靈芝多糖乙?；捌淇寡趸钚匝芯?/h1>
2016-05-23 06:13:59葉穎霞趙菊香陳盛強(qiáng)孫衛(wèi)文
安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào) 2016年2期
葉穎霞，趙菊香，陳盛強(qiáng)，孫衛(wèi)文
(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2.廣州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，廣東 廣州 510260)
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靈芝多糖乙?；捌淇寡趸钚匝芯?/p>
葉穎霞1，趙菊香1，陳盛強(qiáng)2，孫衛(wèi)文2
(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州510120；2.廣州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，廣東 廣州510260)
[摘要]目的通過化學(xué)修飾改變靈芝多糖分子結(jié)構(gòu)，并研究其體內(nèi)抗氧化活性。方法乙?；揎楈`芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP)，得到GLP乙酰化衍生物(GLP acetyl derivatives,GLPa)；將昆明種小鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組，陽性對(duì)照組，GLP高、低劑量組及GLPa高、低劑量組，測(cè)定小鼠血清和肝臟丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和過氧化氫酶(catalase，CAT)；建立高脂血癥大鼠抗氧化損傷模型，考察GLP及GLPa的抗氧化能力。結(jié)果GLPa及GLP均可以顯著提高正常小鼠肝組織CAT活力及T-AOC，降低小鼠血清及肝臟MDA含量，GLPa抗氧化活性明顯優(yōu)于GLP，且與給藥劑量相關(guān)。此外，GLPa及GLP還可以顯著降低四氧嘧啶致高脂大鼠的氧化損傷程度，提高其血清超氧化物歧化酶活力及肝臟T-AOC，并降低其血清MDA含量。結(jié)論乙?；揎椏娠@著提高靈芝多糖的抗氧化活性。
[關(guān)鍵詞]靈芝多糖；乙?；?；抗氧化
靈芝多糖(Ganodermalucidumpolysaccharide，GLP)為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss. ex Fr.)Karst.菌絲體的次生代謝產(chǎn)物，存在于其菌絲體及子實(shí)體中[1]。GLP具有抗腫瘤[2]、提高免疫力[3]、抗氧化[1]及抗輻射[4]等作用。天然來源的多糖具有低毒、無不良反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，但也存在一些不足：天然多糖并不都具有生物學(xué)活性[5]；一些多糖因?yàn)槠淅砘再|(zhì)或空間結(jié)構(gòu)等問題從而限制其藥理活性；某些多糖活性較弱，還需要進(jìn)一步改善[6]。當(dāng)前已有大量關(guān)于分子修飾多糖從而獲得理想的活性多糖的文獻(xiàn)報(bào)道。分子修飾方法主要分為化學(xué)修飾、物理修飾及生物修飾，以化學(xué)修飾運(yùn)用最為廣泛。化學(xué)修飾方法主要通過嫁接硫酸基、甲基、乙?；然鶊F(tuán)或者元素，以改變多糖理化性質(zhì)及活性[7]。研究[8-9]表明，分子修飾后的多糖不僅可以提高原有的生物學(xué)活性，有些甚至可以產(chǎn)生新的藥理作用。
目前已有關(guān)于對(duì)GLP硫酸化修飾的研究報(bào)道，經(jīng)硫酸化修飾使GLP具有顯著的抗腫瘤、抗癌活性[10]。而對(duì)于GLP乙?；揎椛袩o研究報(bào)道，從其他關(guān)于多糖乙酰化的研究報(bào)道可以推測(cè)，乙酰化可使多糖改變定向性及橫向次序，從而改變多糖的空間排布，增加其水溶性，改善其活性。因此本研究采用乙?；揎桮LP，通過體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乙酰化GLP抗氧化活性，為GLP相關(guān)藥品及功能保健品的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。
1材料與儀器
1.1材料與試劑靈芝：多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss. ex Fr.)Karst的干燥子實(shí)體，購自于廣州清平藥材市場(chǎng)，經(jīng)水體醇沉法[11]獲得粗多糖后，采用Superdex-G200分離得到純化GLP；過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)試劑盒、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)試劑盒：江蘇省南京建成生物工程研究所；三氯乙酸、吡啶、甲酰胺、乙酸酐、無水乙醇均為分析純。
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)昆明種小鼠及SD大鼠，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2008-0001。
1.3儀器DL-5000B離心機(jī)：上海飛鴿科學(xué)儀器廠；FA2004電子天平：上海菁華儀器有限公司；501-A型超級(jí)恒溫器：上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；UV-360紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；RE52-4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：常州金壇儀器有限公司。
2方法
2.1GLP乙?；苌?GLP acetyl derivatives，GLPa)制備按文獻(xiàn)[12]方法，稱取400 mg GLP溶于10 mL蒸餾水中，充分溶解，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至9.0，然后緩慢滴加5 mL甲酰胺，同時(shí)滴加NaOH溶液以維持反應(yīng)體系的pH值在8.2左右，反應(yīng)過程中持續(xù)攪拌，反應(yīng)結(jié)束后再緩慢滴加鹽酸至溶液呈中性，后用乙醇沉淀反應(yīng)體系，沉淀物用95%乙醇洗滌3次，沉淀物冷凍干燥后溶于100 mL蒸餾水中，3 000 Da透析袋透析72 h，濃縮，醇沉，冷凍干燥即得GLPa。采用紅外線檢測(cè)乙?；晒εc否[13]。
2.2GLPa對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響將60只昆明種小鼠隨機(jī)分成6組(雌雄各半)。分別為空白對(duì)照組：每天灌胃0.9%生理鹽水；陽性對(duì)照組：維生素C(vitamin C，Vc)，500 mg/kg，用前新鮮配制；GLP低劑量組：100 mg/kg；GLP高劑量組：300 mg/kg；GLPa低劑量組：100 mg/kg；GLPa高劑量組：300 mg/kg，連續(xù)灌胃給藥15 d。末次給藥后眼眶取血，收集后離心取血清。麻醉處死小鼠，剖取肝臟，按試劑盒指導(dǎo)方法檢測(cè)血清和肝臟MDA、肝臟T-AOC和CAT。
2.3GLPa對(duì)高脂血癥大鼠抗氧化損傷能力的影響取雌性SD大鼠，灌胃給予實(shí)驗(yàn)室配制的高脂飲食(豬油∶膽固醇∶膽鹽3號(hào)∶丙基硫氧嘧啶為50∶40∶8∶2)，每只2 mL，連續(xù)20 d。根據(jù)血清三酰甘油含量，取48只雌性SD大鼠，隨機(jī)分為6組。陽性對(duì)照組：血脂康200 mg/kg；陰性對(duì)照組：0.9%生理鹽水；GLP低劑量組：100 mg/kg；GLP高劑量組：300 mg/kg；GLPa低劑量組：100 mg/kg；GLPa高劑量組：300 mg/kg；另取8只正常飲食的雌性SD大鼠作為正常對(duì)照組：灌胃給予生理鹽水。各組通過腹腔注射連續(xù)給藥40 d。于第37天，除正常對(duì)照組外，其余6組SD大鼠均腹腔注射四氧嘧啶，200 mg/kg。72 h后，麻醉處死，腹腔主動(dòng)脈取血，離心(20 000 r/min，15 min)，取血清，按試劑盒指示方法檢測(cè)血清MDA與SOD以及肝臟的T-AOC。
3結(jié)果
3.1GLPa對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響
3.1.1GLPa量效關(guān)系考察以空白對(duì)照組和GLPa高、低劑量組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和GLPa高低劑量組血清MDA、肝臟MDA、肝臟T-AOC和肝臟CAT活力比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(血清MDA：F(2，27)=102.264，P=0.000；肝臟MDA：F(2，27)=238.222，P=0.000；肝臟T-AOC：F(2， 27)=190.601，P=0.000；肝臟CAT活力：F(2，27)=164.862，P=0.000)，以GLPa高劑量組降低血清和肝臟MDA及升高肝臟T-AOC和CAT活力的效應(yīng)最為顯著(P<0.05)。見表1。
3.1.2GLPa與陽性對(duì)照藥Vc抗氧化能力比較以GLPa高、低劑量組和陽性對(duì)照組為組合進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，陽性對(duì)照組和GLPa高、低劑量組血清MDA、肝臟MDA、肝臟T-AOC和肝臟CAT活力比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(血清MDA：F(2，27)=37.84，P=0.000；肝臟MDA：F(2，27)=57.78，P=0.000；肝臟T-AOC：F(2，27)=59.37，P=0.000；肝臟CAT活力：F(2，27)=75.61，P=0.000)，GLPa高、低劑量組降低血清和肝臟MDA及升高肝臟T-AOC和CAT活力的效應(yīng)均明顯優(yōu)于Vc(P<0.05)。見表1。
3.1.3乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)正常小鼠抗氧能力影響的兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析以GLP高、低劑量組和GLPa高、低劑量組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果顯示，乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)血清MDA、肝臟MDA、肝臟T-AOC和肝臟CAT活力的主效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩個(gè)因素的交互作用均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示，乙?；揎椏擅黠@提高GLP對(duì)正常大鼠的抗氧化能力。見表2。
表1 GLPa對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響±s)
注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與GLPa低劑量組比較，#P<0.05；與陽性對(duì)照組比較，△P<0.05；與GLP低劑量組比較，◇P<0.05；與GLP高劑量組比較，▲P<0.05。
表2 乙酰化修飾因素和劑量因素對(duì)正常小鼠抗氧化能力影響的兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果
3.2GLPa對(duì)高脂血癥大鼠抗氧化損傷能力的影響
3.2.1高脂血癥大鼠抗氧化能力的變化以空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組血清SOD和肝臟T-AOC水平較空白對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，血清MDA水平較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。結(jié)果提示，高脂血癥大鼠抗氧化能力較正常大鼠明顯降低。見表3。
3.2.2GLPa對(duì)高脂血癥大鼠抗氧化能力影響的量效關(guān)系考察以陰性對(duì)照組和GLPa高、低劑量組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，3組血清SOD、MDA和肝臟T-AOC水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(血清SOD：F(2，21)=230.5，P=0.000；血清MDA：F(2，21)=1 656.7，P=0.000；肝臟T-AOC：F(2，21)=490.2，P=0.000)，以GLPa高劑量升高血清SOD、肝臟T-AOC及降低血清MDA的作用為最優(yōu)。見表3。
3.2.3GLPa與陽性對(duì)照組血脂康抗氧化能力比較以陽性對(duì)照組和GLPa高、低劑量組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，3組血清SOD、MDA和肝臟T-AOC水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(血清SOD：F(2，21)=111.8，P=0.000；血清MDA：F(2，21)=292.3，P=0.000；肝臟T-AOC：F(2，21)=297.6，P=0.000)，GLPa高、低劑量降低血清MDA及升高血清SOD和肝臟T-AOC的效應(yīng)均明顯優(yōu)于血脂康(P<0.05)。見表3。
3.2.4乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)高脂血癥大鼠抗氧化能力影響的兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析以GLP高、低劑量組和GLPa高、低劑量組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果顯示，乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)血清SOD、血清MDA和肝臟T-AOC的主效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩個(gè)因素對(duì)血清MDA的交互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，GLPa提高高脂血癥大鼠體內(nèi)抗氧化能力的效應(yīng)明顯優(yōu)于GLP。見表4。
表3 GLPa對(duì)高脂血癥大鼠體內(nèi)抗氧化能力的影響±s)
注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，#P<0.05；與陽性對(duì)照組比較，△P<0.05；與GLP低劑量組比較，◇P<0.05；與GLPa低劑量組比較，▲P<0.05；與GLP高劑量組比較，□P<0.05。
表4 乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)高脂血癥大鼠體內(nèi)抗氧化能力影響的兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果
4討論
生物體內(nèi)MDA是自由基作用于脂質(zhì)過氧化所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，因此MDA濃度越低，則脂質(zhì)過氧化程度越低，表明機(jī)體抗氧化能力就越強(qiáng)[15]。因此，本研究選取MDA含量為其中的考察指標(biāo)。多糖具有清除自由基、抗衰老等作用的機(jī)制是：①羥基與多糖碳鏈末端的氫原子結(jié)合而生成H2O；②多糖通過提高SOD、CAT等抗氧化酶的活性，從而發(fā)揮抗氧化、防衰老的作用；③改善機(jī)體免疫力以抗氧化及防衰老。因此，可以通過測(cè)定機(jī)體內(nèi)SOD及MDA活力來評(píng)價(jià)受試藥的抗氧化活性[16-17]。
GLPa及GLP均可以顯著改善正常小鼠肝組織CAT活力及總抗氧化能力，降低小鼠血清及肝臟中MDA含量，GLPa的抗氧化活性明顯優(yōu)于GLP，且兩者抗氧化活力與給藥劑量均具有一定相關(guān)性，高劑量效果更優(yōu)。此外，GLPa及GLP對(duì)四氧嘧啶所致高脂大鼠的氧化損傷具有顯著改善能力，其作用機(jī)制為提高其血清SOD活力及肝臟T-AOC，并降低MDA含量。以上結(jié)果表明，GLPa的抗氧化活性顯著優(yōu)于未經(jīng)修飾的天然靈芝多糖，可能是因?yàn)橐阴；揎椄淖冹`芝多糖的空間排布及結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增加其親水性，從而提高了GLPa活性。
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Acetylation ofGanodermalucidumPolysaccharide and Its Antioxidant Activities
YEYing-xia1,ZHAOJu-xiang1,CHENSheng-qiang2,SUNWei-wen2
(1.TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangdongGuangzhou510120,China; 2.InstituteofNeuroscience,GuangzhouMedicalUniversity,GuangdongGuangzhou510260,China)
[Abstract]ObjectiveTo change the molecular structure of Ganoderma lucidum polysaccharide (GLP) through chemical modification, and to investigate its antioxidant activities in vivo. MethodsGLP was modified by acetylation to obtain the acetyl derivative GLPa. Kunming mice were randomly divided into blank control group, positive control group, high- and low-dose GLP groups, and high- and low-dose GLPa groups. The malondialdehyde (MDA), total antioxidant capacity (T-AOC), and catalase (CAT) in the serum and liver were measured; the model of anti-oxidative damage was established in hyperlipidemic rats to investigate the antioxidant capacity of GLP and GLPa. ResultsGLPa and GLP significantly increased the activity of CAT and T-AOC in the liver tissue of normal mice and reduced the levels of MDA in the serum and liver; the antioxidant activity of GLPa was better than that of GLP and was dose-dependent. In addition, GLPa and GLP significantly reduced the degree of oxidative damage induced by alloxan in the hyperlipidemic rats, increased the activity of serum superoxide dismutase and liver T-AOC, and reduced the serum level of MDA. ConclusionAcetylation can significantly improve the antioxidant activities of GLP.
[Key words]Ganoderma lucidum polysaccharide; Acetylation; Antioxidant
(收稿日期：2015-07-13；編輯：曹健)
[中圖分類號(hào)]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.024
作者簡介：葉穎霞(1974-)，女，主管中藥師
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葉穎霞，趙菊香，陳盛強(qiáng)，孫衛(wèi)文
(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2.廣州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，廣東 廣州 510260)
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靈芝多糖乙?；捌淇寡趸钚匝芯?/p>
葉穎霞1，趙菊香1，陳盛強(qiáng)2，孫衛(wèi)文2
(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州510120；2.廣州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，廣東 廣州510260)
[摘要]目的通過化學(xué)修飾改變靈芝多糖分子結(jié)構(gòu)，并研究其體內(nèi)抗氧化活性。方法乙?；揎楈`芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP)，得到GLP乙酰化衍生物(GLP acetyl derivatives,GLPa)；將昆明種小鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組，陽性對(duì)照組，GLP高、低劑量組及GLPa高、低劑量組，測(cè)定小鼠血清和肝臟丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和過氧化氫酶(catalase，CAT)；建立高脂血癥大鼠抗氧化損傷模型，考察GLP及GLPa的抗氧化能力。結(jié)果GLPa及GLP均可以顯著提高正常小鼠肝組織CAT活力及T-AOC，降低小鼠血清及肝臟MDA含量，GLPa抗氧化活性明顯優(yōu)于GLP，且與給藥劑量相關(guān)。此外，GLPa及GLP還可以顯著降低四氧嘧啶致高脂大鼠的氧化損傷程度，提高其血清超氧化物歧化酶活力及肝臟T-AOC，并降低其血清MDA含量。結(jié)論乙?；揎椏娠@著提高靈芝多糖的抗氧化活性。
[關(guān)鍵詞]靈芝多糖；乙?；?；抗氧化
靈芝多糖(Ganodermalucidumpolysaccharide，GLP)為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss. ex Fr.)Karst.菌絲體的次生代謝產(chǎn)物，存在于其菌絲體及子實(shí)體中[1]。GLP具有抗腫瘤[2]、提高免疫力[3]、抗氧化[1]及抗輻射[4]等作用。天然來源的多糖具有低毒、無不良反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，但也存在一些不足：天然多糖并不都具有生物學(xué)活性[5]；一些多糖因?yàn)槠淅砘再|(zhì)或空間結(jié)構(gòu)等問題從而限制其藥理活性；某些多糖活性較弱，還需要進(jìn)一步改善[6]。當(dāng)前已有大量關(guān)于分子修飾多糖從而獲得理想的活性多糖的文獻(xiàn)報(bào)道。分子修飾方法主要分為化學(xué)修飾、物理修飾及生物修飾，以化學(xué)修飾運(yùn)用最為廣泛。化學(xué)修飾方法主要通過嫁接硫酸基、甲基、乙?；然鶊F(tuán)或者元素，以改變多糖理化性質(zhì)及活性[7]。研究[8-9]表明，分子修飾后的多糖不僅可以提高原有的生物學(xué)活性，有些甚至可以產(chǎn)生新的藥理作用。
目前已有關(guān)于對(duì)GLP硫酸化修飾的研究報(bào)道，經(jīng)硫酸化修飾使GLP具有顯著的抗腫瘤、抗癌活性[10]。而對(duì)于GLP乙?；揎椛袩o研究報(bào)道，從其他關(guān)于多糖乙酰化的研究報(bào)道可以推測(cè)，乙酰化可使多糖改變定向性及橫向次序，從而改變多糖的空間排布，增加其水溶性，改善其活性。因此本研究采用乙?；揎桮LP，通過體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乙酰化GLP抗氧化活性，為GLP相關(guān)藥品及功能保健品的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。
1材料與儀器
1.1材料與試劑靈芝：多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss. ex Fr.)Karst的干燥子實(shí)體，購自于廣州清平藥材市場(chǎng)，經(jīng)水體醇沉法[11]獲得粗多糖后，采用Superdex-G200分離得到純化GLP；過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)試劑盒、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)試劑盒：江蘇省南京建成生物工程研究所；三氯乙酸、吡啶、甲酰胺、乙酸酐、無水乙醇均為分析純。
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)昆明種小鼠及SD大鼠，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2008-0001。
1.3儀器DL-5000B離心機(jī)：上海飛鴿科學(xué)儀器廠；FA2004電子天平：上海菁華儀器有限公司；501-A型超級(jí)恒溫器：上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；UV-360紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；RE52-4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：常州金壇儀器有限公司。
2方法
2.1GLP乙?；苌?GLP acetyl derivatives，GLPa)制備按文獻(xiàn)[12]方法，稱取400 mg GLP溶于10 mL蒸餾水中，充分溶解，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至9.0，然后緩慢滴加5 mL甲酰胺，同時(shí)滴加NaOH溶液以維持反應(yīng)體系的pH值在8.2左右，反應(yīng)過程中持續(xù)攪拌，反應(yīng)結(jié)束后再緩慢滴加鹽酸至溶液呈中性，后用乙醇沉淀反應(yīng)體系，沉淀物用95%乙醇洗滌3次，沉淀物冷凍干燥后溶于100 mL蒸餾水中，3 000 Da透析袋透析72 h，濃縮，醇沉，冷凍干燥即得GLPa。采用紅外線檢測(cè)乙?；晒εc否[13]。
2.2GLPa對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響將60只昆明種小鼠隨機(jī)分成6組(雌雄各半)。分別為空白對(duì)照組：每天灌胃0.9%生理鹽水；陽性對(duì)照組：維生素C(vitamin C，Vc)，500 mg/kg，用前新鮮配制；GLP低劑量組：100 mg/kg；GLP高劑量組：300 mg/kg；GLPa低劑量組：100 mg/kg；GLPa高劑量組：300 mg/kg，連續(xù)灌胃給藥15 d。末次給藥后眼眶取血，收集后離心取血清。麻醉處死小鼠，剖取肝臟，按試劑盒指導(dǎo)方法檢測(cè)血清和肝臟MDA、肝臟T-AOC和CAT。
2.3GLPa對(duì)高脂血癥大鼠抗氧化損傷能力的影響取雌性SD大鼠，灌胃給予實(shí)驗(yàn)室配制的高脂飲食(豬油∶膽固醇∶膽鹽3號(hào)∶丙基硫氧嘧啶為50∶40∶8∶2)，每只2 mL，連續(xù)20 d。根據(jù)血清三酰甘油含量，取48只雌性SD大鼠，隨機(jī)分為6組。陽性對(duì)照組：血脂康200 mg/kg；陰性對(duì)照組：0.9%生理鹽水；GLP低劑量組：100 mg/kg；GLP高劑量組：300 mg/kg；GLPa低劑量組：100 mg/kg；GLPa高劑量組：300 mg/kg；另取8只正常飲食的雌性SD大鼠作為正常對(duì)照組：灌胃給予生理鹽水。各組通過腹腔注射連續(xù)給藥40 d。于第37天，除正常對(duì)照組外，其余6組SD大鼠均腹腔注射四氧嘧啶，200 mg/kg。72 h后，麻醉處死，腹腔主動(dòng)脈取血，離心(20 000 r/min，15 min)，取血清，按試劑盒指示方法檢測(cè)血清MDA與SOD以及肝臟的T-AOC。
3結(jié)果
3.1GLPa對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響
3.1.1GLPa量效關(guān)系考察以空白對(duì)照組和GLPa高、低劑量組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和GLPa高低劑量組血清MDA、肝臟MDA、肝臟T-AOC和肝臟CAT活力比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(血清MDA：F(2，27)=102.264，P=0.000；肝臟MDA：F(2，27)=238.222，P=0.000；肝臟T-AOC：F(2， 27)=190.601，P=0.000；肝臟CAT活力：F(2，27)=164.862，P=0.000)，以GLPa高劑量組降低血清和肝臟MDA及升高肝臟T-AOC和CAT活力的效應(yīng)最為顯著(P<0.05)。見表1。
3.1.2GLPa與陽性對(duì)照藥Vc抗氧化能力比較以GLPa高、低劑量組和陽性對(duì)照組為組合進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，陽性對(duì)照組和GLPa高、低劑量組血清MDA、肝臟MDA、肝臟T-AOC和肝臟CAT活力比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(血清MDA：F(2，27)=37.84，P=0.000；肝臟MDA：F(2，27)=57.78，P=0.000；肝臟T-AOC：F(2，27)=59.37，P=0.000；肝臟CAT活力：F(2，27)=75.61，P=0.000)，GLPa高、低劑量組降低血清和肝臟MDA及升高肝臟T-AOC和CAT活力的效應(yīng)均明顯優(yōu)于Vc(P<0.05)。見表1。
3.1.3乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)正常小鼠抗氧能力影響的兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析以GLP高、低劑量組和GLPa高、低劑量組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果顯示，乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)血清MDA、肝臟MDA、肝臟T-AOC和肝臟CAT活力的主效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩個(gè)因素的交互作用均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示，乙?；揎椏擅黠@提高GLP對(duì)正常大鼠的抗氧化能力。見表2。
表1 GLPa對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響±s)
注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與GLPa低劑量組比較，#P<0.05；與陽性對(duì)照組比較，△P<0.05；與GLP低劑量組比較，◇P<0.05；與GLP高劑量組比較，▲P<0.05。
表2 乙酰化修飾因素和劑量因素對(duì)正常小鼠抗氧化能力影響的兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果
3.2GLPa對(duì)高脂血癥大鼠抗氧化損傷能力的影響
3.2.1高脂血癥大鼠抗氧化能力的變化以空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組血清SOD和肝臟T-AOC水平較空白對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，血清MDA水平較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。結(jié)果提示，高脂血癥大鼠抗氧化能力較正常大鼠明顯降低。見表3。
3.2.2GLPa對(duì)高脂血癥大鼠抗氧化能力影響的量效關(guān)系考察以陰性對(duì)照組和GLPa高、低劑量組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，3組血清SOD、MDA和肝臟T-AOC水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(血清SOD：F(2，21)=230.5，P=0.000；血清MDA：F(2，21)=1 656.7，P=0.000；肝臟T-AOC：F(2，21)=490.2，P=0.000)，以GLPa高劑量升高血清SOD、肝臟T-AOC及降低血清MDA的作用為最優(yōu)。見表3。
3.2.3GLPa與陽性對(duì)照組血脂康抗氧化能力比較以陽性對(duì)照組和GLPa高、低劑量組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，3組血清SOD、MDA和肝臟T-AOC水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(血清SOD：F(2，21)=111.8，P=0.000；血清MDA：F(2，21)=292.3，P=0.000；肝臟T-AOC：F(2，21)=297.6，P=0.000)，GLPa高、低劑量降低血清MDA及升高血清SOD和肝臟T-AOC的效應(yīng)均明顯優(yōu)于血脂康(P<0.05)。見表3。
3.2.4乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)高脂血癥大鼠抗氧化能力影響的兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析以GLP高、低劑量組和GLPa高、低劑量組為實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果顯示，乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)血清SOD、血清MDA和肝臟T-AOC的主效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩個(gè)因素對(duì)血清MDA的交互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，GLPa提高高脂血癥大鼠體內(nèi)抗氧化能力的效應(yīng)明顯優(yōu)于GLP。見表4。
表3 GLPa對(duì)高脂血癥大鼠體內(nèi)抗氧化能力的影響±s)
注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，#P<0.05；與陽性對(duì)照組比較，△P<0.05；與GLP低劑量組比較，◇P<0.05；與GLPa低劑量組比較，▲P<0.05；與GLP高劑量組比較，□P<0.05。
表4 乙?；揎椧蛩睾蛣┝恳蛩貙?duì)高脂血癥大鼠體內(nèi)抗氧化能力影響的兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果
4討論
生物體內(nèi)MDA是自由基作用于脂質(zhì)過氧化所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，因此MDA濃度越低，則脂質(zhì)過氧化程度越低，表明機(jī)體抗氧化能力就越強(qiáng)[15]。因此，本研究選取MDA含量為其中的考察指標(biāo)。多糖具有清除自由基、抗衰老等作用的機(jī)制是：①羥基與多糖碳鏈末端的氫原子結(jié)合而生成H2O；②多糖通過提高SOD、CAT等抗氧化酶的活性，從而發(fā)揮抗氧化、防衰老的作用；③改善機(jī)體免疫力以抗氧化及防衰老。因此，可以通過測(cè)定機(jī)體內(nèi)SOD及MDA活力來評(píng)價(jià)受試藥的抗氧化活性[16-17]。
GLPa及GLP均可以顯著改善正常小鼠肝組織CAT活力及總抗氧化能力，降低小鼠血清及肝臟中MDA含量，GLPa的抗氧化活性明顯優(yōu)于GLP，且兩者抗氧化活力與給藥劑量均具有一定相關(guān)性，高劑量效果更優(yōu)。此外，GLPa及GLP對(duì)四氧嘧啶所致高脂大鼠的氧化損傷具有顯著改善能力，其作用機(jī)制為提高其血清SOD活力及肝臟T-AOC，并降低MDA含量。以上結(jié)果表明，GLPa的抗氧化活性顯著優(yōu)于未經(jīng)修飾的天然靈芝多糖，可能是因?yàn)橐阴；揎椄淖冹`芝多糖的空間排布及結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增加其親水性，從而提高了GLPa活性。
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Acetylation ofGanodermalucidumPolysaccharide and Its Antioxidant Activities
YEYing-xia1,ZHAOJu-xiang1,CHENSheng-qiang2,SUNWei-wen2
(1.TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangdongGuangzhou510120,China; 2.InstituteofNeuroscience,GuangzhouMedicalUniversity,GuangdongGuangzhou510260,China)
[Abstract]ObjectiveTo change the molecular structure of Ganoderma lucidum polysaccharide (GLP) through chemical modification, and to investigate its antioxidant activities in vivo. MethodsGLP was modified by acetylation to obtain the acetyl derivative GLPa. Kunming mice were randomly divided into blank control group, positive control group, high- and low-dose GLP groups, and high- and low-dose GLPa groups. The malondialdehyde (MDA), total antioxidant capacity (T-AOC), and catalase (CAT) in the serum and liver were measured; the model of anti-oxidative damage was established in hyperlipidemic rats to investigate the antioxidant capacity of GLP and GLPa. ResultsGLPa and GLP significantly increased the activity of CAT and T-AOC in the liver tissue of normal mice and reduced the levels of MDA in the serum and liver; the antioxidant activity of GLPa was better than that of GLP and was dose-dependent. In addition, GLPa and GLP significantly reduced the degree of oxidative damage induced by alloxan in the hyperlipidemic rats, increased the activity of serum superoxide dismutase and liver T-AOC, and reduced the serum level of MDA. ConclusionAcetylation can significantly improve the antioxidant activities of GLP.
[Key words]Ganoderma lucidum polysaccharide; Acetylation; Antioxidant
(收稿日期：2015-07-13；編輯：曹健)
[中圖分類號(hào)]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.024
作者簡介：葉穎霞(1974-)，女，主管中藥師
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