甄成　畢顯禹　李淑娟　　　　孫小環(huán)　許艷玲　石德山

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040)　　　　(大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)林業(yè)科學研究院)

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雜種藍莓(野生ב美登’)組培快繁1)

甄成畢顯禹李淑娟孫小環(huán)許艷玲石德山

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040)(大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)林業(yè)科學研究院)

摘要為了建立高效的雜種藍莓組培快繁技術體系，以大興安嶺地區(qū)野生藍莓和栽培品種‘美登’(‘Blomidon’)雜交獲得的雜交種子為試材，篩選出雜交種子最佳無菌處理條件，獲得藍莓雜種無菌苗。再以雜種無菌苗莖段為外植體，探究了不同質量濃度植物生長調節(jié)劑(ZT)、蔗糖及繼代周期對叢生芽誘導的影響，并探討了培養(yǎng)基種類及植物生長調節(jié)劑IBA質量濃度對生根誘導的影響。結果表明：雜交種子經(jīng)75%酒精和3%次氯酸鈉分別處理20 s和7 min效果最好，污染率為0；添加0.6 mg·L-1ZT和20 g·L-1蔗糖的WPM培養(yǎng)基為叢生芽誘導最佳培養(yǎng)基，誘導率高達100%，且芽叢密集、長勢好；芽誘導期間，30 d的繼代周期最有利于叢生芽的增殖，增殖倍數(shù)高達34.72；最佳生根培養(yǎng)基為添加0.4 mg·L-1IBA的1/2WPM培養(yǎng)基，生根率高達88%，且生根周期僅為40 d，移栽成活率達到85%以上。

關鍵詞藍莓；野生ב美登’；雜交種子；組織培養(yǎng)；快速繁殖

分類號Q943.1

Rapid Propagation System of Hybrid Blueberry (wildבBlomidon’)//

Zhen Cheng, Bi Xianyu, Li Shujuan

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Sun Xiaohuan, Xu Yanling, Shi Deshan(Daxing’an Mountain Academy of Agriculture and Forestry Sciences)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(5)：29-33.

The objective of the study is to establish a rapid propagation system of hybrid blueberry. The wild blueberry of Daxing’an Mountains and the cultivar of ‘Blomidon’ were selected as parents to take intervarietal crosses and the hybrid seeds. The best sterile treatment conditions for hybrid seeds were selected and the sterile seedlings were got. The effects of the concentration of ZT, the contents of source and subculture cycle on frequency of cluster buds induction were conducted by using stem segments of seedlings as explants. The influence of different types of medium and concentration of IBA on the induction of adventitious root was analyzed. The contamination rate of hybrid seeds was 0 after sterilized with 75% ethanol and 3% sodium hypochlorite for 20 s and 7 min, respectively. The best medium for cluster buds induction was WPM containing 0.6 mg·L-1ZT and 20 g·L-1source. The induction rate was up to 100% and the cluster buds grew well. During the bud induction, the optimal subculture cycle for buds proliferation was 30 d with the proliferation coefficient of 34.72. The best rooting medium was 1/2WPM containing 0.4 mg·L-1IBA, the rooting rate was 88%, and the rooting period was only 40 d. The survival rate of transplanting was more than 85%.

KeywordsBlueberry; WildבBlomidon’; Hybrid seed; Tissue culture; Rapid propagation

藍莓是杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vacciniodeae)植物的總稱，為多年生灌木或小喬木，因其果實富含抗氧化劑、花色素苷、類黃酮等與清除人體自由基和抗衰老機能密切相關的化合物，深受國內外廣大消費者的追捧，目前已躋身于世界五大健康食品行列，并有世界水果之王的美譽[1-2]。

我國野生藍莓分布廣泛，集中分布在大、小興安嶺及長白山地區(qū)，而大興安嶺野生藍莓產(chǎn)量占全國總量的70%以上，占世界總量的20%左右[3]。大興安嶺野生藍莓耐寒性極強，適合生長在有季節(jié)性積水的沼澤地和潮濕山坡，因其生長受環(huán)境影響大，因此很難馴化為栽培品種。近年來，大興安嶺引進的栽培品種‘美登’是加拿大農(nóng)業(yè)部肯特維爾研究中心從野生矮叢越桔(VacciniummytilloidesMichx)中自然選種選出的‘Augusta’，又與‘451’雜交選育出的藍莓品種，1986從美國俄勒崗州國家種質資源庫引入我國，1998年經(jīng)吉林省作物品種委員會審定并命名[4]?！赖恰瘜侔珔菜{莓，為中熟種，其生長勢強，自然坐果率達到97%，平均比野生增產(chǎn)643.6%[4]，且果實口感好，抗寒力較強，但在大興安嶺地區(qū)仍需保護才能越冬。此外，藍莓用種子繁殖萌發(fā)率低、耗時長[5]，20世紀80年代發(fā)展起來的植物組培技術不受季節(jié)限制，可以在短時間內獲得大量無菌苗，提高繁殖系數(shù)，而且可以保持品種的優(yōu)良性，在果樹育種領域得到廣泛應用。目前，國內外關于組培繁殖藍莓已有諸多報道[6-9]。

針對北方高寒地區(qū)自然環(huán)境優(yōu)越，但缺乏耐寒的優(yōu)良藍莓栽培品種這一問題，2013—2014年，東北林業(yè)大學與大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)林業(yè)科學研究院漿果研究室合作，利用野生藍莓和引進的栽培品種‘美登’進行雜交，獲得了F1種間雜交種子。由于雜交種子數(shù)量有限，為了縮短育種周期，本研究對雜種藍莓(野生ב美登’)的組培快繁技術進行了深入研究，建立了雜種藍莓組培快繁技術平臺，為藍莓種質資源創(chuàng)新和藍莓雜交新品種的培育奠定了基礎。

1材料與方法

2013—2014年，在大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)林業(yè)科學研究院藍莓試驗基地以當?shù)匾吧{莓為母本，與經(jīng)長期引種馴化的栽培品種‘美登’為父本進行人工雜交，獲得的雜交種子為基礎試驗材料，再以雜交種子經(jīng)無菌萌發(fā)得到的組培苗莖段為外植體進行組培快繁研究，組培試驗在林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)進行。

雜交種子的消毒與萌發(fā)：首先以親本種子為對照進行預試驗，用70%酒精分別處理20、40 s，再用3%的次氯酸鈉分別處理3、5、7 min、無菌水清洗3遍后分別放入小三角瓶中，密封，在25 ℃、120 r·min-1的條件下震蕩2 d再更換100 μg·g-1的赤霉素溶液浸泡1 d，最后用無菌濾紙吸干種子表面水分，分別接種于無激素添加的WPM培養(yǎng)基中，暗室培養(yǎng)，每個重復接種30粒種子，每個處理重復3次，7 d后統(tǒng)計污染率，15 d后統(tǒng)計無菌苗獲得率，并移至光下培養(yǎng)。將篩選出的最優(yōu)方案用于雜交種子的無菌處理，再以雜交種子萌發(fā)獲得的無菌苗莖段為外植體進行組培快繁研究。

激素及蔗糖質量濃度對叢生芽誘導的影響：以高達7～8 cm的無菌苗為材料，將其剪成長2～3 cm的莖段，垂直接種于含有不同質量濃度ZT(0.2、0.4、0.6、0.8 mg·L-1)和不同質量濃度蔗糖(10、20、30 g·L-1)的WPM培養(yǎng)基中誘導不定芽，添加瓊脂6.0 g·L-1，每個重復接種30個外植體，每個處理重復3次。每天觀察并記錄各處理的誘導狀態(tài)，60 d后統(tǒng)計出芽率、平均株高和增殖倍數(shù)。

繼代周期的選擇：將生長狀態(tài)相對一致的植株剪成2～3 cm長的莖段，垂直接種到添加0.6 mg·L-1ZT、20 g·L-1蔗糖的WPM培養(yǎng)基中，分別以20、25、30、35、40 d為繼代周期，每個重復接種20個外植體，每個處理重復3次，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計并記錄平均株高、增殖倍數(shù)及植株生長狀態(tài)。

組培苗的生根培養(yǎng)：將生長健壯的叢生芽分離成單株，選取生長狀態(tài)一致的植株，剪成3 cm長的莖段垂直接種到生根培養(yǎng)基中，插入深度為0.5～1.0 cm。生根培養(yǎng)基以WPM、1/2WPM為基本培養(yǎng)基，添加IBA質量濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·L-1，添加蔗糖20 g·L-1、瓊脂6.0 g·L-1、活性炭1.0 g·L-1。每個重復接種30個單株，每個處理重復3次，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計并計算生根率、平均生根數(shù)和平均株高。對生根組培苗進行煉苗和移栽，1個月后對苗木成活率進行統(tǒng)計。

培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：試驗中所用培養(yǎng)基pH值均在滅菌前用KOH調至5.4，121 ℃高壓滅菌20 min，滅菌后溫度降至60 ℃以下時添加相應的激素。若無特殊說明，各階段試驗材料均在光下培養(yǎng)，光照時長16 h·d-1，光照強度40 μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)溫度(24±1)℃。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析：污染率=(污染種子數(shù)/接種種子數(shù))×100%；

無菌苗獲得率=(獲得無菌苗數(shù)/接種種子數(shù))×100%；

出芽率=(出芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

生根率=(生根外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

增值倍數(shù)=增殖芽數(shù)/接種外植體數(shù)。

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進行方差方析，應用Duncan檢測方法進行多重比較。

2結果與分析

2.1消毒劑種類及處理時間對消毒效果的影響

最佳無菌處理條件應在保證最大程度降低材料污染率的同時，又要使其傷害降到最小。接種3 d部分雜交種子出現(xiàn)污染現(xiàn)象，且污染率隨著消毒劑處理時間的延長而下降，由表1可知，當3%次氯酸鈉處理時間延長至7 min時污染率均為0，但酒精處理時間較長會對種子造成傷害，從而降低無菌苗的萌發(fā)數(shù)量。因此，75%酒精處理20 s和3%次氯酸鈉處理7 min為最佳無菌處理組合，污染率為0，無菌苗獲得率高達95.04%。此外，由表1可以看出，在污染率為0的情況下，無菌苗獲得率仍沒有達到100%，這是由于少量種子發(fā)育不飽滿，對消毒處理最佳方式的篩選不會產(chǎn)生影響。

2.2激素、蔗糖質量濃度對叢生芽誘導的影響

無菌莖段接種到芽誘導培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7～10 d基部開始膨大產(chǎn)生少量綠色愈傷，15～18 d外植體基部產(chǎn)生少量叢生芽，且幼芽隨著培養(yǎng)時間的延長而增多。ZT對叢生芽誘導情況見表2，經(jīng)方差分析和多重比較可知，ZT質量濃度對雜種藍莓出芽率、株高和增殖倍數(shù)影響均達到顯著差異。其中出芽率隨著質量濃度的升高呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢；株高隨著質量濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；增殖倍數(shù)隨著質量濃度的升高呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，由此可見，ZT質量濃度較低時，苗生長較快，但分化數(shù)量少。當ZT質量濃度達0.6 mg·L-1時，出芽率達到100%，且叢生芽分化密集，長勢好，植株相對較高；當ZT質量濃度為0.8 mg·L-1時，出芽率仍為100%，叢生芽密集，增殖倍數(shù)高，但芽叢基部愈傷較大，植株矮小，且部分芽輕微玻璃化。由此可知，雜種藍莓增殖倍數(shù)隨著ZT質量濃度的增加而變大，但是超過一定質量濃度時，植株生長狀態(tài)變差，株高受到限制。同時，由表2可知，蔗糖質量濃度對雜種藍莓出芽率、株高和增殖倍數(shù)影響均達到差異顯著水平。在ZT質量濃度相同的情況下出芽率和株高均隨著蔗糖質量濃度的增多呈現(xiàn)上升的趨勢，而增殖倍數(shù)隨蔗糖質量濃度的增多呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當蔗糖質量濃度為20 g·L-1時增值倍數(shù)達到最高。試驗還發(fā)現(xiàn)，蔗糖作為培養(yǎng)基中碳水化合物的主要來源，其質量濃度的高低不僅對芽的增殖影響顯著，而且對植株生長狀態(tài)也有顯著影響。因此，綜合兩者對叢生芽誘導的影響，0.6 mg·L-1的ZT，20 g·L-1的蔗糖最適合雜種藍莓叢生芽誘導。

表1　消毒劑種類及處理時間對消毒效果的影響

注：表中部分數(shù)據(jù)為平均值±標準差；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表2　ZT、蔗糖質量濃度對芽誘導的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3繼代周期對叢生芽誘導的影響

培養(yǎng)基為組培苗的生長提供必須的營養(yǎng)物質，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，培養(yǎng)基內的營養(yǎng)成分會因植株的吸收而減少，因此必須選擇合適的繼代周期來保證植株處于旺盛的生長狀態(tài)。由表3可知，繼代周期對雜種藍莓株高和增殖倍數(shù)影響均顯著，二者隨著繼代周期的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。其中繼代周期為30 d時，叢生芽增殖倍數(shù)高達34.72，達到最高，分別比繼代周期為20、25、35、40 d植株的平均增殖倍數(shù)高出27.88%、15.58%、16.00%、38.94%，且叢生芽生長狀態(tài)最好。因此，雜種藍莓叢生芽誘導的最佳繼代周期為30 d，芽誘導情況見圖1。

表3　繼代周期對叢生芽的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖1　雜種藍莓叢生芽誘導

2.4培養(yǎng)基及IBA質量濃度對組培苗生根的影響

雜種藍莓無菌苗在生長素IBA的作用下，培養(yǎng)10～15 d基部開始有須根長出，經(jīng)過40 d的培養(yǎng)，經(jīng)不同質量濃度IBA處理的植株生根率均在45%以上，而不添加IBA的情況下，生根率僅達到35.28%，由此可見，IBA對雜種藍莓不定芽生根有顯著的促進作用,但不同質量濃度下生根效果也有較大差異。由表4可知，不同質量濃度IBA對雜種藍莓生根率、平均生根數(shù)和平均株高都有顯著影響，且三者在同一種培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中都隨IBA質量濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當IBA質量濃度為0.4 mg·L-1時，雜種藍莓植株在兩種培養(yǎng)基中生根率、生根條數(shù)和株高均達到最高水平，當IBA質量濃度為0.8 mg·L-1時，生根率和平均根數(shù)均明顯下降，由此可知，過高的IBA質量濃度對雜種藍莓生根起到明顯抑制作用。由表4還可看出，在IBA質量濃度相同的情況下,雜種藍莓植株在基本培養(yǎng)基1/2WPM上的生根效果明顯優(yōu)于在WPM上的，由此可知，低鹽更適合雜種藍莓生根。因此，添加0.4 mg·L-1IBA的1/2WPM培養(yǎng)基是雜種藍莓生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，生根情況見圖2。

表4　培養(yǎng)基種類及不同質量濃度IBA對生根的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2　雜種組培苗生根

2.5煉苗及移栽

生根組培苗在培養(yǎng)室內開蓋煉苗2 d后再移入溫室煉苗2 d，煉苗結束后小心將瓶苗取出，用清水洗凈附著于根部的培養(yǎng)基，不要傷根。然后將其定植于含有苔蘚的穴盤中，苗要直立，根部用基質埋實，澆透水。移栽后1～2周溫室內空氣濕度控制在80%～90%，以免苗木失水，并進行適當遮陽，避免午間強光照射。整個培養(yǎng)過程中溫室內溫度控制在24～28 ℃，栽培基質保持足夠的濕度，苗木成活率達到85%以上，移栽后幼苗長勢及根部發(fā)育狀態(tài)見圖3、圖4。

3結束語

以雜種藍莓種子為材料，通過消毒和無菌萌發(fā)獲得組培苗，并以組培苗莖段為外植體，通過對不同培養(yǎng)基、激素配比、蔗糖質量濃度及繼代周期對叢生芽誘導及生根進行研究，建立了雜種藍莓組培快繁技術體系。

圖3　移栽后的長勢

圖4　根部發(fā)育狀況

有研究表明，Anderson、WPM和MS培養(yǎng)基均適合藍莓快繁,但WPM的效果最好[10]，因此,本研究選用WPM為基本培養(yǎng)基，探究影響雜種藍莓叢生芽誘導及生根的各個因素。Billings et al.[11]研究顯示，細胞分裂素對藍莓叢生芽的誘導和增殖有顯著影響，而生長素幾乎沒有影響；有研究表明，蔗糖質量濃度對藍莓叢生芽誘導影響顯著，且不同品種最適質量濃度不盡相同[12]。在以往研究基礎上，本研究以ZT質量濃度、蔗糖質量濃度及繼代周期作為雜種藍莓叢生芽誘導的主要影響因素，試驗表明，0.6 mg·L-1的ZT和20 g·L-1的蔗糖對雜種藍莓叢生芽誘導效果最佳，誘導率達到100%，遠高于馬艷麗[13]報道的關于半高叢和矮叢越桔85.3%的再生頻率。同時，30 d的繼代周期使叢生芽增殖倍數(shù)高達34.72，與以往研究相比具有明顯優(yōu)勢[14]。

關于藍莓瓶內生根報道較多，多數(shù)報道顯示,藍莓存在生根率低、生根周期長的問題，且不同品種間所需生根條件也有一定差異[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，生長素IBA較NAA更適合藍莓組培苗生根培養(yǎng)[17-18]。因此，本研究以IBA質量濃度及培養(yǎng)種類作為雜種藍莓生根培養(yǎng)的主要影響因素，研究表明，雜種藍莓在IBA質量濃度為0.4 mg·L-1的1/2WPM培養(yǎng)基中生根效果最好，生根率高達88.19%，生根條數(shù)及苗高均達到較好水平，且生根周期僅為40 d左右。生根組培苗經(jīng)煉苗移栽到穴盤的苔蘚中，成活率達到85%以上。

本研究建立了高效的雜種藍莓(野生ב美登’)組培快繁技術體系，對雜種藍莓的保存和繁育具有重要意義。在此基礎上對獲得的藍莓雜種進行區(qū)域試驗和進一步選擇，有望為我國高寒地區(qū)藍莓新品種的培育和利用奠定堅實基礎。

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收稿日期：2015年11月25日。

第一作者簡介：甄成，女，1990年11月生，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，碩士研究生。E-mail:364598894@qq.com。通信作者：李淑娟，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學),高級工程師。E-mail:lishujuan@126.com。

1)林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)創(chuàng)新項目(2015B03)、大興安嶺行署科技局博士后項目資助(2012A02)。

責任編輯：任俐。