木質(zhì)素合成酶基因反義COMT對亞麻的轉(zhuǎn)化及檢測

黃文功，康慶華，姜衛(wèi)東，姚玉波，詹亞光

(1.東北林業(yè)大學，哈爾濱150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，哈爾濱150086)

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木質(zhì)素合成酶基因反義COMT對亞麻的轉(zhuǎn)化及檢測

黃文功1,2，康慶華2，姜衛(wèi)東2，姚玉波2，詹亞光1*

(1.東北林業(yè)大學，哈爾濱150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，哈爾濱150086)

摘要：COMT基因主要參與S木質(zhì)素的生物合成，轉(zhuǎn)基因植物在COMT活性被抑制時，木質(zhì)素含量減少，利用楊樹皮儲藏蛋白(BSP)啟動子和該基因構(gòu)建成反義植物表達載體pBSP-antiCOMT-2301，利用農(nóng)桿菌介導法將其轉(zhuǎn)入亞麻，經(jīng)過卡那霉素篩選獲得了抗性的愈傷組織，誘導分化后獲得了亞麻苗。經(jīng)特異引物的PCR擴增，證明目的基因已經(jīng)整合到亞麻基因組中，本研究獲得的陽性轉(zhuǎn)基因亞麻植株為亞麻纖維研究及品種選育奠定了堅實基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：亞麻；咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因；遺傳轉(zhuǎn)化

亞麻纖維強韌、柔細，具有較好的色澤，織物平滑整潔，亞麻紡織品以其獨特的優(yōu)良品質(zhì)受到廣大消費者的青睞。紡織工業(yè)利用的是亞麻韌皮纖維，原麻需經(jīng)過脫膠后才能用于紡織，亞麻膠質(zhì)中木質(zhì)素是亞麻脫膠過程中最難去除的成分，原麻中的木質(zhì)素含量高不僅使得脫膠的成本大大提高，污染嚴重，同時，由于木質(zhì)素在原麻脫膠過程中難以去除，造成亞麻服裝穿著有刺癢感，嚴重影響了亞麻織品的質(zhì)量。因此，降低木質(zhì)素含量以提高纖維品質(zhì)，已成為發(fā)展亞麻產(chǎn)業(yè)急待解決的重大課題。目前也有對脫膠后的精麻進行酶處理以降低木質(zhì)素提高纖維的可紡性能等方面的報道，但效果并不理想，通過品種改良從源頭上降低亞麻纖維中的木質(zhì)素含量，是解決這一難題最為經(jīng)濟有效的辦法。

國際上通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控植物木質(zhì)素含量與組分已成為熱點。木質(zhì)素生物合成途徑的基礎(chǔ)研究也進展迅速，國內(nèi)外研究人員已分離克隆了多個木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，并構(gòu)建了單價與雙價反義表達載體，得到木質(zhì)素含量下降或木質(zhì)素組分改變的轉(zhuǎn)基因植物[1-4]。近年來，利用反義RNA技術(shù)轉(zhuǎn)化植物得到了木質(zhì)素含量和化學組分改變的植物，涉及的植物包括擬南芥、煙草、百日草、楊樹、火炬松等[4]。COMT主要參與S木質(zhì)素的生物合成[5]。在楊樹[6]、煙草[7]、苜蓿[8]、火炬松[9]中都有正義或反義抑制COMT活性的報道。轉(zhuǎn)基因植物在COMT活性被抑制到足夠低時，木質(zhì)素含量減少。目前國內(nèi)外關(guān)于COMT基因降低亞麻木質(zhì)素含量的研究還未見報道。

植物木質(zhì)素代謝關(guān)系到纖維的產(chǎn)量和質(zhì)量問題，研究韌皮纖維植物的木質(zhì)素代謝利于定向改良纖維品質(zhì)[10]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與質(zhì)粒

質(zhì)粒pBSP-antiCOMT-2301由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所的郭安平研究員饋贈，土壤農(nóng)桿菌LBA4404由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所實驗室保存。

1.1.2植物材料

亞麻是當前主要推廣栽培品種“黑亞14號”。

1.1.3酶與試劑

Taq DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司；MS鹽購自Invitrogen 公司；DL3000購自Takara公司；DNA Plant Mini Kit試劑盒購于天根公司。

1.1.4引物

在檢測陽性植株時所用引物為P1:5’-GCGACTAGTATGGGATCCAGTGAGA CT-3’，P2:5’-GCGCCCGGGTCAAGGCTTCTTGAGAAACTCC-3’，擴增到大小約1.1 kb的產(chǎn)物。

1.2方法

1.2.1植物表達載體pBSP-antiCOMT-2301導入農(nóng)桿菌及轉(zhuǎn)化子的鑒定

農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞的制備和電擊法將pCAM2301BSPantiCOMT轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌均參照分子克隆第三版[11]。

1.2.2農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化亞麻

通過抗生素濃度的篩選、農(nóng)桿菌菌液濃度及侵染時間的選擇、共培養(yǎng)溫度和共培養(yǎng)時間確立等方面研究，建立高效轉(zhuǎn)化體系：外植體材料下胚軸，抗生素卡那霉素(100 mg/L)，農(nóng)桿菌菌液OD600值0.6，侵染40 min，共培養(yǎng)溫度28℃，共培養(yǎng)時間為72 h。

1.2.3轉(zhuǎn)基因亞麻的PCR檢測

取轉(zhuǎn)基因亞麻和對照亞麻嫩葉，采用天根公司DNA Plant Mini Kit試劑盒提取基因組DNA，作為PCR反應(yīng)模板。以P1、P2為引物，PCR檢測轉(zhuǎn)基因情況。

2結(jié)果

2.1植物表達載體pBSP-antiCOMT-2301導入農(nóng)桿菌及轉(zhuǎn)化子的鑒定

植物表達載體pBSP-antiCOMT-2301(圖1)。取出一管分裝好的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞冰浴融化，將電擊杯(存于70%乙醇中)在超凈工作臺上吹干，然后在冰浴預冷，在滅菌1.5 mL Ep管中加1 mL YEB，感受態(tài)融好后，加<1 μL的質(zhì)粒pCAM2301BSPantiCOMT，混勻，將含質(zhì)粒的感受態(tài)加入電擊槽，電擊儀上電擊2.5 KV × 5 ms(EQUIBIO)，立即加入準備好的1 mL YEB，槍頭吹打動作要輕，吸出放回Ep管中，28℃、100 rpm搖菌復蘇1 h，涂于YEB平板(取100～200 μL)，28℃，倒置培養(yǎng)48～72 h。挑取單菌落，做菌落PCR。以引物P1， P2進行PCR操作。電泳檢測已擴增到COMT，其大小約為1.1 kb，電泳結(jié)果如圖2，進而確定植物表達載體已導入農(nóng)桿菌。

1：DL3000 Marker，2：COMT

圖1植物表達載體pBSP-antiCOMT-2301圖2COMT基因全長的擴增

Fig.1Plant expressing vector pBSP-antiCOMT-2301Fig.2The amplification of full length COMT

2.2農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化及亞麻植株再生

2.2.1亞麻品種黑亞14號再生體系的優(yōu)化

研究對亞麻品種黑亞14進行再生條件的優(yōu)化研究。黑亞14的最適的種子消毒條件為70%乙醇1.0 min，10%次氯酸鈉20 min。最適愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.05 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH 5.8。最適不定芽伸長培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH 5.8。

2.2.2農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化亞麻

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的下胚軸轉(zhuǎn)入含頭孢曲松鈉(500 mg/L)和卡那霉素(100 mg/L)MS 固體培養(yǎng)基中，1周后，對照組下胚軸逐漸褐化死亡(圖3)。轉(zhuǎn)基因亞麻下胚軸培養(yǎng)3周后，分化出不定芽(圖4)。

左：CK(非轉(zhuǎn)基因植株)，

右：轉(zhuǎn)pBSP-antiCOMT-2301植株

圖3CK及轉(zhuǎn)基因植株圖4Kna篩選的轉(zhuǎn)pBSP-antiCOMT-2301植株

Fig.3CK and transgenic plantFig.4pBSP-antiCOMT-2301 plant of Kna screening

2.3轉(zhuǎn)基因亞麻的 PCR 檢測

選取轉(zhuǎn)基因植株，分離其葉片基因組DNA，以COMT特異性引物進行擴增，獲得了預期大小(1.1 kb)的DNA，證明COMT基因已經(jīng)整合入亞麻基因組中(圖5)。

1-14，pBSP-antiCOMT-2301轉(zhuǎn)化植株的1-14號株系；15，pBSP-antiCOMT-2301對照；16，非轉(zhuǎn)基因植株。

3討論

大部分關(guān)于木質(zhì)素合成生物調(diào)控的遺傳操作都選用組成型強啟動子CaMV35S，它能啟動所轉(zhuǎn)入的基因在所有植物組織中進行非特異性表達，這可能對植物的正常生長及抗逆性造成負面影響，要避免這個問題可以使用組織特異性啟動子(如本研究的楊樹皮儲藏蛋白啟動子)，另外，由于木質(zhì)素合成酶基因中大部分存在多基因家族現(xiàn)象，故在制備RNAI載體時，應(yīng)該選擇與其他家族基因序列同源性低的序列。

亞麻組織培養(yǎng)過程中易發(fā)生徒長現(xiàn)象，分析原因是溫度較高、光照時間長導致，組培苗應(yīng)放在溫度不高于25℃，光照時間不長于自然光照即可避免徒長現(xiàn)象。

本研究通過pBSP-antiCOMT-2301的轉(zhuǎn)化，為利用基因工程技術(shù)抑制亞麻木質(zhì)素生物合成，創(chuàng)造適合中國國情的環(huán)保型低木質(zhì)素亞麻轉(zhuǎn)基因新品種奠定了基礎(chǔ)。

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Transformation and Detection ofLinumusitatissimumwith COMT Gene

HUANG Wengong1,2，KANG Qinghua2，JIANG Weidong2，YAO Yubo2，ZHAN Yaguang1*

(1.Northeast Forestry University, Harbin 150040,China;2.Industrial Crops Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086,China)

Abstract：The COMT gene mainly participates in the biosynthesis of S lignin. The content of lignin will reduce when the activity of COMT gene is suppressed in the transgenic plants. In this study，the BSP and COMT were inserted into the vector pCAM2301 to construct a recombinant expression gene. The recombinant gene was transformed into fiber flax by Agrobacterium tumefacien mediated callus transformation. The transformed calluses were subjected to kanamycin screening and resistance callus was induced in induction and differentiation culture. The transformed seedlings were obtained and verified by PCR. The COMT gene was integrated into genome of the flax. We gained the positive genetic flax would lay a solid foundation for the research of flax fiber and variety breeding.

Key words：flax；COMT；transformation

中圖分類號：S563.2

文獻標識碼：A

作者簡介：黃文功(1980-)，男，在讀博士研究生，助理研究員，主要從事亞麻育種研究。E-mail:huangwengong1736@163.com。*通訊作者：詹亞光(1963-)，女，研究員，主要研究方向為植物基因工程和植物細胞工程及其利用。E-mail: yaguangzhan@126.com。

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-19)

收稿日期：2016-01-01

文章編號：1671-3532(2016)02-0054-04