中國(guó)黃淮麥區(qū)菲利普孢囊線蟲淮陽(yáng)和博愛致病型群體特異性SCAR標(biāo)記的建立

徐 姣，劉 佳，代君麗，李洪連

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002)

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中國(guó)黃淮麥區(qū)菲利普孢囊線蟲淮陽(yáng)和博愛致病型群體特異性SCAR標(biāo)記的建立

徐 姣，劉 佳，代君麗，李洪連

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002)

摘要：菲利普孢囊線蟲(Heterodera filipjevi)是在我國(guó)黃淮麥區(qū)新發(fā)現(xiàn)的小麥病原線蟲，其致病力更強(qiáng)，危害更嚴(yán)重，對(duì)小麥產(chǎn)量和質(zhì)量造成潛在威脅。病原致病型鑒定對(duì)抗病品種的篩選和培育十分重要。為了建立一套簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的SCAR標(biāo)記檢測(cè)體系，以黃淮麥區(qū)5個(gè)重要禾谷孢囊線蟲致病型共9個(gè)群體為材料，首先對(duì)其進(jìn)行RAPD分析，然后在RAPD分析的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行SCAR分析。結(jié)果表明，通過(guò)篩選97條隨機(jī)引物，獲得2個(gè)菲利普孢囊線蟲淮陽(yáng)和博愛致病型群體特異的RAPD標(biāo)記，其中，引物S232擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶大小為550 bp，引物S278擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶大小為1 700 bp。其后將引物S232擴(kuò)增的條帶進(jìn)行回收、克隆及測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)的特異性引物F232-8-1/R232-8-1僅在菲利普孢囊線蟲淮陽(yáng)和博愛致病型群體中擴(kuò)增出大小為517 bp的特異性條帶，而在小麥孢囊線蟲其他致病型群體中沒(méi)有擴(kuò)增出該條帶，說(shuō)明菲利普孢囊線蟲淮陽(yáng)和博愛致病型群體SCAR標(biāo)記成功建立，并將其命名為SC-S232。

關(guān)鍵詞：小麥；菲利普孢囊線蟲；致病型；分子檢測(cè)

禾谷類作物孢囊線蟲病是世界性的植物寄生線蟲病害，起初認(rèn)為只危害溫帶禾谷類作物，現(xiàn)已蔓延危害生長(zhǎng)在不同溫度帶、各種土質(zhì)的禾谷類作物[1]，成為威脅小麥安全生產(chǎn)的一類重要病害。禾谷孢囊線蟲組是個(gè)復(fù)合種群，由12個(gè)正式定名的種和幾個(gè)未定名的種組成，其中禾谷孢囊線蟲(Heteraderaavenae)、菲利普孢囊線蟲(H.filipjevi)和麥類孢囊線蟲(H.latipons)被認(rèn)為是危害最嚴(yán)重的三個(gè)種，并且有時(shí)這三種線蟲會(huì)同時(shí)存在[2-5]。禾谷孢囊線蟲病于1874年首次在德國(guó)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已遍布50多個(gè)國(guó)家[6]。我國(guó)于1989年在湖北天門初次發(fā)現(xiàn)該病[7]，目前已在湖北、河南、陜西、甘肅、江蘇、寧夏、山東、內(nèi)蒙、天津、青海、安徽、新疆、西藏、河北、山西和北京16個(gè)省(市)發(fā)生[8-18]。該線蟲病在河南省發(fā)生普遍且嚴(yán)重，除了南陽(yáng)和信陽(yáng)外，其他16個(gè)市小麥均發(fā)生該病，嚴(yán)重危害當(dāng)?shù)匦←溕a(chǎn)。2010年，Peng等[19]和Li等[20]在河南省許昌市首次發(fā)現(xiàn)菲利普孢囊線蟲，隨后在該省7個(gè)地市發(fā)現(xiàn)該線蟲種。目前，菲利普孢囊線蟲的發(fā)生和分布僅在河南地區(qū)有公開報(bào)道，同時(shí)河南省也是燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲混合發(fā)生的唯一省份。

小麥孢囊線蟲病是一種土傳病害，在中國(guó)發(fā)生面積較廣，給防治帶來(lái)很大挑戰(zhàn)。郝 瑞等[21]用甘農(nóng)種衣劑Ⅲ號(hào)在小麥種植前對(duì)種子進(jìn)行包衣處理，能有效減少小麥根際周圍土壤中禾谷類作物孢囊線蟲(Cereal cyst nematode，CCN)的數(shù)量，但是目前高效低毒殺線蟲制劑的成本較高，在推廣應(yīng)用的過(guò)程中會(huì)受到一定的限制；Singh等[22]發(fā)現(xiàn)通過(guò)休耕，在CCN沒(méi)有寄主的條件下，燕麥孢囊線蟲(H.avenae)自發(fā)孵化造成幼蟲死亡，能使其數(shù)量每年降低70%～80%，但在眾多國(guó)家和地區(qū)，因受各種因素的限制，加上土地閑置會(huì)引起難以估計(jì)的經(jīng)濟(jì)損失，所以這種防治方式并不現(xiàn)實(shí)；張樹武等[23]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)CCN的致死作用較強(qiáng)，對(duì)CCN具有生防潛力，但是現(xiàn)在多數(shù)小麥CCN的生防真菌還沒(méi)研發(fā)成生防制劑，還未在生產(chǎn)上應(yīng)用。當(dāng)前，種植抗病品種被認(rèn)為是防治CCN的有效途徑。要合理利用抗病品種，認(rèn)識(shí)病原線蟲的種類和致病型就顯得尤為重要。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和依靠鑒別寄主進(jìn)行鑒定，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)工，而且難以鑒別和區(qū)分近似種、生理小種間的差異。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)鑒別線蟲種類和致病型成為一種趨勢(shì)。RAPD技術(shù)是由Williams等[24]和Welsh等[25]于1990年發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)，與其他技術(shù)相比，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短、不需要知道目的基因序列、所需樣品量少和引物具有普遍性等優(yōu)點(diǎn)，目前已成功應(yīng)用于植物寄生線蟲屬內(nèi)不同種及種內(nèi)群體的鑒定[26]。Caswell-Chen等[27]運(yùn)用RAPD技術(shù)成功區(qū)分了甜菜孢囊線蟲(H.schachtii)和十字花科孢囊線蟲(H.cruciferae)。Lopez-Braiia等[28]對(duì)采集自多個(gè)國(guó)家的11個(gè)禾谷孢囊線蟲群體進(jìn)行了RAPD分析，成功將這11個(gè)群體分為H.avenae和Gotland strain兩大種族。鄭經(jīng)武等[29]利用RAPD技術(shù)分析了中國(guó)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)上重要的四種植物線蟲的遺傳差異，并獲得了燕麥孢囊線蟲種的特異性分子標(biāo)記。劉 佳等[30]采用RAPD技術(shù)對(duì)黃淮麥區(qū)的小麥孢囊線蟲進(jìn)行了分析，并獲得了禾谷孢囊線蟲滎陽(yáng)致病型群體的RAPD標(biāo)記。SCAR技術(shù)最初是由RAPD技術(shù)發(fā)展而來(lái)，和RAPD標(biāo)記相比較，它的引物更長(zhǎng)并且能夠和模板完全互補(bǔ)，這樣擴(kuò)增結(jié)果更加穩(wěn)定，重復(fù)性更強(qiáng)。Meng等[31]成功地將南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)及爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)特異的RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化成為SCAR標(biāo)記。Ou等[32]采用RAPD-SCAR標(biāo)記技術(shù)得到了大豆孢囊線蟲的特異性SCAR標(biāo)記。Adam等[33]利用SCAR技術(shù)成功區(qū)別開了根結(jié)線蟲屬的7個(gè)種群。亓?xí)岳虻萚34]開發(fā)了禾谷孢囊線蟲的RAPD標(biāo)記，并轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，所獲得的SCAR標(biāo)記能夠?qū)坦孺吣揖€蟲進(jìn)行準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)。

以前的大量研究采用不同的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)植物寄生線蟲的不同種進(jìn)行分子鑒定，但是很少有借助分子手段對(duì)種下不同致病型或生理小種進(jìn)行鑒定的報(bào)道。2010年，Peng等[19]和Li等[20]采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法，首次報(bào)道在中國(guó)引起小麥孢囊線蟲病的病原線蟲除了燕麥孢囊線蟲外，還有菲利普孢囊線蟲。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室近年的研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)黃淮麥區(qū)存在禾谷孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲多種致病型混合侵染危害小麥的現(xiàn)象[35-39]。傳統(tǒng)的致病型鑒定方法周期太長(zhǎng)，而且結(jié)果易受主客觀因素的影響。鑒于此，本研究擬采用RAPD與SCAR標(biāo)記技術(shù)，以黃淮麥區(qū)已明確致病型的9個(gè)小麥孢囊線蟲群體為研究對(duì)象進(jìn)行研究，以期建立一套簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確的SCAR標(biāo)記檢測(cè)體系，為小麥孢囊線蟲病的有效防控奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材 料

本研究共收集了9個(gè)地區(qū)土樣，具體地理位置及各個(gè)地理位置所含有的線蟲種類信息見表1。這9個(gè)小麥孢囊線蟲群體可分為5個(gè)致病型，其中，禾谷孢囊線蟲包括3個(gè)致病型：(1)河南滎陽(yáng)致病型，(2)河北保定和河南商丘致病型，(3)河南安陽(yáng)、河南清豐和河南杞縣致病型；菲利普孢囊線蟲包括2個(gè)致病型：(1)河南許昌致病型，(2)河南淮陽(yáng)和河南博愛致病型。7月下旬到8月初，從發(fā)病CCN小麥田挖取足量小麥根際周圍的土壤，過(guò)篩(20目在上，60目在下)，將60目上的孢囊和有機(jī)質(zhì)混合物晾掉過(guò)多水分后放到75%蔗糖溶液中充分?jǐn)嚢?，用紗布收集漂浮在蔗糖溶液上面的孢囊，放在清水中反?fù)沖洗，將獲得的孢囊晾干，在體視鏡下用挑針慢慢的挑取孢囊，每個(gè)群體選取40個(gè)左右孢囊，進(jìn)行單孢囊的擴(kuò)繁，備用。

1.2方 法

1.2.1單孢囊DNA的提取

采用蛋白酶K-buffer法[24]提取單孢囊DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)DNA的濃度和純度，并稀釋至50 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　采集樣品的地理位置及其所含線蟲種類信息表

1.2.2RAPD標(biāo)記的建立

擴(kuò)增所用的97條RAPD隨機(jī)引物均由上海生工生物工程公司合成，2×TaqPCR Master Mix購(gòu)自萊楓生物工程公司。反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，RAPD引物(10 μmol·L-1)1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，36 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在EB中染色，然后用凝膠成像系統(tǒng)Ingenius LHR despodch記錄并分析RAPD譜型。

1.2.3SCAR標(biāo)記的建立

用快速型瓊脂糖DNA回收試劑盒Ⅱ型(BioTeKe公司)對(duì)隨機(jī)引物S232擴(kuò)增的特異性RAPD條帶進(jìn)行切膠、回收純化后，將純化產(chǎn)物與pMD19-T載體(TaKaRa公司)連接，并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。經(jīng)培養(yǎng)后，采用菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，并將陽(yáng)性克隆委托上海生工生物工程公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析，設(shè)計(jì)引物 F232-8-1/R232-8-1(F232-8-1:5′-CCACTCTATAGGATTGCCAT TG-3′; R232-8-1: 5′-CCACTTCCGTAGTTTT CTCA-3′)，對(duì)孢囊線蟲的DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，F(xiàn)232-8-1(5 μmol·L-1)1 μL，R232-8-1(5 μmol·L-1)1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按1.2.2中所述方法電泳、記錄。

2結(jié)果與分析

2.1RAPD標(biāo)記的建立

1～9分別代表滎陽(yáng)、保定、商丘、安陽(yáng)、清豐、杞縣、許昌、淮陽(yáng)和博愛小麥孢囊線蟲群體；M：DL2000(TaKaRa公司)；箭頭所示為特異性條帶。圖2和圖5中同

1～9 indicate cereal cyst nematode populations from Xingyang,Baoding,Shangqiu,Anyang,Qingfeng,Qixian,Xuchang,Huaiyang and Boai,respectively; M:DL2000(TaKaRa company)；Arrow shows specific band.The same as in Fig.2 and Fig.5

圖1隨機(jī)引物S232對(duì)5個(gè)致病型9個(gè)小麥孢囊線蟲群體的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1PCR products of 5 pathotypes amplified from 9 cereal cyst nematode populations

with random primer S232 separated on ethidium bromide-stained 1% agarose gel

利用97條RAPD隨機(jī)引物對(duì)黃淮麥區(qū)5個(gè)致病型共9個(gè)小麥孢囊線蟲群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每條引物至少重復(fù)擴(kuò)增3次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有90條引物在5個(gè)不同致病型中具有多態(tài)性，可擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性好的條帶。其中，2條引物能對(duì)黃淮麥區(qū)5個(gè)致病型共9個(gè)小麥孢囊線蟲群體擴(kuò)增出穩(wěn)定的多態(tài)性條帶。引物S232(5′-ACCC CCCACT-3′)和引物S278(5′-TTCAGGGCAC-3′)擴(kuò)增出了淮陽(yáng)和博愛致病型群體特異性條帶(圖1、圖2)，大小分別為550 bp和1 700 bp。為消除個(gè)體的差異，隨機(jī)挑取淮陽(yáng)和博愛致病型群體各3個(gè)單孢囊純系進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果(圖3、圖4)顯示，這2個(gè)引物均能擴(kuò)增出相同的淮陽(yáng)和博愛致病型群體特異性條帶，和前述PCR擴(kuò)增結(jié)果一致，說(shuō)明這兩個(gè)RAPD標(biāo)記確實(shí)是淮陽(yáng)和博愛致病型群體的特異性分子標(biāo)記。

2.2SCAR標(biāo)記的建立

將隨機(jī)引物S232擴(kuò)增的特異性RAPD條帶進(jìn)行回收，克隆后送菌液到上海生工公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，引物S232擴(kuò)增出的淮陽(yáng)和博愛群體的特異性條帶大小為517 bp，Blast比對(duì)，序列覆蓋率(Query coverage)在4%～14%之間，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何同源序列。

依據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物F232-8-1/R232-8-1，對(duì)線蟲DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，引物F232-8-1/R232-8-1可以從淮陽(yáng)和博愛致病型群體中擴(kuò)增出大小為517 bp的條帶(圖5)，而黃淮麥區(qū)其他致病型群體中沒(méi)有擴(kuò)增出此特異性條帶。說(shuō)明該引物是菲利普孢囊線蟲淮陽(yáng)和博愛致病型群體的特異性引物，即菲利普孢囊線蟲淮陽(yáng)和博愛致病型群體特異性SCAR標(biāo)記成功建立，并將其命名為SC-S232。

圖2　隨機(jī)引物S278對(duì)5個(gè)致病型9個(gè)小麥孢囊線蟲群體的擴(kuò)增結(jié)果

1～3: 淮陽(yáng)小麥單孢囊線蟲；4～6：博愛小麥單孢囊線蟲；M：DL2000(TaKaRa公司)；箭頭所示為特異性條帶。圖4中同

1～3 indicate 3 cysts from pure lines of Huaiyang population; 4～6 indicate 3 cysts from pure lines of Boai population; M: DL2000(TaKaRa company);Arrow shows specific band.The same as in Fig. 4

圖3隨機(jī)引物S232對(duì)隨機(jī)挑取的淮陽(yáng)和博愛小麥孢囊線蟲群體各3個(gè)單孢囊純系的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.3PCR products of single-cyst DNA amplified with random primer S232 from the respective

three samples collected from Huaiyang,and Boai in Henan Province

圖4　隨機(jī)引物S278對(duì)隨機(jī)挑取的淮陽(yáng)和博愛小麥孢囊線蟲群體各3個(gè)單孢囊純系的擴(kuò)增結(jié)果

3討 論

目前在我國(guó)小麥禾谷孢囊病引起的小麥危害面積已達(dá)333萬(wàn)hm2以上，嚴(yán)重地塊損失率可高達(dá)70%以上，已經(jīng)成為我國(guó)小麥生產(chǎn)中的一個(gè)重要問(wèn)題[40]。本研究選取的線蟲群體基本上覆蓋了黃淮麥區(qū)重要的小麥孢囊線蟲發(fā)生地區(qū)，建立孢囊DNA的分子檢測(cè)方法，與傳統(tǒng)鑒定方法相比，可大大縮短鑒定時(shí)間，而且使鑒定結(jié)果更加可靠，簡(jiǎn)單快捷，靈敏度高，有助于提高檢測(cè)效率。

10：陰性對(duì)照Negative control

圖5引物F232-8-1/R232-8-1對(duì)5個(gè)致病型9個(gè)小麥孢囊線蟲群體的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.5PCR products of 5 pathotype amplified from 9 cereal cyst nematode

populations with specific marker F232-8-1/R232-8-1

RAPD技術(shù)具有豐富的多態(tài)性和易操作性，因此它適合于檢測(cè)種及其以下水平的多樣性，但是，RAPD技術(shù)穩(wěn)定性和重復(fù)性差，需要進(jìn)行大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行RAPD反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的優(yōu)化，為了便于在實(shí)際運(yùn)用中推廣，本研究將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記。本研究中獲得了2個(gè)菲利普孢囊線蟲淮陽(yáng)和博愛致病型群體相關(guān)的RAPD標(biāo)記，但只有S232擴(kuò)增出的RAPD標(biāo)記成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，而S278擴(kuò)增出的RAPD標(biāo)記沒(méi)有轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記，分析SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化失敗的原因可能跑電泳樣品間污染造成。實(shí)驗(yàn)中利用DNAMAN軟件對(duì)S278特異性條帶序列設(shè)計(jì)了5對(duì)SCAR標(biāo)記引物，但依然沒(méi)有特異性，推測(cè)特異性條帶表現(xiàn)的不是其在致病型間的差異。

菲利普孢囊線蟲種的分子鑒定，已有很多研究報(bào)道，多是采用不同的限制性內(nèi)切酶酶切線蟲的rDNA-ITS序列，來(lái)區(qū)分不同的線蟲種類[41-46]。Peng等[47]開發(fā)了菲利普孢囊線蟲種特異性的SCAR標(biāo)記，并對(duì)所找到的SCAR標(biāo)記的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)所找到的SCAR標(biāo)記對(duì)2齡幼蟲裂解物的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.125 μL，對(duì)雌成蟲裂解物的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到3.9×10-3μL。Toumi等[48]根據(jù)菲利普孢囊線蟲的COI基因設(shè)計(jì)引物從Heterodera屬的混合群體中特異性的檢測(cè)出菲利普孢囊線蟲，檢測(cè)靈敏度達(dá)到5條線蟲。但是已有的研究報(bào)道多是針對(duì)植物寄生線蟲不同種的分子檢測(cè)和鑒定，很少有將研究目標(biāo)對(duì)準(zhǔn)種下生理小種或致病型的分子檢測(cè)和鑒定。本實(shí)驗(yàn)室將通過(guò)擴(kuò)大引物的篩選范圍，來(lái)獲得更多的致病型相關(guān)的分子標(biāo)記，并通過(guò)收集更多的菲利普孢囊線蟲和禾谷孢囊線蟲致病型群體來(lái)檢測(cè)所獲得標(biāo)記的特異性和有效性；另一方面還需要拓寬思路為致病型的分子檢測(cè)探索出更簡(jiǎn)便快捷的技術(shù)和方法，將小麥孢囊線蟲的致病型分子檢測(cè)體系和傳統(tǒng)的致病型鑒定方法相結(jié)合，建立一套完整的小麥孢囊線蟲致病型檢測(cè)體系，為抗病品種的選育和合理布局提供科學(xué)依據(jù)。

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Development of SCAR Marker for DetectingHeteroderafilipjeviof Huaiyang and Boai Pathotype Populations from Wheat-growing Regions of the Huang-Huai-Hai Plain in China

XU Jiao,LIU Jia,DAI Junli,LI Honglian

(College of Plant Protection,Henan Agricultural University/Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops,Zhengzhou,Henan 450002,China)

Abstract:Heterodera filipjevi was discovered in the Huang-Huai-Hai Plain in China and is a new pathogenic nematode of wheat. It seriously threatens wheat production due to the capability of high pathogenicity. Identification of pathogenic pathotype is quite important for screening and breeding of disease-resistant wheat cultivars.In order to establish a kind of rapid,convenient,and accurate method based on SCAR markers,random amplified polymorphism DNA(RAPD) techniques was used to analyze five pathotypes,including nine cereal cyst nematode(CCN) populations. A total of 97 random primers were screened and 2 of them,S232 and S278,produced distinct bands that were specific for Huaiyang and Boai populations of H.filipjevi based on RAPD method. The two specific bands were 550 base pair(bp),and 1 700 bp in size,respectively. Subsequently,a SCAR marker SC-S232 was developed according to the RAPD marker S232. The results showed that SC-S232 marker amplifies a positive band with a size of 517 bp from the Huangyang and Boai pathotype populations of H.filipjevi,but none product from other pathotype populations of CCN in the Huang-Huai-Hai plain. This SCAR marker SC-S232 can be used to detect the Huangyang and Boai pathotype populations in this region.

Key words:Wheat; Heterodera filipjevi; Pathotype; Molecular detection

中圖分類號(hào)：S512.1；S435

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-1041(2016)04-0523-08

通訊作者：代君麗(E-mail: daijl666@sina.com); 李洪連(E-mail: honglianli@sina.com)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101419)；國(guó)家公益性(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903040-4)

收稿日期：2015-11-08修回日期：2015-12-24

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-04-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160401.1534.038.html

第一作者E-mail：1789985160@qq.com