林珊宇 賢小勇 顏梅新 朱桂寧

摘要：【目的】分析廣西甘蔗主產(chǎn)區(qū)甘蔗鞭黑粉菌遺傳多樣性水平，為研究病菌毒力變化及甘蔗病害綜合治理提供新思路?！痉椒ā繌膹V西各甘蔗主要產(chǎn)區(qū)采集甘蔗鞭黑粉菌樣品，提取其中70份單倍體菌株基因組DNA，使用優(yōu)化的隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）反應(yīng)體系和經(jīng)篩選獲得的RAPD引物進行PCR擴增，電泳譜帶使用NTSYS 2.1進行聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。【結(jié)果】使用篩選出的10個RAPD引物進行擴增，獲得77條條帶，每個引物擴增得到的條帶數(shù)為4～11條，大小為150～3000 bp，包含6個多態(tài)性位點，群體多態(tài)位點百分率為7.79%。70個甘蔗鞭黑粉菌的相似系數(shù)為0.96～1.00，在0.96的遺傳系數(shù)上菌株可分為兩大類，其中類群1聚集了來自橫縣校椅鎮(zhèn)的兩個菌株，其余68個菌株分布在類群Ⅱ中?！窘Y(jié)論】廣西甘蔗鞭黑粉菌遺傳分化度較低，片段多態(tài)性和菌株地理來源、寄主和交配型無顯著相關(guān)性。

關(guān)鍵詞： 甘蔗鞭黑粉菌；RAPD；遺傳多樣性；廣西

中圖分類號： S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）09-1506-06

Abstract：【Objective】Genetic diversity of Sporisorium scitamineam from main sugarcane growing area of Guangxi was studied， in order to provide new ideas for comprehensive control of sugarcane smut. 【Method】S. scitamineam was collected from main sugarcane growing areas of Guangxi， and genomic DNA were extracted from 70 haploid strains. Optimized random amplified polymorphic DNA（RAPD） reaction system and 10 RAPD primers screened deliberately were used to detect polymorphism of S. scitamineam by PCR amplification. Then， according to electrophoretogram， Cluster analysis was conducted to construct phylogenic tree with NTSYS2.1 software. 【Result】The results showed that， 10 RAPD primer pair could amplify 4-11 bands each， with a total of 77 bands， each band ranged from 150 to 3000 bp in length， but only 6 polymorphic sites were detected， which accounted for a polymorphic ratio of 7.79% in population. The genetic similarity coefficient of 70 S. scitamineam strains ranged from 0.96 to 1.00， and those strains were clustered into 2 clusters at genetic similarity level of 0.96， the first cluster was comprised of 2 strains collected from Xiaoyi town of Hengxian county， while the remaining 68 stains were clustered into the second cluster. 【Conclusion】S. scitamineam is at low level of genetic differentiation in Guangxi. Polymorphism of S. scitamineam had no significant correlation with its geographical origin， hosts and mating types.

Key words： Sporisorium scitamineam； RAPD； genetic diversity； Guangxi

0 引言

【研究意義】甘蔗是我國主要的糖料作物，廣西是我國甘蔗主要產(chǎn)區(qū)。擔(dān)子菌門甘蔗鞭黑粉菌能引起甘蔗鞭黑穗病，病原菌侵染甘蔗生長點后，病株抽出覆蓋黑色粉狀厚垣孢子的黑穗，不僅造成甘蔗產(chǎn)量損失，還使蔗糖糖分降低，影響品質(zhì)。1877年該病害在南非納塔爾首次被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過數(shù)十年傳入中國后逐步蔓延，特別是近20年來由于蔗區(qū)布局調(diào)整，甘蔗種植以旱地為主，品種選育重高產(chǎn)輕抗病，導(dǎo)致甘蔗鞭黑穗病由次要病害上升為主要病害，在我國各蔗區(qū)頻繁發(fā)生，華南的廣東、廣西、福建已成為該病的常發(fā)區(qū)（沈萬寬，2004；王伯輝，2007）。據(jù)韋昌聯(lián)（2012）報道，廣西甘蔗主栽品種新臺糖22號的甘蔗鞭黑穗病平均發(fā)病率為18%，宿根蔗高達(dá)50%，甘蔗鞭黑穗病發(fā)生日趨嚴(yán)重。生產(chǎn)實際中，選育和引進抗鞭黑穗病新品種是控制該病的有效措施，但目前選育推廣的高產(chǎn)高糖甘蔗品種多數(shù)不抗鞭黑穗病，也有些從國外引進的抗病品種經(jīng)抗性鑒定但結(jié)果與預(yù)期相反（沈萬寬等，2014a，2014b），原因可能是有些病原菌基因型能夠與特定寄主基因型相互作用導(dǎo)致寄主抗性在短時間內(nèi)喪失（Brown，1995）。因此，從遺傳機制水平研究植物致病病原菌群體遺傳變異對抗性育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來分子技術(shù)發(fā)展迅速，并在真菌群體結(jié)構(gòu)及物種間親緣關(guān)系方面得到應(yīng)用，甘蔗鞭黑粉菌種屬的劃分也從DNA層面得到探討。Piepenbring等（2002）對黑粉菌屬（Ustilago）的其中3個種——玉米黑粉菌（Ustilago maydis）、甘蔗鞭黑粉菌（Ustilago scitaminea Syd.）和茭白黑粉菌（Ustilago esculenta）的孢子堆特征、冬孢子壁超微結(jié)構(gòu)及rDNA等系統(tǒng)發(fā)育因素進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘蔗鞭黑粉菌無論在形態(tài)上還是在rDNA的同源性上均與Sporisorium屬有較高的相似性，因而將其學(xué)名更改為Sporisorium scitamineum。甘蔗鞭黑粉菌生理小種的分化也被多個甘蔗種植國或地區(qū)報道（Gillaspie et al.，1983；Lee et al.，1999；Grisham，2001）。2001年由美國、印度、澳大利亞、巴西和中國臺灣聯(lián)合采用11個甘蔗品種作為鑒別寄主對10個國家的甘蔗鞭黑粉菌進行小種普查，結(jié)果顯示僅我國臺灣有3個生理小種，其余均為2個生理小種（Hsieh and Lee，1978）。目前，研究病原菌種內(nèi)不同來源群體遺傳多樣性常用的方法為隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）分析技術(shù)，該技術(shù)可將病原菌種群的遺傳變異進行描述和量化，且具有高效、穩(wěn)定的優(yōu)點（Baysal et al.，2010；Gupta et al.，2010）。國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者應(yīng)用RAPD和其他相關(guān)手段研究了甘蔗鞭黑粉菌遺傳多樣性特征，但是得到的結(jié)論尚不統(tǒng)一。國外有些學(xué)者認(rèn)為甘蔗鞭黑粉菌親緣關(guān)系較緊密（Singh et al.，2005）；陳健文等（2012）利用SSR標(biāo)記分析了30個來自廣東省甘蔗主產(chǎn)區(qū)的甘蔗黑穗病菌菌株的遺傳多樣性，結(jié)果表明廣東蔗區(qū)甘蔗鞭黑粉菌分子遺傳多樣性屬中等水平；Xu等（2004）和Shen等（2012）則認(rèn)為華南地區(qū)甘蔗鞭黑粉菌的遺傳變異相對豐富，但不存在地理來源和寄主來源共分化現(xiàn)象?！颈狙芯壳腥朦c】目前，我國甘蔗鞭黑粉菌遺傳分化的相關(guān)資料較少，尤其是使用RAPD標(biāo)記對廣西菌株遺傳多樣性的研究尚無文獻(xiàn)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用RAPD標(biāo)記分析廣西甘蔗主產(chǎn)區(qū)甘蔗鞭黑粉菌遺傳多樣性水平，了解廣西甘蔗鞭黑粉菌病原群體的變異情況，為研究病菌毒力變化及甘蔗病害綜合治理提供新思路。

1 材料與方法

1. 1 供試菌株

供試菌株為從廣西各甘蔗主要種植地采集甘蔗鞭黑穗病標(biāo)樣分離所得的單倍體菌株，每個標(biāo)樣1對，并分別與已知交配型的標(biāo)準(zhǔn)菌株JG35（“-”交配型）和JG36（“+”交配型）進行配合后確定其交配型。采集地包括南寧、武宣、宜州、隆安、扶綏、貴港、龍州、橫縣和柳州等9個市（縣）（表1）。參照陳建文等（2012）的方法，經(jīng)分離獲得70個（35對）鞭黑粉菌單孢菌株。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌株基因組DNA提取 參照沈萬寬等（2006）的方法，并稍作改進。挑取不同交配型菌株單菌落于28 ℃下200 r/min擴大培養(yǎng)1～2 d，取菌液2.0 mL，于6000 r/min離心5 min，棄上清液，用液氮充分研磨后置于2.0 mL EP管中，加入900 μL含2% CTAB抽提緩沖液，65 ℃水浴1～2 h，期間不時搖勻，加入900 μL酚/氯仿（1∶1）劇烈振蕩30 s，12000 r/min離心10 min，取上清液置于新的2.0 mL離心管中，加入等體積氯仿緩慢顛倒混勻，12000 r/min離心10 min，取上清液置于新的1.5 mL離心管中，加入1/10體積5 mol/L NaCl和等體積冷異丙醇，混勻后置-20 ℃冰箱中20～30 min，4 ℃下12000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀分別用冷70%乙醇和冷無水乙醇各洗1次，室溫下風(fēng)干，溶于雙蒸水中，用紫外分光光度計在260和280 nm下測定OD，檢測DNA的質(zhì)量和濃度，并稀釋至30 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 RAPD反應(yīng)體系 經(jīng)過優(yōu)化，RAPD-PCR反應(yīng)體系為20.00 μL，其中包括：10×PCR Buffer 2.00 μL，25 mmol/L MgCl2 1.32 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.20 μL，0.1 mmol/L引物0.50 μL，5 U Taq酶0.60 μL，30 ng/μL模板DNA 1.00 μL，ddH2O 13.38 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，37 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1.5 min，進行40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后取5.00 μL擴增產(chǎn)物于1.8%瓊脂糖凝膠中電泳60 min（90 V），在凝膠成像系統(tǒng)上檢測并拍攝保存。

1. 2. 3 遺傳多樣性分析 從80條RAPD引物中篩選出若干條擴增條帶清晰、穩(wěn)定性高的引物用于樣本擴增。對電泳譜帶進行記錄，在相應(yīng)位點處有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，將0/1矩陣輸入計算機。使用NTSYS 2.1對結(jié)果進行分析，建立系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 引物篩選及隨機擴增產(chǎn)物分析結(jié)果

從80條RAPD隨機引物中篩選得到10條穩(wěn)定性高、譜帶清晰的引物對70個單倍體菌株的基因組進行PCR擴增，供試引物共擴增出77條譜帶，不同引物擴增產(chǎn)物譜帶數(shù)為4～11條，條帶大小為150～3000 bp（圖1）。擴增圖譜具有一定多態(tài)性的引物有5個，分別為S17、S39、S130、S143和S172，產(chǎn)生多態(tài)性位點6個，即群體多態(tài)位點百分率為7.79%，多態(tài)性比例偏低，說明供試菌株表現(xiàn)出一定的遺傳變異，但遺傳差異不明顯。對擴增出的77條譜帶進行統(tǒng)計和分析，得到供試菌株的聚類樹狀圖（圖2），從圖2可看出70個甘蔗鞭黑粉菌的相似系數(shù)在0.96～1.00。在0.96的遺傳系數(shù)處，70個菌株可分為兩大類，橫縣校椅鎮(zhèn)的兩個菌株HX115和HX116經(jīng)引物S39、S143和S172擴增的產(chǎn)物缺失3條主帶，構(gòu)成類群Ⅰ，其余68個來自南寧、武宣、宜州、隆安、扶綏、貴港、橫縣、龍州和柳州的菌株聚集在類群Ⅱ。在約0.971的遺傳系數(shù)上，類群Ⅱ中的68個菌株又可分為兩個亞類，一個亞類只包含來自橫縣良圻的兩個菌株HX185和HX186，另一個亞類包含由其余66個菌株構(gòu)成的若干生理小類。聚類分析結(jié)果表明，3對來自橫縣的菌株分布在不同的大類和亞類中，暗示它們具有相對豐富的遺傳多態(tài)性。此外，只有一對菌株NN285和NN286擴增出的條帶不一致而被分為不同的類群，其他成對的菌株擴增獲得的譜帶均分別相同。

2. 2 “+”、“-”擔(dān)孢子遺傳差異分析結(jié)果

為研究甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”交配型單倍體擔(dān)孢子遺傳差異，對異型的擔(dān)孢子進行分子標(biāo)記，使用80條RAPD隨機引物對1對標(biāo)準(zhǔn)菌株JG35（“-”交配型）和JG36（“+”交配型）的擔(dān)孢子基因組DNA進行擴增，每條RAPD引物能擴增出1～12條譜帶，片段大小為150～3000 bp，獲得了大量DNA指紋圖譜。結(jié)果顯示所使用的80條RAPD隨機引物對JG35和JG36的基因組DNA擴增得到的指紋圖譜一致，譜型無差異。

3 討論

RAPD標(biāo)記技術(shù)是以RAPD引物對供試菌株基因組進行PCR擴增，根據(jù)DNA條帶的位置相似程度進行聚類，將菌株劃分成不同的遺傳群體，以此對真菌群體的遺傳多樣性進行描述。該技術(shù)是以種群核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反應(yīng)，不受目標(biāo)性狀表達(dá)的影響，是一種十分有效和可靠的親緣關(guān)系鑒定方法（Williams et al.，1990）。

本研究使用80條RAPD引物對1對標(biāo)準(zhǔn)甘蔗鞭黑粉菌單倍體JG35和JG36基因組DNA進行擴增，擴增產(chǎn)物電泳得到條帶數(shù)為1～12條，條帶大小為150～3000 bp，表明指紋標(biāo)記數(shù)量較豐富，序列大小與Shen等（2012）使用RAPD標(biāo)記中國西南甘蔗鞭黑粉菌結(jié)果一致，但電泳條帶數(shù)略有上升，可能是選擇的材料和RAPD引物不同所致。

在引物篩選過程中發(fā)現(xiàn)80條RAPD隨機引物對JG35和JG36的基因組DNA擴增得到的指紋圖譜一致，譜型無差異，35對菌株經(jīng)過10條篩選出的RAPD引物擴增，只有1對菌株的“-”交配型（NN285）比“+”交配型（NN286）少擴增出1個位點，其他34對菌株間具有相同的DNA指紋圖譜，說明NN285和NN286兩型擔(dān)孢子的序列差異是由偶然的變異引起；也表明僅靠覆蓋范圍有限的RAPD分子標(biāo)記來區(qū)分“+”、“-”交配型會顯得力度不夠，未能達(dá)到鑒別異種交配型菌株的目的。RAPD標(biāo)記技術(shù)還常用于區(qū)分和標(biāo)記病原菌中的不同生理小種，雖然對于甘蔗鞭黑粉菌具有不同生理小種已有報道（許莉萍和陳如凱，2000），但廣西甘蔗鞭黑粉菌小種類型多數(shù)為小種1，雖然也可能存在小種2，但極為有限。本實驗室對小種2的采集和鑒定工作仍未完成，因此尚無法斷言RAPD譜帶的差異是因不同小種引起。

綜合分析10個引物對廣西不同蔗區(qū)甘蔗鞭黑粉菌的擴增圖譜，進一步研究菌株間的相似性系數(shù)，全部菌株的相似性系數(shù)為0.96～1.00，反映了甘蔗鞭黑粉菌菌株間的遺傳多樣性較低的特點。聚類分析結(jié)果顯示，來源于同一甘蔗品種或地點的甘蔗鞭黑粉菌并未完全聚在同一類群中，說明寄主和地理的變化對甘蔗鞭黑粉菌進化影響較小。此結(jié)論與部分學(xué)者的研究結(jié)果契合：Braithwaite等（2004）、Singh等（2005）、Raboin等（2007）分別應(yīng)用AFLP、RAPD和SSR技術(shù)對采自不同大洲和國家甘蔗種植區(qū)及美國、毛里求斯、南非同一蔗區(qū)時隔16年采集的甘蔗鞭黑粉菌株進行分析，結(jié)果表明，全部美洲群體和非洲群體株系屬于一個單一的譜系，地理和時間的變化與甘蔗鞭黑粉菌的進化具有較低的協(xié)同性。部分區(qū)域分離到的菌株很少變異，預(yù)示甘蔗鞭黑粉菌基因組上很小的變異甚至單個基因的突變就能引起表型變化，經(jīng)過足夠時間形成了廣泛適應(yīng)寄主的表現(xiàn)型。

甘蔗鞭黑穗病自19世紀(jì)在南非納塔爾的“中國種”甘蔗品種上首先發(fā)現(xiàn)以來，已給除幾內(nèi)亞以外的所有植蔗國或地區(qū)帶來危害（Presley，1978）。抗病品種的選育是對抗甘蔗鞭黑粉菌的重要策略，甘蔗抗病育種的前瞻性在于研究甘蔗鞭黑穗病菌群體遺傳多樣性水平，探明中國甘蔗鞭黑穗病菌主要遺傳類群和致病力分化類型。本研究供試菌株來自我國甘蔗主產(chǎn)區(qū)廣西，寄主為廣西甘蔗當(dāng)家品種新臺糖22號和近年來推廣的其他品系，樣本選擇具有一定的代表性，研究結(jié)果是對我國甘蔗鞭黑粉菌遺傳多樣性研究的補充和完善。但當(dāng)前的研究尚需進一步深入，因此今后的思路在于開展甘蔗鞭黑粉菌遺傳多樣性和小種分化及致病力關(guān)系的研究，以期為甘蔗抗鞭黑穗病育種提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

廣西甘蔗鞭黑粉菌遺傳分化度較低，RAPD多態(tài)性和菌株地理來源、寄主和交配型無顯著相關(guān)性，該研究結(jié)果對廣西甘蔗育種和產(chǎn)業(yè)布局具有指導(dǎo)意義。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）