趙巖 吳俊偉 孟森 王燕 吳昊 趙金良

摘要：【目的】了解碳酸鹽堿度對羅非魚的毒性及其相應(yīng)耐受機(jī)制，為耐鹽堿羅非魚育種及生產(chǎn)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)?！痉椒ā繉⒛崃_羅非魚從淡水直接轉(zhuǎn)入4個碳酸鹽堿度處理（4.0、6.0、8.0和10.0 g/L NaHCO3）中進(jìn)行急性脅迫試驗，利用pH計、紫外分光光度計及熒光定量PCR，分別檢測脅迫0.5、1.0、4.0、6.0、9.0、12.0、18.0、24.0、36.0和48.0 h的羅非魚血清pH、游離氨濃度及腎組織中碳酸酐酶（CA）和谷氨酰胺合成酶（GS）基因的相對表達(dá)量?！窘Y(jié)果】在各碳酸鹽堿度處理組中，脅迫1.0 h后羅非魚的血清pH、游離氨濃度均發(fā)生顯著變化（P<0.05）。經(jīng)4.0和6.0 g/L碳酸鹽堿度脅迫48.0 h后未出現(xiàn)死魚現(xiàn)象，其血清pH、游離氨濃度及CA基因、GS基因的表達(dá)量均呈先升高再降低的變化趨勢；經(jīng)8.0 g/L碳酸鹽堿度脅迫9.0 h后陸續(xù)出現(xiàn)死魚現(xiàn)象，血清pH高達(dá)8.11、游離氨濃度為486.28 μmol/L，至脅迫12.0 h后羅非魚全部死亡；經(jīng)10.0 g/L碳酸鹽堿度脅迫出現(xiàn)死魚的時間明顯早于8.0 g/L碳酸鹽堿度脅迫，脅迫1.0 h后其血清pH達(dá)8.14、游離氨濃度為365.89 μmol/L，脅迫4.0 h后羅非魚全部死亡。【結(jié)論】尼羅羅非魚能耐受的血清pH上限在8.10附近，耐受的游離氨濃度為525.66 μmol/L。在低碳酸鹽堿度（小于6.0 g/L）脅迫下，尼羅羅非魚可通過生理調(diào)控血清pH和游離氨濃度而適應(yīng)脅迫逆境，且CA和GS參與了相應(yīng)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)及氨氮代謝。

關(guān)鍵詞： 尼羅羅非魚；碳酸鹽堿度；血清pH；游離氨；CA基因；GS基因

中圖分類號： S965.125 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）06-1032-07

0 引言

【研究意義】我國約有3067萬ha鹽堿水域，但由于碳酸鹽堿度和pH較高，大多數(shù)鹽堿水域水體中的生物資源較貧瘠，基本處于閑置狀態(tài)（么宗利等，2010）。近年來，上海海洋大學(xué)以尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）為對象，用氯化鈉、碳酸鹽等自制鹽堿性水體開展耐鹽堿羅非魚新品種選育工作（趙麗慧等，2013），同時開展魚類鹽堿脅迫應(yīng)答及高鹽堿耐受機(jī)制研究（趙麗慧等，2014b），以期選育出適合鹽堿水域的養(yǎng)殖品種，有效利用鹽堿水資源發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)，這對破解某些地區(qū)長期制約漁業(yè)發(fā)展的難題，實(shí)現(xiàn)當(dāng)?shù)厣a(chǎn)與生態(tài)相互協(xié)調(diào)、漁業(yè)轉(zhuǎn)型升級具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，有關(guān)碳酸鹽堿度對魚類毒性及相應(yīng)耐受性的研究較多，包括碳酸鹽堿度脅迫后鯉、鰱、鳙、草魚、尼羅羅非魚（雷衍之等，1985）、彭澤鯽（鄭偉剛等，2004）、青鳉（Yao et al.，2010）、大鱗鲃（徐偉等，2011）和達(dá)里湖鯽（周偉江等，2013）的存活能力均有報道，發(fā)現(xiàn)多數(shù)魚類在碳酸鹽堿脅迫后會出現(xiàn)異常的行為及形態(tài)特征，如急游沖撞、迅速翻白上浮、體表分泌大量黏液、鰓部出血、快速死亡，死亡魚的頭部發(fā)黑、體表泛青色、鰓片暗紅或紫褐色，且部分魚的腹部膨大或胸部呈微黃色等（雷衍之等，1985；章征忠等，1999）。為了應(yīng)對鹽堿脅迫，魚類會通過啟動信號傳導(dǎo)、酸堿平衡、滲透壓、代謝、呼吸和免疫等調(diào)控機(jī)制，在一定范圍內(nèi)維持機(jī)體的生理平衡，但這個生理過程會消耗能量，且涉及眾多基因的相互作用（郭雯翡等，2012；Yao et al.，2012）。劉濟(jì)源等（2012）在對青海湖裸鯉進(jìn)行碳酸鹽堿度脅迫的研究中，發(fā)現(xiàn)青海湖裸鯉血漿滲透壓和Na+、Cl-、Ca2+離子濃度在碳酸鹽堿度脅迫96 h內(nèi)未出現(xiàn)顯著變化；郭雯翡等（2012）研究鹽堿脅迫下青海湖裸鯉鰓基因表達(dá)的差異情況，結(jié)果表明，高鹽堿脅迫會改變魚類的滲透壓和酸堿平衡，對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一定的抑制作用，即魚類通過增強(qiáng)離子調(diào)控、提高血清尿素氮濃度、合成應(yīng)激蛋白等生理活動來維持滲透壓和酸堿平衡，緩解應(yīng)激反應(yīng)；王卓等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，在碳酸鹽堿度脅迫下青海湖裸鯉的SOD、ACP和AKP活性均在發(fā)生顯著變化后又快速恢復(fù)到初始水平?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】尼羅羅非魚是世界性的淡水養(yǎng)殖魚類，對碳酸鹽堿度的耐受性較一般養(yǎng)殖魚類高（史為良，1981），在碳酸鹽堿度41.6 mmol/L、pH 9.42的水體中仍可存活（雷衍之等，1985），但至今尚未明確碳酸鹽堿度脅迫對尼羅羅非魚體內(nèi)血清pH和游離氨濃度的影響，在其他魚類上也未見相關(guān)的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對尼羅羅非魚進(jìn)行碳酸鹽堿度脅迫后測定其體內(nèi)血清pH、游離氨濃度及腎組織碳酸酐酶（Carbonic anhydrase，CA）和谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）基因的相對表達(dá)量，以期從生理生化角度揭示碳酸鹽堿度對羅非魚的毒性及其相應(yīng)的耐受機(jī)制，為耐鹽堿羅非魚育種及生產(chǎn)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

尼羅羅非魚于2014年10月取自上海海洋大學(xué)羅非魚種質(zhì)資源試驗站，淡水飼養(yǎng)于上海海洋大學(xué)養(yǎng)殖中心控溫循環(huán)水族箱中，水溫（25.3±0.8）℃，光照條件為室內(nèi)自然光，每天定時投食2次，及時清理糞便和殘余餌料。選取體質(zhì)健康、規(guī)格均勻（平均體重82.2±5.4 g）的個體進(jìn)行急性脅迫試驗。試驗用鹽堿水體均提前配置，并根據(jù)水族箱體積計算所需NaHCO3（分析純），將相應(yīng)NaHCO3加入到完全曝氣的自來水中，均勻攪拌，連續(xù)充氧48 h，待其穩(wěn)定后使用。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 試驗設(shè)計 設(shè)4個碳酸鹽堿度處理組（處理1～4），對應(yīng)的NaHCO3濃度分別為4.0、6.0、8.0和10.0 g/L，以充分曝氣的自來水為對照組（CK）。其中，處理1（4.0 g/L NaHCO3）中溶解氧7.2 mg/L、氨氮0.43 mg/L、pH 8.90；處理2（6.0 g/L NaHCO3）中溶解氧7.4 mg/L、氨氮0.42 mg/L、pH 9.09；處理3（8.0 g/L NaHCO3）中溶解氧7.3 mg/L、氨氮0.46 mg/L、pH 9.10；處理4（10.0 g/L NaHCO3）中溶解氧7.2 mg/L、氨氮0.43 mg/L、pH 9.20。試驗前1 d開始禁食，試驗過程中不投放餌料。將試驗魚從淡水中撈出，直接放入各碳酸鹽堿度處理組中，每組35尾魚，設(shè)3個重復(fù)。

1. 2. 2 血樣采集 試驗開始后每隔24 h全部換水1次，保持水體理化指標(biāo)相對穩(wěn)定，連續(xù)充氧，在堿脅迫后0.5、1.0、4.0、6.0、9.0、12.0、18.0、24.0、36.0和48.0 h分別采樣，每個重復(fù)隨機(jī)取3尾。采用一次性無菌注射器從魚尾靜脈處抽血，每尾魚抽血時間不超過5 min，血樣注入抗凝劑處理的1.5 mL離心管中，室溫放置0.5 h后5000 r/min離心10 min，取上層血清。

1. 2. 3 血清pH測定 采用FE20-FiveEasy PlusTM pH計測定血清pH。將分離獲得的血清轉(zhuǎn)移到自制柱狀容器（內(nèi)徑1.5 cm，保證血清可浸沒探頭）中測定，同一樣本測定3次，取其平均值。測定前校準(zhǔn)儀器，在每次測量結(jié)束后用蒸餾水充分潤洗探頭且用吸水紙吸干再進(jìn)行下次測量。

1. 2. 4 血清游離氨濃度測定 采用南京建成生化技術(shù)有限公司生產(chǎn)的血氨測試盒（無蛋白濾液法）測量血氨（游離氨）含量。在血清中立刻加入定量或過量的鎢酸鈉和硫酸溶液，使蛋白質(zhì)沉淀，在此過程中血清中的氨和硫酸反應(yīng)生成硫酸銨而存在于上清液中，過濾后以酚—次氯酸顯色，置于波長630 nm處測定吸光值（劉福和曾芝蘭，2007）。

1. 2. 5 腎組織CA基因和GS基因mRNA表達(dá)檢測 參照GenBank中尼羅羅非魚β-actin序列（EU887951）、CA-4（XM_003460 163）、GS（XM_003444304.2）cDNA序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成引物。熒光定量PCR具體操作步驟參照趙麗慧等（2014b）的方法。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，包括單因素方差分析及Duncans多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 碳酸鹽堿度脅迫對尼羅羅非魚的毒性

試驗羅非魚在CK組中無應(yīng)激現(xiàn)象，游動平緩，水質(zhì)清潔無泡沫。處理1和處理2中的羅非魚在放入初期表現(xiàn)為快速游動、呼吸加快，之后逐漸減緩，脅迫過程中未出現(xiàn)死魚現(xiàn)象；而處理3和處理4陸續(xù)出現(xiàn)死魚，且處理4脅迫過程中出現(xiàn)死魚的時間明顯早于處理3，具體臨床癥狀表現(xiàn)為：羅非魚焦躁不安，沿著水槽邊緣狂游，隨后身體失去平衡，側(cè)翻或倒游；體表和鰓部附有大量黏液，部分魚身體扭曲，以尾部最明顯；死后羅非魚眼部凸起發(fā)黑，體表泛青黑色（圖1）。

2. 2 碳酸鹽堿度脅迫對尼羅羅非魚血清pH的影響

正常水溫（25 ℃）條件下，CK組羅非魚血清pH較穩(wěn)定，維持在7.69～7.75（表2）。在各碳酸鹽堿度處理組中，脅迫1.0 h后羅非魚血清pH均發(fā)生顯著變化（P<

0.05，下同）。處理1和處理2的羅非魚血清pH呈先升高后降低的變化趨勢，分別于脅迫9.0和12.0 h時達(dá)到各自的峰值（7.97和8.03），脅迫48.0 h后，血清pH明顯高于CK組。處理3的羅非魚在脅迫9.0 h后，其血清pH為8.11，之后陸續(xù)出現(xiàn)死魚，至脅迫12.0 h后全部死亡而無法取樣測定；處理4的羅非魚則在脅迫4.0 h后全部死亡，無法取樣測定。

2. 3 碳酸鹽堿度脅迫對尼羅羅非魚血清游離氨濃度的影響

由表3可知，CK組羅非魚血清游離氨濃度維持在170.73～178.51 μmol/L。在各碳酸鹽堿度處理組中，脅迫1.0 h后羅非魚血清游離氨濃度均發(fā)生顯著變化。處理1和處理2的羅非魚血清游離氨濃度呈先升高后降低的變化趨勢，均在脅迫12.0 h后達(dá)到各自的峰值（490.01和525.66 μmol/L），脅迫48.0 h后游離氨濃度仍明顯高于CK組。處理3的羅非魚在脅迫9.0 h后，其血清游離氨濃度為486.28 μmol/L，之后陸續(xù)出現(xiàn)死魚，至脅迫12.0 h后羅非魚全部死亡；處理4出現(xiàn)死魚的時間明顯早于處理3，在脅迫4.0 h后羅非魚全部死亡。

2. 4 碳酸鹽堿度脅迫對尼羅羅非魚腎組織中CA基因表達(dá)的影響

由圖2可以看出，經(jīng)4.0和6.0 g/L NaHCO3脅迫處理后，尼羅羅非魚腎組織中CA基因表達(dá)量呈先增加后減少的變化趨勢，均在脅迫12.0 h后達(dá)到峰值。說明經(jīng)急性碳酸鹽堿度脅迫后，CA基因參與相應(yīng)的應(yīng)答調(diào)控過程（離子轉(zhuǎn)運(yùn)），且經(jīng)過一段時間后羅非魚自身逐步適應(yīng)脅迫環(huán)境，體內(nèi)達(dá)到新的平衡點(diǎn)。

2. 5 碳酸鹽堿度脅迫對尼羅羅非魚腎組織中GS基因表達(dá)的影響

由圖3可以看出，經(jīng)4.0和6.0 g/L NaHCO3脅迫處理后，尼羅羅非魚腎組織中GS基因表達(dá)量也呈先增加后減少的變化趨勢，均在脅迫12.0 h后達(dá)到峰值。說明經(jīng)急性碳酸鹽堿度脅迫后，GS基因參與相應(yīng)的應(yīng)答調(diào)控過程（氨氮代謝），且經(jīng)過一段時間后羅非魚自身逐步適應(yīng)脅迫環(huán)境，體內(nèi)達(dá)到新的平衡。

3 討論

堿度是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要水質(zhì)指標(biāo)，通常是指水體中能與酸發(fā)生中和作用的物質(zhì)總量，即總堿度反映了水體對pH的緩沖能力。一般認(rèn)為，養(yǎng)殖水體堿度不宜過低，但堿度過高對水產(chǎn)動物的毒性作用同樣不可忽視，尤其是堿度和pH均較高時（雷衍之等，1985）。堿脅迫對魚類的毒性作用復(fù)雜，涉及到總堿度與pH的協(xié)同毒性作用（Wilkie and Wood，1996；Parra and Baldisserotto，2007），包括：（1）OH-、HCO3-和 CO32-等離子直接作用于魚類的鰓表面上皮細(xì)胞，而對鰓造成器質(zhì)性傷害；（2）血液HCO3-濃度升高使得pH上升，破壞體內(nèi)酸堿平衡，導(dǎo)致堿中毒；（3）血液pH升高導(dǎo)致H+濃度降低，從而致使代謝產(chǎn)生的NH3無法與H+結(jié)合形成NH4+排出體外，導(dǎo)致氨中毒。本研究中，尼羅羅非魚血清pH和游離氨濃度在碳酸鹽堿度脅迫后，首先呈上升趨勢且明顯高于CK組，說明碳酸鹽堿度對尼羅羅非魚的生理狀態(tài)已產(chǎn)生影響，也進(jìn)一步驗證游離氨濃度會隨血清pH升高而升高的觀點(diǎn)，即碳酸鹽堿度脅迫過程中出現(xiàn)死魚是因體內(nèi)血清pH和游離氨濃度共同升高的結(jié)果。

魚類應(yīng)對堿脅迫過程中的堿中毒主要是通過以下幾種途徑：（1）提高魚鰓泌氯細(xì)胞中Cl-/HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量，排出體內(nèi)HCO3-（Alper et al.，2002）；（2）降低腎臟對HCO3-重吸收，提高NaCl重吸收，調(diào)節(jié)體液pH（Gilmour et al.，2007）；（3）進(jìn)入腸道中的碳酸鹽會與Ca2+反應(yīng)，生成CaCO3沉淀，與代謝廢物一同排出體外（Wood et al.，2007）等。此外，魚類還可通過其他方式應(yīng)對堿脅迫的氨中毒：（1）合成尿素加強(qiáng)氨排泄（Wood and Marshall，1994）；（2）調(diào)節(jié)代謝降低氨的產(chǎn)生而適應(yīng)堿性環(huán)境（Wilkie et al.，1994）；（3）提高對氨的耐受性來適應(yīng)高堿環(huán)境（Wright and Wood，1988）。本研究中，尼羅羅非魚血清pH和游離氨濃度在低碳酸鹽堿度（4.0和6.0 g/L）脅迫后，呈先升高后回落的變化趨勢，即反應(yīng)了尼羅羅非魚應(yīng)對逆境的自我調(diào)控過程和能力。近年來，研究發(fā)現(xiàn)魚類在高堿脅迫或環(huán)境下存在大量表達(dá)差異顯著的相關(guān)基因（郭雯翡等，2012；Yao et al.，2012），如脅迫后顯著上調(diào)的CA基因和GS基因。CA主要通過催化可逆反應(yīng)（HCO3-+H+■CO2+H2O）降低HCO3-（趙麗慧等，2014b），而GS可將體內(nèi)氨氮轉(zhuǎn)換成中性無毒的谷氨酰胺（陳勝勇等，2010）。本研究結(jié)果表明，尼羅羅非魚腎組織中CA基因和GS基因表達(dá)量均隨脅迫時間的推移而呈先升高后降低的變化趨勢，與血清pH和游離氨濃度的變化趨勢一致，故推測這兩個基因在尼羅羅非魚血清pH和游離氨的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。

一些魚類經(jīng)過長期的自然選擇可在pH顯著偏高的堿性水體中生存，如肯尼亞馬加迪湖（pH 10.0）的馬加迪湖羅非魚（Alcolapia graha）（Seegers and Tichy，1999），美國皮拉米德湖（pH 9.4）的克拉克大麻哈魚（Oncorhyn chusclarkihen shawi）（Coleman and Johnson，1988），我國達(dá)里諾爾湖（pH 8.25～9.60）的瓦氏雅羅魚（Leuciscus waleckii）（Xu et al.，2013a，2013b）、青海湖的青海湖裸鯉（Gymnocypris przewalskii）（郭雯翡等，2012）。相對而言，絕大多數(shù)淡水魚適合在pH接近8.0的水體中生長，但不同種或不同個體對堿性環(huán)境的適應(yīng)性存在較大差異。本研究中，當(dāng)碳酸鹽堿度達(dá)8.0 g/L時，脅迫數(shù)小時后便出現(xiàn)大量死魚；當(dāng)碳酸鹽堿度達(dá)10.0 g/L時，僅脅迫1.0 h即開始出現(xiàn)死魚現(xiàn)象，與趙麗慧等（2014a）的研究結(jié)果相似。就血清pH而言，大多數(shù)魚類正常情況下維持在7.7～8.0（Aidakatsumi，2002），在低pH（4.0）脅迫96 h后，草魚動脈血液pH由7.85降低至7.58（余日清和賀錫勤，1992）。本研究中，碳酸鹽堿脅迫下尼羅羅非魚中血清pH維持在7.81～8.14，瀕死前的pH為8.11和8.14，故推測尼羅羅非魚體內(nèi)維持酸堿平衡、能量耐受的pH上限在8.10附近。目前，有關(guān)魚類血清游離氨濃度的研究較少，正常人體內(nèi)游離血氨含量極低（20～60 μmol/L），正常大鼠腦皮層氨含量為280 μmol/L，但中斷腦循環(huán)5 min后迅速升高到1220 μmol/L（劉福和曾芝蘭，2007）。本研究結(jié)果表明，碳酸鹽堿脅迫下尼羅羅非魚血清游離氨濃度在180.32～ 525.66 μmol/L，瀕死前的前血清游離氨濃度為365.89和486.28 μmol/L，因此推測尼羅羅非魚可耐受的游離氨濃度上限為525.66 μmol/L，在低于該濃度出現(xiàn)死魚現(xiàn)象可能是體內(nèi)酸堿失衡或其他原因所引起，具體原因有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

尼羅羅非魚能耐受的血清pH上限在8.10附近，耐受的游離氨濃度為525.66 μmol/L。在低碳酸鹽堿度（小于6.0 g/L）脅迫下，尼羅羅非魚可通過生理調(diào)控血清pH和游離氨濃度而適應(yīng)脅迫逆境，且CA和GS參與了相應(yīng)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)及氨氮代謝。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）