜帶有ASGV的試材進行脫毒處理后，可首先通過檢測ASGV進行初選，再對ASGV檢測呈陰性的材料進行其他病毒的檢測。這樣就可以大大減少病毒檢測的成本，提高檢測效率。