楊宗英 王玉蘭 曾柳根

摘要：【目的】制備出能有效防御黃鱔出血病的三聯(lián)微膠囊口服疫苗，促進(jìn)黃鱔養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。【方法】以嗜水氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌及溫和氣單胞菌為抗原，海藻酸鈉為壁材，利用乳化法制備三聯(lián)微膠囊口服疫苗，然后直接拌入餌料對健康黃鱔進(jìn)行口服免疫，7 d后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，測定各項(xiàng)血清免疫指標(biāo)。加強(qiáng)免疫結(jié)束15 d后，經(jīng)腹腔注射3種活菌（1.0×109 CFU/mL）進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，檢驗(yàn)三聯(lián)微膠囊口服疫苗對黃鱔的免疫保護(hù)率。【結(jié)果】制備獲得的三聯(lián)微膠囊口服疫苗的平均粒徑為44.5 μm，平均含菌量為4.56×109 CFU/mg。按0.4和0.6 g/kg的劑量口服免疫黃鱔，其血清補(bǔ)體C3含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、酸性磷酸酶（ACP）活性均顯著高于對照組（P<0.05），血清平均抗體效價(jià)分別為7.5949和11.0651，對應(yīng)的免疫保護(hù)率為60%和65%，且0.6 g/kg劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)均高于0.4 g/kg劑量組?！窘Y(jié)論】制備獲得的三聯(lián)微膠囊口服疫苗能顯著提高黃鱔血清SOD、ACP活性及刺激血清補(bǔ)體C3產(chǎn)生，有效抵御由嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌引起的出血病，生產(chǎn)使用時(shí)須進(jìn)行加強(qiáng)免疫，并適當(dāng)加大免疫劑量。

關(guān)鍵詞： 黃鱔；出血?。蝗?lián)微膠囊口服疫苗；補(bǔ)體C3；超氧化物歧化酶；酸性磷酸酶；抗體效價(jià)；免疫保護(hù)率

中圖分類號： S966.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）06-1039-06

0 引言

【研究意義】黃鱔（Monopterus albus）不僅有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，還具有重要的藥用價(jià)值。近年來，由于養(yǎng)殖密度加大、集約化程度加快及疾病研究的滯后，黃鱔病害日趨嚴(yán)重。黃鱔出血病是導(dǎo)致其死亡的主要疾病之一，具有發(fā)病快、傳染性強(qiáng)、死亡率高等特點(diǎn)，如處理不及時(shí)通常會(huì)造成大批量死亡（陳懷青和陸承平，1991），但至今尚無有效的治療方法，仍以預(yù)防為主。長期使用化學(xué)藥物和抗生素進(jìn)行魚病防治極易造成藥物殘留、水域污染及致使部分病原產(chǎn)生耐藥性等不良情況（殷睿，2005），與之相比，疫苗既可以提高魚類機(jī)體的抗病能力，又不會(huì)造成環(huán)境污染和藥物殘留（黃寧和李海峰，2003）。多聯(lián)口服疫苗是將兩種及以上的疫苗同次使用或混合使用進(jìn)行免疫，可預(yù)防由不同病原引起的多種疾病，或不同種病原引起的同一種疾?。ɡ顏喣系?，1995；許宗麗等，2014），極大降低工人的勞動(dòng)強(qiáng)度且操作方便，因此在實(shí)際生產(chǎn)中具有極高的應(yīng)用價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有較多關(guān)于黃鱔出血病的研究報(bào)道。陳懷青和陸承平（1991）從江蘇某養(yǎng)殖場患出血病黃鱔的體內(nèi)分離出嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），且首次證實(shí)嗜水氣單胞菌是黃鱔出血性敗血癥的病原菌；馬有智和舒妙安（2000）從患出血病黃鱔苗種中分離出產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes）；沈錦玉等（2001）從浙江湖州某養(yǎng)殖場患出血病黃鱔的肝臟、腎臟中分離到致病菌，并證實(shí)該致病菌為嗜水氣單胞菌；徐海圣和舒妙安（2003）從患出血病黃鱔體內(nèi)分離出溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria），經(jīng)過人工回感試驗(yàn)，確定為黃鱔出血病的致病菌。在黃鱔疫病疫苗方面，僅徐海圣和舒妙安（2003）研制出黃鱔溫和氣單胞菌滅活疫苗，陳曉利和舒妙安（2013）制備出嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌的二聯(lián)疫苗?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】現(xiàn)有文獻(xiàn)鮮見弗氏檸檬酸菌（Citrobacter freundii）能引起黃鱔出血病的報(bào)道，將黃鱔出血病的3種致病菌（溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌）制成全菌滅活三聯(lián)微膠囊口服疫苗的研究也尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】將黃鱔出血病的3種病原菌制成三聯(lián)微膠囊口服疫苗，并對健康黃鱔進(jìn)行免疫，探究黃鱔對此疫苗的免疫應(yīng)答，以期有效防御黃鱔出血病，促進(jìn)黃鱔養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

2015年7月3日從河南購入健康黃鱔苗種，體重30～50 g，體長30～45 cm。黃鱔苗在余干縣瑞洪鎮(zhèn)黃鱔養(yǎng)殖基地人工網(wǎng)箱養(yǎng)殖30 d，選擇9個(gè)等重量的網(wǎng)箱進(jìn)行試驗(yàn)，網(wǎng)箱投放密度2.5 kg/m2。海藻酸鈉、植物油、氯化鈣、吐溫-80均為國產(chǎn)分析純，超氧化物歧化酶（SOD）活性、酸性磷酸酶（ACP）活性檢測試劑盒購自南京建成生物技術(shù)研究所。主要儀器設(shè)備有振蕩培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、紫外可見光分光光度計(jì)、pH計(jì)、雙目生物顯微鏡、電動(dòng)恒速攪拌機(jī)、冷凍干燥機(jī)、冰箱等。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 菌株來源及培養(yǎng)條件 3株病原菌分別是從患出血病黃鱔體內(nèi)分離獲得的嗜水氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌（楊宗英等，2015）及從中國科學(xué)院水生生物研究所購買的溫和氣單胞菌。將3株菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)24 h，一部分菌液用生理鹽水調(diào)節(jié)至1.0×109 CFU/mL備用；一部分加入0.2%福爾馬林滅活24 h，再用滅菌生理鹽水離心（1500 r/min，10 min）洗滌3次，最后加入少量生理鹽水用于制備微膠囊口服疫苗。

1. 2. 2 微膠囊疫苗制備 采用乳化法（Rodrigues et al.，2006）將等體積的3種菌液（共10 mL）加入到80 mL海藻酸鈉溶液中，充分混合后加入乳化劑吐溫-80，漩渦振蕩器充分振蕩至完全乳化，加入氯化鈣溶液，用攪拌器充分?jǐn)嚢柚菱}化形成均勻微膠囊，收集制得的微膠囊在冷凍干燥機(jī)中干燥過夜，制成三聯(lián)微膠囊口服疫苗成品，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 微膠囊疫苗檢測 用顯微鏡觀察三聯(lián)微膠囊口服疫苗的形態(tài)并進(jìn)行粒徑測量。在清晰的視野中，隨機(jī)選取50個(gè)微膠囊顆粒測量其直徑，取平均值；取0.10 g三聯(lián)微膠囊口服疫苗溶于10 mL滅菌生理鹽水中，按0.2 mL/尾的劑量對10尾外觀健康的黃鱔進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)觀察記錄2周內(nèi)的死亡情況。同時(shí)，準(zhǔn)確稱取制備的三聯(lián)微膠囊口服疫苗0.01 g溶于100 mL經(jīng)濾膜過濾除去死菌體的無顆粒水中，充分溶解后取1 mL進(jìn)行10倍梯度稀釋，取合適稀釋度的試管以吖啶橙熒光直接鏡檢計(jì)數(shù)（徐懷恕等，1999），測定三聯(lián)微膠囊口服疫苗含菌量。

1. 2. 4 試驗(yàn)餌料制備 以黃鱔的體重為標(biāo)準(zhǔn)，將制備的三聯(lián)微膠囊口服疫苗分別按照0（對照）、0.4和0.6 g/kg混勻拌入黃鱔餌料中進(jìn)行投喂。

1. 2. 5 三聯(lián)微膠囊口服疫苗投喂量及投喂方法 在正常的養(yǎng)殖條件下，將9個(gè)網(wǎng)箱分為3個(gè)組，分別為試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2和對照組，每組3個(gè)重復(fù)。從2015年8月4日開始將三聯(lián)微膠囊口服疫苗混勻至黃鱔餌料中進(jìn)行投喂，其中，試驗(yàn)組1的三聯(lián)微膠囊口服疫苗劑量為0.4 g/kg，試驗(yàn)組2的劑量為0.6 g/kg。兩試驗(yàn)組在投喂7 d后暫停7 d，8月18號再按照同樣的劑量繼續(xù)投喂7 d進(jìn)行加強(qiáng)免疫；對照組投喂未混入三聯(lián)微膠囊口服疫苗的黃鱔餌料。

1. 2. 6 采血及免疫指標(biāo)測定 在黃鱔加強(qiáng)免疫結(jié)束15 d后（9月10日），分別從各處理組的網(wǎng)箱中隨機(jī)選擇5尾黃鱔進(jìn)行尾部靜脈采血。采集的血樣迅速轉(zhuǎn)至無菌離心管中，室溫下靜置凝血后4 ℃下3000 r/min離心15 min，收集血清，-20 ℃保存，用于血清相關(guān)免疫指標(biāo)測定。其中，血清補(bǔ)體C3含量根據(jù)補(bǔ)體C3檢測試劑盒使用說明進(jìn)行測定；血清SOD活性按照SOD測定試劑盒說明進(jìn)行測定，SOD活性以在0.24 mL反應(yīng)體系中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的酶量為一個(gè)活力單位；血清ACP活性按照ACP測定試劑盒說明進(jìn)行測定，ACP活性以100 mL血清在37 ℃下與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生 1 mg酚為一個(gè)活力單位；血清凝集抗體效價(jià)采用間接ELISA進(jìn)行測定。

1. 2. 7 攻毒試驗(yàn) 在加強(qiáng)免疫結(jié)束15 d后從各處理組的網(wǎng)箱中隨機(jī)撈取20尾黃鱔，分別通過腹腔注射3種混合菌（0.2 mL），3種菌液的濃度均為1.0×109 CFU/mL。飼養(yǎng)觀察1周，記錄黃鱔死亡率，并換算三聯(lián)微膠囊口服疫苗的免疫保護(hù)率。

免疫保護(hù)率（%）=■×100

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2010進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 三聯(lián)微膠囊口服疫苗的形態(tài)及特性

按照本研究條件制得的三聯(lián)微膠囊口服疫苗經(jīng)冷凍干燥后，呈米黃色粉末，在顯微鏡下可觀察到大部分呈橢圓形，顆粒均勻。大部分微粒中有黑色的不透光區(qū)，可能是菌體存在膠囊中所造成。經(jīng)測定，三聯(lián)微膠囊口服疫苗的顆粒直徑20.4～66.4 μm，平均為44.5 μm；經(jīng)吖啶橙熒光直接鏡檢計(jì)數(shù)測得總菌量為4.56×108 CFU/mL，即疫苗顆粒含菌量為4.56×109 CFU/mg；注射三聯(lián)微膠囊口服疫苗后黃鱔行動(dòng)正常，搶食積極，2周內(nèi)無任何異常，即三聯(lián)微膠囊口服疫苗安全性良好。

2. 2 黃鱔血清免疫指標(biāo)的測定結(jié)果

2. 2. 1 血清補(bǔ)體C3含量 在對試驗(yàn)組黃鱔進(jìn)行加強(qiáng)免疫結(jié)束15 d后，試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2的黃鱔血清補(bǔ)體C3含量分別為0.0802±0.0047和0.0998±0.1500 mg/mL，均顯著高于對照組（P<0.05，下同），說明三聯(lián)微膠囊口服疫苗能有效提高黃鱔血清補(bǔ)體C3含量（圖1），且免疫劑量為0.6 g/kg的黃鱔免疫反應(yīng)比免疫劑量為0.4 g/kg的更強(qiáng)烈。

2. 2. 2 血清SOD活性 從圖2可以看出，試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2的黃鱔血清SOD活性均顯著高于對照組，且試驗(yàn)組2的黃鱔血清SOD活性高于試驗(yàn)組1，但二者間差異不顯著（P>0.05，下同）。

2. 2. 3 血清ACP活性 從圖3可以看出，試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2的黃鱔血清ACP活性均顯著高于對照組，且試驗(yàn)組2的黃鱔血清ACP活性顯著高于試驗(yàn)組1。說明投喂三聯(lián)微膠囊口服疫苗能有效提高黃鱔血清ACP活性，生產(chǎn)建議投喂劑量為0.6 g/kg。

2. 2. 4 血清凝集抗體效價(jià) 由表1可知，試驗(yàn)組1的黃鱔血清平均抗體效價(jià)為7.5949，試驗(yàn)組2的平均抗體效價(jià)為11.0651，而對照組在整個(gè)試驗(yàn)過程中未能檢測到抗體。

2. 3 三聯(lián)微膠囊口服疫苗對黃鱔的免疫保護(hù)效果

由表2可以看出，試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2的黃鱔均獲得不同程度的免疫保護(hù)力，1周內(nèi)試驗(yàn)組1黃鱔獲得的平均免疫保護(hù)率為60%，試驗(yàn)組2獲得的平均免疫保護(hù)率為65%，二者差異不顯著。

3 討論

3. 1 三聯(lián)微膠囊口服疫苗對黃鱔的免疫保護(hù)效果

SOD是生物體內(nèi)非常重要的一種抗氧化酶，能清除氧自由基，以保護(hù)功能大分子不因氧化而被破壞，是預(yù)防分子生物損傷和機(jī)體衰老的重要物質(zhì)，其活性與生物體的免疫水平密切相關(guān)（林林等，1998；牟海津等，1999）。ACP是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，屬于生物體內(nèi)調(diào)控酶，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用（劉永貴，2009）。補(bǔ)體系統(tǒng)是魚類抵抗微生物感染的重要成分，由存在于體液中的數(shù)十種具有酶活性的球蛋白組成。本研究制備的三聯(lián)微膠囊口服疫苗能夠顯著提高黃鱔血清SOD、ACP活性及刺激血清補(bǔ)體C3產(chǎn)生，進(jìn)而提高機(jī)體免疫力。免疫保護(hù)率和抗體水平是評價(jià)疫苗免疫效果的重要指標(biāo)，抗體是由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的球蛋白，免疫保護(hù)率則是直接反映機(jī)體獲得的免疫防病能力。本研究結(jié)果表明，在加強(qiáng)免疫結(jié)束15 d后，試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2的黃鱔血清抗體效價(jià)分別為7.5949和11.0651，攻毒后試驗(yàn)組黃鱔獲得的免疫保護(hù)率在60%以上。說明該三聯(lián)微膠囊口服疫苗對黃鱔抵御常規(guī)細(xì)菌性疾病起到一定的促進(jìn)作用，尤其對抵御由嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌及弗氏檸檬酸桿菌引起的出血病具有積極作用。

3. 2 口服疫苗投喂過程中要避免造成免疫耐受

本研究分別按0.4和0.6 g/kg的劑量投喂黃鱔，且進(jìn)行加強(qiáng)免疫，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組1（0.4 g/kg）的各項(xiàng)免疫指標(biāo)及免疫保護(hù)率均低于試驗(yàn)組2（0.6 g/kg），可能是由于試驗(yàn)組2的疫苗投喂量高于試驗(yàn)組1所導(dǎo)致，因此實(shí)際生產(chǎn)中為了提高免疫效果和節(jié)省養(yǎng)殖費(fèi)用，可適當(dāng)加大免疫劑量。但不是免疫劑量越高越好，只有在正確、科學(xué)的用藥前提下，免疫藥物才能正常發(fā)揮作用，否則產(chǎn)生免疫耐受（楊先樂等，1989）?？诜呙缡峭ㄟ^胃腸道黏膜進(jìn)行抗原呈遞，可經(jīng)不同的免疫通路產(chǎn)生與常規(guī)注射類似的免疫反應(yīng)（余麗蕓等，2008）。Weiner等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，一次性給予大劑量的口服抗原易使機(jī)體內(nèi)抗原特異性的CD4+T細(xì)胞凋亡，從而引起免疫耐受。此外，免疫持久性也是魚類免疫應(yīng)答的一個(gè)重要特性，不僅與機(jī)體自身的遺傳信息有關(guān)，還與免疫接種劑量、免疫原性質(zhì)等有關(guān)。關(guān)于本研究制備三聯(lián)微膠囊口服疫苗的免疫持久性尚需進(jìn)一步探究。

3. 3 多聯(lián)微膠囊口服疫苗的優(yōu)越性

多聯(lián)疫苗能夠?qū)σ环N以上的疾病起免疫保護(hù)作用（許宗麗等，2014）。L■nnstrom等（2001）用殺鮭氣單胞菌和鰻弧菌的二聯(lián)疫苗免疫白鰱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該二聯(lián)疫苗對白鰱弧菌病和癤瘡病具有很好的免疫效果；陳曉利（2010）研究表明，利用嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌制成的全菌體二聯(lián)疫苗可有效提高黃鱔的各項(xiàng)免疫指標(biāo)，且對嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌侵染具有一定的免疫保護(hù)作用。至今，我國已研發(fā)出較多的水產(chǎn)多聯(lián)疫苗，但大多是注射用的多聯(lián)滅活全菌疫苗。與之相比，口服疫苗可極大降低工人的勞動(dòng)強(qiáng)度且操作方便（徐希明等，2007），但普通口服疫苗到達(dá)胃腸道后會(huì)因被胃酸破壞而降低免疫效果（Irie et al.，2005）。微膠囊口服疫苗是將疫苗包裹在微膠囊中，防止疫苗在到達(dá)腸道相關(guān)淋巴組織前被消化道破壞（陳舒泛和華元渝，2003），其優(yōu)點(diǎn)主要是：微膠囊可保護(hù)菌體抗原，且顆?；呙缬欣谔岣邫C(jī)體對抗原的吸收（Romalde et al.，2004）；通過對微膠囊壁材的選取及工藝優(yōu)化，能實(shí)現(xiàn)對抗原釋放時(shí)間和釋放率的調(diào)控，達(dá)到緩釋效果。Joosten等（1997）研究發(fā)現(xiàn)，疫苗微囊化可有效提高魚體對抗原的吸收；余俊紅等（2001）制備了鰻弧菌口服微膠囊疫苗，對鱸魚幼魚的免疫保護(hù)率達(dá)56.1%。本研究制得的三聯(lián)微膠囊口服疫苗對黃鱔的免疫保護(hù)率在60%以上，但相對草魚出血病活疫苗的免疫保護(hù)率并不高，可能與三聯(lián)疫苗中不同的抗原存在競爭有關(guān)，因此下一步將研究單一疫苗的免疫效果，以期研制出針對黃鱔出血病的高效多聯(lián)口服疫苗，為黃鱔出血病的防治提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本研究制備的三聯(lián)微膠囊口服疫苗能顯著提高黃鱔血清SOD、ACP活性及刺激血清補(bǔ)體C3產(chǎn)生，有效抵御由嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌引起的出血病，生產(chǎn)使用時(shí)須進(jìn)行加強(qiáng)免疫，并適當(dāng)加大免疫劑量。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）