杜亞琳

摘要：【目的】克隆黃瓜酪氨酸硫化轉(zhuǎn)移酶基因（CsTPST），并分析植物多肽在發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用，為研究CsTPST的功能及多肽與乙烯在黃瓜發(fā)育過(guò)程中的相互作用打下基礎(chǔ)?！痉椒ā恳詳M南芥TPST蛋白序列信息為基礎(chǔ)進(jìn)行同源比對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增和生物信息學(xué)分析獲得CsTPST基因序列信息、結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，并利用qRT-PCR對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】CsTPST基因cDNA全長(zhǎng)789 bp，編碼262個(gè)氨基酸。進(jìn)化分析結(jié)果表明，CsTPST蛋白與甜瓜的TPST蛋白親緣關(guān)系最近，其氨基酸序列相似性為93%。qRT-PCR分析結(jié)果表明，CsTPST基因在黃瓜雌花、根和葉片中表達(dá)量較高，在雄花和莖中表達(dá)量較低。此外，CsTPST基因在乙烯合成促進(jìn)劑ACC處理的黃瓜葉片中上調(diào)表達(dá)，而在乙烯合成抑制劑AVG處理下呈下調(diào)表達(dá)。CsTPST基因啟動(dòng)子能激活GFP基因的表達(dá)。【結(jié)論】CsTSPT基因是一個(gè)受乙烯誘導(dǎo)表達(dá)的基因，可供開(kāi)展CsTPST基因的生物學(xué)功能及性別決定的分子機(jī)理研究參考。

關(guān)鍵詞： 黃瓜；CsTPST基因；多肽；qRT-PCR；乙烯

中圖分類號(hào)： S642.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）09-1457-06

Abstract：【Objective】The present study was conducted to clone tyrosylprotein Sulfotransferases gene in Cucumis sativus L.（CsTPST） and analyze regulatory role of plant peptides in development of C. sativus L.， in order to lay a foundation for analysis of function of CsTPST and interaction between peptide and ethylene in development of C. sativus L.【Method】Homology alignment was conducted based on TPST protein sequence in Arabidopsis thaliana. sequence， gene structure，phylogenetic relationship，and expression pattern of CsTPST were obtained through PCR amplification and bioinformatics analysis， and the expression pattern was studies through qRT-PCR. 【Result】Gene cDNA in CsTPST was 789 bp in length，and encoded a protein with 262 amino acids. Phylogenetic analysis indicated that CsTPST exhibited the highest similarity with TPST from melon，with 93% of amino acid sequence similarity. qRT-PCR analysis showed that CsTPST gene had high expression level in female flowers，roots and leaves，while it had relatively low expression level in male flowers and stems. More interestingly，CsTSPT gene expression was up-related in cucumber leaves under ACC（an ethylene synthesis promoter） treatment，while down-regulated under AVG（an ethylene synthesis inhibitor） treatment. CsTPST gene promoter could activate expression of GFP gene. 【Conclusion】The results revealed that CsTSPT is an ethylene-induced gene， which can provide reference for research on biological function and molecular mechanism of sex determination.

Key words： Cucumis sativus L.； CsTPST gene； peptide； qRT-PCR； ethylene

0 引言

【研究意義】黃瓜（Cucumis sativus L.）性型較豐富，是研究植物性別決定的模式材料，但其調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。植物多肽作為一種新型激素，對(duì)植物的多個(gè)生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程均有調(diào)控作用，但其是否調(diào)控黃瓜性別決定也尚未明確。因此，研究分析植物多肽在黃瓜發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用，對(duì)開(kāi)展植物多肽對(duì)黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用研究及利用植物多肽調(diào)控黃瓜性型具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Matsubayashi和Sakagami（1996）、Matsubayashi（2014）研究發(fā)現(xiàn)，植物硫肽激素（Phytosulfokine，PSK）以兩種形式存在，即PSK-α和PSK-β，其中，PSK-α是一種含5個(gè)氨基酸的磺化短肽Tyr（S03H）-Ile-Tyr（S03H）-Thr-Gln-0H。Matsubayashi（2011，2014）研究認(rèn)為，植物多肽（如系統(tǒng)素和PSK）參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)過(guò)程。Yamamuro等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，植物激素（如生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素和乙烯等）的相互作用可在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。PSK作為能剌激植物細(xì)胞活性的肽類信號(hào)分子存在于多種植物細(xì)胞中，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的其他調(diào)節(jié)功能也陸續(xù)被鑒定（Yamada and Sawa，2013；Matsubayashi，2014）。植物多肽通常通過(guò)復(fù)雜的翻譯后修飾過(guò)程來(lái)行使其生物學(xué)功能，酪氨酸硫化則是一種在高等動(dòng)物和植物中普遍存在的蛋白質(zhì)翻譯后修飾現(xiàn)象，此過(guò)程由酪氨酸硫化轉(zhuǎn)移酶（Tyrosylprotein sulfotransferases，TPST）所介導(dǎo)（Matsubayashi，2014）。動(dòng)物的TPST存在于各種組織和細(xì)胞中，在結(jié)構(gòu)上與植物的TPST存在較大差異（Komori et al.，2009；Matsuzaki et al.，2010）。Komori等（2009）、Matsuzaki等（2010）研究表明，植物的TPST在植物多肽激素PSK和PSY1發(fā)揮生物活性過(guò)程中尤為重要。目前，人們已從植物中鑒定出TPST基因。擬南芥AtTPST是一個(gè)定位于高爾基體的Ⅰ類跨膜蛋白，其在植物的各組織中均可表達(dá)且以在根分生組織中的表達(dá)量最高（Komori et al.，2009）。此外，AtTPST的表達(dá)受生長(zhǎng)素和BR誘導(dǎo)（Zhou et al.，2010；Hartmann et al.，2013）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】黃瓜是我國(guó)重要的蔬菜作物，植物激素在黃瓜發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，乙烯在黃瓜性別決定過(guò)程中的作用尤為重要（Fulton et al.，1995；Wu et al.，2015）。目前有關(guān)TPST介導(dǎo)植物多肽PSK調(diào)控植物發(fā)育的研究進(jìn)展較快，但人們對(duì)PSK調(diào)控黃瓜的發(fā)育進(jìn)程（如性別決定）了解較少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆黃瓜TPST基因（CsTPST），探明PSK和乙烯在黃瓜發(fā)育過(guò)程中的相互作用，為研究黃瓜發(fā)育過(guò)程中CsTPST基因的功能、植物多肽對(duì)黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用及利用植物多肽調(diào)控黃瓜性型等打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

黃瓜津優(yōu)10號(hào)購(gòu)自天津科潤(rùn)黃瓜研究所，雌性系黃瓜唐秋208購(gòu)自唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，強(qiáng)雄黃瓜材料ZL18由農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。2015年春季播種于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱。分別取幼嫩葉片、雌花、雄花、莖和根等組織，用液氮冷凍并于-80 ℃保存，用于RNA提取。

1. 2 激素處理

黃瓜植株采用MGRL營(yíng)養(yǎng)液配方進(jìn)行水培。每7 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。在3葉1心期對(duì)黃瓜幼苗葉片分別進(jìn)行乙烯合成促進(jìn)劑ACC（1 μmol/L）、乙烯合成抑制劑AVG（1 μmol/L）、IAA、GA3和CTK等激素處理，以ddH2O為對(duì)照（CK），每2 d處理1次，共處理3次，最后1次處理后3 d取材并提取RNA用于后續(xù)分析。

1. 3 RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法進(jìn)行總RNA提取，利用單逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，MBI公司）合成cDNA。

1. 4 基因組DNA提取

取黃瓜植株嫩葉，用CTAB法（Fulton et al.，1995）進(jìn)行DNA快速提取。提取的DNA加水溶解，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 5 CsTPST基因克隆

參考擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中TPST（AT1G08030）序列信息，在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.icugi.org）中比對(duì)獲取其同源基因序列Csa1M126020。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物（5'-ATGAATGCTATCTTGTGGGGCCTTC-3'和5'-TTATACCTTAACTTTAGATACTCT-3'），PCR擴(kuò)增CsTPST基因序列，并將PCR產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 6 生物信息學(xué)分析

將克隆獲得的CsTPST基因序列在NCBI中進(jìn)行BLAST同源比對(duì)分析，并將其蛋白序列與同源基因蛋白序列（擬南芥AT1G08030，甜瓜XP_008462687，麻風(fēng)樹(shù)XP_012064805，荷花XP_010253702，白楊XP_011044393）進(jìn)行同源性比對(duì)。

1. 7 qRT-PCR分析

qRT-PCR分析以β-actin基因作內(nèi)參，以經(jīng)ACC（50 μmol/L）、AVG（50 μmol/L）、IAA（50 μmol/L）、GA3（50 μmol/L）和CTK（50 μmol/L）處理的黃瓜葉片及未經(jīng)激素處理（對(duì)照，CK）的不同組織（葉片、根、雌花、雄花和莖）、不同發(fā)育階段（播種后30和50 d）的津優(yōu)10號(hào)葉片、雌性系黃瓜唐秋208和農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的強(qiáng)雄黃瓜材料ZL18莖間為材料，以CsTPST基因的cDNA序列為基礎(chǔ)，利用Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)特異引物（正向引物5'-TCTAACTGCGGAACATAAGGA-3'、反向引物5'-TCTAAGGTACTATTATTCTGA-3'）。qRT-PCR試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司的Real Master Mix SYBR Green Ⅰ，儀器為IQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀（伯樂(lè)公司）?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算，3次重復(fù)。

1. 8 啟動(dòng)子序列分析

將CsTPST基因編碼區(qū)序列在黃瓜基因組網(wǎng)站（http：//www.icugi.org/）進(jìn)行比對(duì)，獲得其在基因組上位置的信息，進(jìn)而在黃瓜基因組網(wǎng)站上獲得其上游約2000 bp的啟動(dòng)子序列，并通過(guò)啟動(dòng)子元件分析數(shù)據(jù)庫(kù)PLACE（http：//www. dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/）對(duì)CsTPST基因啟動(dòng)子序列中調(diào)控元件進(jìn)行分析。

為測(cè)試CsTPST基因啟動(dòng)子的活性，利用pGII載體上的多克隆位點(diǎn)（Sac I和BamH I），在35S啟動(dòng)子兩端設(shè)酶切位點(diǎn)，構(gòu)建帶有GFP報(bào)告基因的嵌合啟動(dòng)子載體。利用基因槍轟擊法在洋蔥表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而利用激光共聚焦對(duì)啟動(dòng)子活性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 CsTPST基因的克隆與序列分析結(jié)果

PCR擴(kuò)增及后續(xù)序列測(cè)定結(jié)果表明，CsTPST基因cDNA全長(zhǎng)789 bp，編碼262個(gè)氨基酸（圖1-A）；DNA全長(zhǎng)7561 bp。對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，CsTPST基因擁有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子（圖1-B）。進(jìn)化分析結(jié)果表明，CsTPST蛋白與甜瓜TPST蛋白的親緣關(guān)系較近，其氨基酸序列相似性為93%，而與擬南芥TPST的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其氨基酸序列相似性為45%（圖2）。

2. 2 CsTPST基因的組織表達(dá)分析結(jié)果

從圖3-A可以看出，CsTPST基因在黃瓜的根和雌花組織中相對(duì)表達(dá)量顯著高于葉片、雄花和莖（P<0.05，下同），分別為葉片中表達(dá)量的2.7和3.6倍；在莖和雄花中相對(duì)表達(dá)量顯著低于葉片，分別為葉片中表達(dá)量的47%和53%。不同發(fā)育階段及不同性型黃瓜材料基因表達(dá)分析結(jié)果表明，CsTPST基因在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段（播種后30 d）的表達(dá)量顯著高于生殖生長(zhǎng)階段（播種后50 d）；在雌性系材料中的表達(dá)量顯著高于強(qiáng)雄系（圖3-B）。植物激素與黃瓜性別關(guān)系密切，CsTPST基因在ACC處理的黃瓜葉片中上調(diào)表達(dá)量是CK的2.5倍，而在AVG處理的黃瓜葉片中下調(diào)表達(dá)量是CK的1/2。此外，CsTPST基因的表達(dá)不受IAA、GA3和CTK處理誘導(dǎo)（圖3-C），說(shuō)明CsTPST基因是一個(gè)受乙烯特定誘導(dǎo)表達(dá)的基因。

2. 3 CsTPST基因的啟動(dòng)子序列分析結(jié)果

從圖4可以看出，CsTPST基因啟動(dòng)子中包含參與乙烯和銅反應(yīng)的W-box、ERE和CuRE等元件。W-box參與了乙烯反應(yīng)因子基因ERF3在植株遭受傷害后的起始表達(dá)（Nishiuchi et al.，2004）；ERE元件介導(dǎo)了乙烯誘導(dǎo)的U3啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄起始活性（Itzhaki et al.，1994）；CuRE元件參與了銅反應(yīng)因子轉(zhuǎn)錄起始活性的調(diào)控（Kropat et al.，2005）。

為了檢測(cè)CsTPST基因啟動(dòng)子活性，本研究參考基因槍使用說(shuō)明及有關(guān)資料，對(duì)洋蔥表皮選擇轟擊條件為1100 psi×9 cm、過(guò)渡培養(yǎng)24～36 h、經(jīng)暗培養(yǎng)后在解剖鏡下觀察（圖5）。結(jié)果表明，CsTPST基因啟動(dòng)子激活了GFP基因的表達(dá)，即該基因啟動(dòng)子具有活性。

3 討論

植物多肽是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用的新型激素，目前已在植物中鑒定出多個(gè)編碼植物多肽基因（Matsubayashi，2011， 2014），其中包括調(diào)控多肽發(fā)揮活性的TPST基因（Komori et al.，2009）。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析和同源克隆技術(shù)，從黃瓜葉片克隆得到CsTPST基因，并對(duì)其序列和表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，CsTPST基因是一個(gè)乙烯誘導(dǎo)表達(dá)基因，與Wu等（2015）的研究結(jié)果相似。Wu等（2015）研究表明，PSK在乙烯生物合成途徑中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。隨著植物體內(nèi)乙烯含量的增加，為了保證植株正常生長(zhǎng)發(fā)育，可能需要產(chǎn)生更多的活性PSK，進(jìn)而對(duì)乙烯反應(yīng)產(chǎn)生調(diào)控作用，而TPST基因的硫基化翻譯后修飾是PSK發(fā)揮生物活性的前提，其表達(dá)受到乙烯的上調(diào)調(diào)控。也有研究結(jié)果表明，TPST和PSK與植物激素間有著密切的相互作用，如擬南芥TPST的表達(dá)會(huì)受到IAA處理的誘導(dǎo)（Zhou et al.，2010），BR對(duì)植物多肽PSK具有調(diào)節(jié)作用（Hartmann et al.，2013）。植物激素（尤其是乙烯）在黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

由于性型分化的多樣性，黃瓜可作為研究植物性型分化的一個(gè)模式材料。目前已克隆獲得的黃瓜雌性F基因（CsACS1G）和單性花決定M基因（CsACS2）均為乙烯合成酶基因（Mibus and Tatlioglu，2004；Li et al.，2009）。黃瓜是典型的利用雌性系進(jìn)行雜交一代制種的園藝作物，對(duì)其性別決定及性型調(diào)控的分子機(jī)理進(jìn)行研究將有助于精確控制黃瓜性型。本研究結(jié)果表明，CsTPST基因受到乙烯的誘導(dǎo)表達(dá)，暗示CsTPST或植物多肽PSK與乙烯生物合成有相互作用，可能也在黃瓜性別決定過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。這為深入研究CsTPST基因的生物學(xué)功能及黃瓜性別決定的分子機(jī)理提供了新思路。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，CsTSPT基因是一個(gè)受乙烯誘導(dǎo)表達(dá)的基因，可供開(kāi)展CsTPST基因的生物學(xué)功能及性別決定的分子機(jī)理研究參考。

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（責(zé)任編輯 思利華）