高效液相色譜法測定健腦補腎丸中連翹苷的含量

張穎

江蘇省中醫(yī)院 江蘇南京 210029

高效液相色譜法測定健腦補腎丸中連翹苷的含量

張穎

江蘇省中醫(yī)院 江蘇南京 210029

目的：采用高效液相法測定健腦補腎丸中連翹苷的含量。方法：采用 Agilent C18（150×4.6mm，5μm）色譜柱，以乙腈-水(25：75)為流動相，流速1.0 mL·min-1，檢測波長277nm，柱溫25℃。結果：連翹苷濃度在20.0～100.0μg·mL-1范圍內，與峰面積呈良好線性關系；平均加樣回收率為98.04%，RSD為0.85%。結論：該方法簡便、準確、重復性好，可作為健腦補腎丸質量控制方法。

高效液相色譜法；健腦補腎丸；連翹苷；含量測定；質量控制

健腦補腎丸是由人參、鹿茸、狗鞭、肉桂、連翹、金櫻子、杜仲（炭）、當歸等25味藥材提煉制成，具有健腦補腎，益氣健脾，安神定志等功效。連翹苷是連翹中的重要有效成分之一，為木脂類化合物，在抗炎解熱方面具有突出作用[1]。目前，對于健腦補腎丸的質量研究多集中于芍藥苷和綠原酸等成分的含量測定，未見對連翹苷成分的含量測定的相關文獻報道[2]。健腦補腎丸成分復雜,現(xiàn)行質量標準過于簡單,不夠完善。本實驗建立了高效液相色譜法測定其中連翹苷的含量，方法簡便快速，對于健腦補腎丸的質量控制具有一定意義。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

美國Waters 2695 高效液相色譜儀（Waters 2996 PDA檢測器，Empower 色譜工作站），十萬分之一電子天平（Mettler Toledo 公司），DQHZ-2001A恒溫振蕩器（江蘇太倉華美生化儀器廠），DGG-9053A超聲波清洗器（常州國華電器有限公司）。

1.2 試藥

健腦補腎丸（山東臨清華威藥業(yè)有限），對照品連翹苷（中國藥品與生物制品檢定研究院），甲醇為色譜純（江蘇漢邦科技有限公司），無水乙醇（AR，江蘇彤晟化學試劑有限公司），中性氧化鋁（國藥集團化學試劑有限公司），超純水。

2 方法與結果

2.1 測定方法 照高效液相色譜法（通則0512測定）。[3-5]

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 采用Agilent C18（150mm×4.6mm，5μm ）色譜柱，以乙腈－水(25：75) 為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為277nm，柱溫為25℃，進樣量為20μL，采集時間為60 min。理論板數(shù)按連翹苷峰計算應不低于 5000，連翹苷峰與相鄰峰的分離度應符合要求。

對照品溶液的制備 精密稱取連翹苷對照品 10.00mg，加甲醇制成0.10mg·mL-1連翹苷對照品溶液，即得。

供試品溶液的制備 取健腦補腎丸樣品適量，于研缽中研細，精密稱取研細后的粉末1g，精密加入甲醇15mL，至具塞錐形瓶中，密塞，稱定其重量，記錄數(shù)據(jù)，放置12h。超聲處理25min，放冷至室溫，補足失重，濾過。精密吸取續(xù)濾液 5mL，于蒸發(fā)皿中水浴蒸至約0.5mL，加中性氧化鋁粉末0.5g拌樣后，蒸干，加于處理好的中性氧化鋁柱（100～200目，1.5g，內徑15mm）上，用75%乙醇60mL洗脫，收集洗脫液，置水浴上再次蒸干，用 50%甲醇溶解，并轉入5mL量瓶中，定容到刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。

測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各 10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2 方法驗證

2.2.1 連翹苷的定性

分別取供試品溶液和對照品溶液，按2.1 色譜條件，進行色譜圖采集。實驗結果表明，供試品溶液中主峰的色譜保留時間與連翹苷對照品的保留時間一致。

2.2.2 線性關系

精密量取對照品溶液適量，分別制成濃度為20.0、40.0、60.0 、80.0、100.0μg/mL的溶液，按2.1色譜條件進行進樣分析，記錄色譜圖。以對照品溶液濃度為橫坐標X，測得的峰面積為縱坐標Y，進行線性回歸，得回歸方程為Y=8875.7X+13970,R2=0.9994,結果表明，連翹苷在20.0～100.0μg/ml范圍內線性關系良好。

2.2.3 精密度試驗

按2.1色譜條件，取同一對照品溶液（60.0μg/mL），連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，以連翹苷峰面積計算，RSD(n=6) 為 0.31%。結果表明精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、16、24 h，按2.1項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。連翹苷峰面積的 RSD 為0.13%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.5.4 重復性試驗

取同一批次樣品，按2.1項色譜條件平行測定6次，記錄色譜圖，計算連翹苷的含量。結果含量為 0.9076mg/g，RSD=1.5%，表明方法重復性良好。

2.5.5 回收率試驗

取已知含量的樣品（0.9076mg/g）9份，每份0.5g，分別加入濃度為4.0、6.0、8.0 mg/mL連翹苷對照品溶液各1ml，每個濃度組平行3份，混勻，制成低、中、高3種濃度的待測溶液，按前述實驗方法和條件，分別測定，計算回收率，結果見表1。由此可見，低、中、高 3種濃度的回收率均在 96.56%～99.07%之間，平均回收率為98.04%，RSD為0.85%。表明本定量分析的測定結果準確性較高。

表1 回收率計算表

圖1 連翹苷對照品

圖2 供試品溶液色譜圖

2.5.6 含量測定

分別取 3個批號的健腦補腎丸，每個樣品取 2 份，按2.1項下方法測定，結果見表2。

表2 健腦補腎丸中連翹苷的含量 （n=2）

3 討論

3.1 波長的選擇參考有關文獻[6-8]發(fā)現(xiàn)測定連翹苷含量的研究大多使用 280nm和277nm波長，極少的研究中使用205nm或228nm的波長。通過實驗比較，采用 277nm的色譜圖基線更加平穩(wěn)，檢出結果中有干擾作用的的雜質峰少，故選擇277 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

分別考察了乙腈-水系統(tǒng)和乙腈-0.5%磷酸系統(tǒng)作為流動相，實驗結果顯示，以乙腈－水系統(tǒng)為流動相，所得色譜峰峰形好，分離效果佳，故選擇乙腈-水作為流動相。

3.3 提取工藝的考察

在條件摸索過程中，我們根據(jù)資料查閱[9]嘗試過多中提取方法，其中具有對比價值的實驗方法為：取本品細粉適量，置于 70℃烘箱中干燥18個小時，精密稱定2.0g,置索氏提取器中，加入適量甲醇，水浴回流至提取液無色（約6h），回收甲醇至近干，加中性氧化鋁0.5g拌樣后，蒸干，加于處理好的中性氧化鋁柱（100～200目，1.5g，內徑15mm）上，用75%乙醇60ml洗脫，收集洗脫液，置水浴上蒸干，用50%甲醇溶解，并轉入10ml量瓶中，定容到刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，濾液作為供試品溶液。但是由于該處理方法耗時長，過程繁瑣，故最終采用本實驗的提取方法。

本實驗最終確立了高效液相色譜法測定健腦補腎丸中連翹苷含量，該方法穩(wěn)定性高，重復性好，分離效果好，樣品易處理，為健腦補腎丸的質量控制提供了更為全面的研究依據(jù)。

[1]張萌，富志軍，林以寧.連翹有效成分的吸收與代謝研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9(5):58-61

[2]靳維榮，高國敬，藤建北.高效液相色譜法測定健腦補腎丸中綠原酸的含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(2)：195-196

[3]中華人民共和國藥典2015年版（一部）[s]，北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015:170-171.

[4]潘酷，張輝，宋文靜.HPLC法測定清熱膠囊中連翹苷的含量[J].天津藥學，2016，28（2）：16-17.

[5]鄒曉華，何偉康，戴安印等.高效液相色譜法測定感冒熱毒清合劑中連翹苷的含量[J].中國醫(yī)藥導報，2015，12（15）：117-119，123.

[6]徐秀珍，栗曉黎.高效液相色譜法測定連翹中連翹苷的含量[J].藥物分析雜志，1998，18(3):203-204.

[7]王偉芳，徐綏緒，張國剛.用兩種高效液相色譜法測定連翹中連翹苷的含量[J].沈陽藥科大學學報，1999，16(4):265-269.

[8]韓桂茹，龐國勛.連翹苷檢測波長的研究[J].中國藥品標準，2005，6(3):71-73

[9]韓莉，張貞麗，徐麗華，袁敏.連翹中連翹苷含量測定方法的試驗研究[J].齊魯藥事,2008，27（3): 153-154.

R421.3+81

A

1672-5018（2016）12-030-02