于可響，黃兵，馬秀麗，劉存霞，胡峰，李峰，宋敏訓(xùn)

（山東省農(nóng)科院家禽研究所禽病研究中心，山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實驗室，山東濟(jì)南250023）

櫻桃谷肉鴨“大舌病”研究簡報*

于可響，黃兵，馬秀麗，劉存霞，胡峰，李峰，宋敏訓(xùn)**

（山東省農(nóng)科院家禽研究所禽病研究中心，山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實驗室，山東濟(jì)南250023）

2014年下半年以來，我國江蘇、山東、安徽、河北、江西等主要養(yǎng)鴨地區(qū)的櫻桃谷肉鴨中暴發(fā)了一種以喙短、舌長、骨脆、發(fā)育不良為主要臨床特點(diǎn)的疾病，生產(chǎn)中稱為“大舌病”或“長舌病”，給當(dāng)?shù)氐娜怿嗮B(yǎng)殖造成了很大的沖擊。我們從山東地區(qū)發(fā)病鴨中分離到一株能在番鴨胚和鵝胚繁殖的病毒（命名為YZ15-1），經(jīng)PCR鑒定，確定為小鵝瘟病毒。VP3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，YZ15-1與GPV處于同一個分支，特別與GPVa2006和GPVb1999這兩個臺灣分離株的遺傳關(guān)系最近。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)大舌癥狀的鴨子體內(nèi)均能檢測GPV，泄殖腔棉拭子的陽性率為78.8%；而發(fā)病鴨群中未出現(xiàn)大舌癥狀的鴨子體內(nèi)病毒檢測的陽性率為58.3%，泄殖腔棉拭子的陽性率為37.5%；同時從10個不同地區(qū)健康鴨群采集的100份泄殖腔棉拭子中未檢測到GPV。但是肉鴨回歸試驗未復(fù)制出“大舌”癥狀。這些結(jié)果說明，鴨“大舌病”可能是以變異的GPV為傳染性因素，其他輔助性因素共同作用的結(jié)果。

櫻桃谷鴨；鴨“大舌病”；小鵝瘟病毒；變異。

2014年下半年開始，在江蘇省沛縣及周邊養(yǎng)殖的商品櫻桃谷肉鴨中開始出現(xiàn)一種以喙短、舌長、骨脆、發(fā)育不良為主要臨床特點(diǎn)的疾病，生產(chǎn)中稱為“大舌病”或“長舌病”，實際上此命名并不準(zhǔn)確，患鴨是由于喙發(fā)育慢而使得舌頭突出在外，并不是舌頭變長。隨后該病逐漸蔓延到山東、河北、河南、安徽、江西等主要養(yǎng)鴨地區(qū)。病鴨最早可在6日齡出現(xiàn)舌頭突出的癥狀，隨后每天都會出現(xiàn)且新發(fā)病鴨的數(shù)量逐漸增多。病鴨在發(fā)病后期喙比正常鴨要短10%～30%，并且一旦發(fā)病很難恢復(fù)正常。剖檢病鴨發(fā)現(xiàn)，除了腸道炎癥外，無明顯的病變。該病的發(fā)病率差別很大，低的不到0.5%，高的可達(dá)30%，個別的可達(dá)70%。一般在5%～20%。該病剛開始發(fā)生于商品代櫻桃谷肉鴨，后來波及肉種鴨和番鴨。國內(nèi)研究人員已證實該病是由細(xì)小病毒引起，并將其稱為“鴨短喙長舌綜合征”或“鴨短喙和侏儒綜合征”[1-2]。由于舌頭突出，導(dǎo)致病鴨無法正常采食，因此病鴨常表現(xiàn)發(fā)育不良，腿、翅膀易斷，很多屠宰場拒收此類殘鴨，使得養(yǎng)殖戶損失嚴(yán)重。目前，該病有愈演愈烈的趨勢，需要引起足夠的重視。

1 材料與方法

1.1 病料采集本研究的病料來自于山東省兗州市某肉鴨養(yǎng)殖場21日齡的有“大舌”癥狀的病鴨。該養(yǎng)殖場從5日齡開始陸續(xù)出現(xiàn)腿瘸、喜臥、生長發(fā)育遲緩的病鴨，10日齡左右開始出現(xiàn)舌頭突出喙外的病鴨。

1.2 病毒分離無菌采集發(fā)病鴨的脾臟，加入5倍體積PBS（pH 7.2）和終濃度1000U/ml的雙抗，剪碎后充分研磨，然后分裝、反復(fù)凍融2次，3000rpm離心20min，取上清經(jīng)菌檢無菌后分別接種9日齡SPF雞胚、10日齡SPF鴨胚、10日齡肉鴨胚、10日齡番鴨胚和12日齡鵝胚，0.1ml/枚。收集接種后2～6d死亡的胚胎尿囊液或接種后6d未死的胚胎尿囊液，繼續(xù)盲傳5代，觀察并記錄接種胚胎死亡及病變情況，收集疑似病毒的尿囊液和胚胎凍存?zhèn)溆?。分離的毒株命名為YZ15-1。

1.3 病毒鑒定

1.3.1 血凝特性按常規(guī)方法進(jìn)行血凝試驗，分別測定分離毒對雞、鴨、鵝、鴿、鼠和兔紅細(xì)胞的血凝性。

1.3.2 PCR鑒定根據(jù)NCBI中已發(fā)表的小鵝瘟病毒（GPV）YZ99-6株的序列（登錄號：KC996730），設(shè)計一對特異性引物用于GPV的檢測。引物序列為：上游引物P1：5' CTTGAACACGACAAGGCC3'；下游引物P2：5 'GTCGGTAAGCTTCCCTGTATTT3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為234bp，引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

提取鵝胚分離毒的RNA，分別用A型鴨肝炎病毒（DHV-A）、C型鴨肝炎病毒（DHV-C）、番鴨呼腸孤病毒（MDRV）、新型鴨呼腸孤病毒（NDRV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）的特異性引物進(jìn)行RT-PCR鑒定；提取鵝胚分離毒的DNA，分別用鴨腸炎病毒（DEV）、番鴨細(xì)小病毒（MDPV）、鵝細(xì)小病毒（GPV）的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.4 VP3基因分析根據(jù)NCBI中已發(fā)表的GPV YZ株的序列（登錄號：KR091960），設(shè)計一對引物用于擴(kuò)增病毒的主要抗原基因-VP3基因。引物序列為：上游引物P1：5'CGGGAGGTGGCAGTAGTG 3'；下游引物P2：5'CGCCAGGAAGTGCTTTATT 3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1716 bp，引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

提取病毒的DNA，按照常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。取5μl反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖中電泳進(jìn)行檢驗。按照DNA凝膠回收試劑盒說明回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5ɑ。挑菌提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR和酶切鑒定，鑒定為陽性的菌落送上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，并與GenBank中發(fā)表的相關(guān)序列進(jìn)行比較。

從NCBI中獲取GPV和MDPV的VP3基因序列（表1），通過MEGA軟件將YZ15-1的VP3基因序列與GPV、MDPV做比對，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 本研究所選用毒株的背景

1.5 流行病學(xué)調(diào)查收集山東省的齊河、高唐、兗州、嘉祥、安丘、單縣、青州、沂南、東阿、臨邑、陽谷等11個地區(qū)、157份發(fā)病鴨群的泄殖腔棉拭子或病料，其中有大舌癥狀的病料35份、棉拭子70份；無大舌癥狀的病料12份、棉拭子30份；另外收集了10個地區(qū)的健康鴨的泄殖腔棉拭子100份，利用PCR方法進(jìn)行檢測。

1.6 肉鴨攻毒試驗1日齡櫻桃谷肉鴨90只，經(jīng)瓊脂擴(kuò)散試驗檢測無相應(yīng)的母源抗體。分別用鵝胚分離毒和發(fā)病鴨脾臟病料通過肌肉注射（0.5ml/只）加口服（1ml/只）的方式感染，30只/組，同時設(shè)空白對照組30只，觀察并記錄實驗鴨發(fā)病及死亡情況，并于試驗結(jié)束后對實驗鴨進(jìn)行稱重。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離通過番鴨胚和鵝胚分離到一株對胚胎有致死性的病毒，我們命名為YZ15-1。初次分離時，胚胎均未出現(xiàn)死亡，從第3代開始，少部分番鴨胚和鵝胚胚胎出現(xiàn)死亡，死亡時間集中在接種后4～6d，死亡胚胎表現(xiàn)為絨毛尿囊膜水腫，胚胎頭部、翅、趾有出血點(diǎn)。而通過SPF雞胚、SPF鴨胚和肉鴨胚未分離到對胚胎有致病性的病毒。盡管病毒能在番鴨胚和鵝胚繁殖，但病毒滴度普遍不高。

2.2 病毒鑒定

2.2.1 血凝特性該分離毒對雞、鴨、鵝、鴿、鼠和兔紅細(xì)胞均無血凝性。

2.2.2 PCR鑒定利用幾種常見鴨病毒病的特異性引物對分離毒株進(jìn)行PCR鑒定，檢測結(jié)果顯示，只有鵝細(xì)小病毒為陽性。

2.2.3 VP3基因分析通過測序發(fā)現(xiàn)，YZ15-1的VP3基因長1605bp，與GPV、MDPV的VP3基因長度一致。通過DNAStar軟件將YZ15-1的VP3基因序列與GPV和MDPV相比對，我們發(fā)現(xiàn)YZ15-1的VP3基因序列與GPV的同源性最近，達(dá)到93.1%～98.2%；與MDPV的同源性為81.5%～91.4%。通過MEGA軟件繪制了VP3基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），結(jié)果顯示，YZ15-1與GPV處于同一個分支，特別與GPVa2006和GPVb1999這兩個臺灣分離株的遺傳關(guān)系最近。

圖1 水禽細(xì)小病毒VP3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 流行病學(xué)調(diào)查采集11個地區(qū)的129份發(fā)病鴨群的泄殖腔棉拭子或病料，通過PCR方法進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)大舌癥狀的鴨子體內(nèi)均能檢測GPV（27/27），而泄殖腔棉拭子的陽性率為78.8%（52/66）；而發(fā)病鴨群中未出現(xiàn)大舌癥狀的鴨子體內(nèi)病毒檢測的陽性率為58.3%（7/12），泄殖腔棉拭子的陽性率為37.5%（9/24）。同時從10個不同地區(qū)健康鴨群采集的100份泄殖腔棉拭子中未檢測到GPV。

2.4 雛番鴨攻毒試驗分別用鵝胚分離毒和發(fā)病鴨脾臟病料回歸1日齡雛鴨，觀察至35日齡，實驗鴨未出現(xiàn)死亡，也未發(fā)現(xiàn)有“大舌”癥狀。但鵝胚分離毒攻毒組和脾臟病料攻毒組的平均體重分別比正常對照組降低4.25%和9.32%。

3 討論

水禽的細(xì)小病毒病主要有番鴨細(xì)小病毒病和鵝細(xì)小病毒?。ㄐ※Z瘟），這兩種病毒在形態(tài)特征、理化特性、基因組結(jié)構(gòu)等方面非常相似[3]。兩者具有一定的抗原交叉保護(hù)性，它們的共同抗原主要在核衣殼蛋白VP3，而VP1和VP2蛋白存在抗原性差異[4]。自然條件下，番鴨細(xì)小病毒只能感染番鴨，不能感染鵝，而鵝細(xì)小病毒不僅可以感染鵝，還可以感染番鴨。這兩種病毒病主要感染雛番鴨或雛鵝，以發(fā)病率高、死亡率高為主要特征[5]，與此次在肉鴨中流行的“大舌病”在發(fā)病特點(diǎn)上有很大的不同。

通過基因序列和抗原性分析，可以確實該病的病原實際上就是小鵝瘟病毒，只是因為宿主細(xì)胞受體結(jié)合部位的某個或某些位點(diǎn)的氨基酸變異，使其獲得了感染櫻桃谷肉鴨的能力。實際上，類似肉鴨“大舌病”的病例早在20世紀(jì)70年代法國的半番鴨中就開始出現(xiàn)，稱為“短喙和侏儒綜合征”，之后臺灣、波蘭也有類似病例的報道[6-7]。在我國南方的番鴨養(yǎng)殖中，時常會發(fā)現(xiàn)一些因感染過番鴨細(xì)小病毒而出現(xiàn)類似癥狀的“僵鴨”。近幾年來，山東個別肉鴨養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中也會發(fā)現(xiàn)極少數(shù)類似的“殘鴨”。這些都說明了水禽細(xì)小病毒一直在“努力”地變異著，直到最近兩年完全獲得感染肉鴨的能力，從而導(dǎo)致了該病的大暴發(fā)。

我們用鵝胚分離毒和病鴨病料對無母源抗體的櫻桃谷肉鴨總共進(jìn)行3次回歸實驗，試驗過程中采取了加大感染劑量、使用不同的感染方式、采用不同發(fā)病場的患鴨病料、選用不同種鴨場的雛鴨、口服環(huán)磷酰胺人為降低實驗鴨的免疫力、人為制造冷應(yīng)激等多種措施，但都未復(fù)制出“大舌”癥狀。盡管有研究報道該病可以在櫻桃谷肉鴨中復(fù)制出臨床癥狀[1-2]，但我們的回歸試驗至少說明該病較難復(fù)制，可能需要其他病原或協(xié)同因素的共同作用。

關(guān)于鴨“大舌病”傳播方式目前尚不明確?？梢源_定的是，其橫向傳播能力有限。該病剛開始流行時，生產(chǎn)中常常出現(xiàn)相距不足20m的兩棟鴨舍，一棟舍的鴨群發(fā)病，另一棟舍不發(fā)病的情況。通過走訪調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)該病發(fā)病有愈來愈早的趨勢，目前大多數(shù)感染發(fā)生在7日齡內(nèi)。這可能存在兩種傳播方式。第一種是垂直傳播，由于GPV和MDPV都有垂直傳播的特點(diǎn)，因此該病存在垂直傳播的可能性。但臨床中也會出現(xiàn)同一種鴨場的同一批鴨苗在同一地區(qū)進(jìn)行飼養(yǎng)，有的養(yǎng)殖場發(fā)病，有的養(yǎng)殖場不發(fā)病的情況，這似乎與垂直傳播相矛盾；第二種可能性是病毒一直在養(yǎng)殖場中存在，鴨苗一進(jìn)場即被感染。這種可能性非常大。因為通常一個養(yǎng)殖場會出現(xiàn)連續(xù)多批發(fā)病的情況。另外，臨床實踐證實，空欄期加強(qiáng)消毒，能大大降低下一批鴨的發(fā)病率。

總之，肉鴨“大舌病”作為一種新發(fā)疫病，其致病機(jī)理、變異機(jī)制、免疫機(jī)制、傳播途徑、防控措施等多個方面還需要進(jìn)一步的研究。

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S858.32

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1673-1085（2016）03-0013-04

2016-02-21

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊計劃（SDAIT-13-011-01）；山東省海外高層次人才（泰山學(xué)者）引進(jìn)計劃。

作者：于可響，男，博士，副研究員。E-mail：yukx1979@163.com。

**通訊作者：宋敏訓(xùn)，博士，研究員，E-mail：mxsong@aliyun.com。