陳涵 龐杰 譚小丹 王淑娜 王敏 安瑞琪 周巧星 李崇高

摘 要 以魔芋葡甘聚糖（KGM）和絲素蛋白（SF）為原料，以KGM/SF紡絲液凝膠強度為響應值，溶脹溫度、底物配比和凝膠時間為影響因子，進行響應面優(yōu)化設計。同時，調(diào)節(jié)底物配比，采用靜電紡絲技術制備納米纖維膜，通過力學測試、差式掃描量熱分析分別對納米纖維膜的拉伸強度和熱特性進行研究。結果表明，KGM有效的提高SF納米纖維膜的強度及熱穩(wěn)定性；溶脹溫度、底物配比和凝膠時間為紡絲液凝膠強度的顯著影響因子，兩兩交互作用對其紡絲液凝膠強度影響極顯著，其數(shù)值分別為49.87 ℃、84.41%和58.80 min時，模型預測紡絲液凝膠強度達到最大值828.231 g·mm。

關鍵詞 魔芋葡甘聚糖；絲素蛋白；納米纖維膜；穩(wěn)定性；響應面設計

中圖分類號 TQ34 文獻標識碼 A

Abstract To obtain nano fiber material with good stability， the response surface optimization design was carried out by using konjac glucomannan（KGM）and silk fibroin（SF）as the raw material， the KGM/SF gel strength of spinning solution as response value， the swelling temperature， substrate ratio and gel time as the factors in this study. Meanwhile， the substrate ratio was adjusted， The electrospinning technology was used to prepare the nano fiber membrane. The tensile strength and thermal properties of the nano fibers were studied by mechanical test and differential scanning calorimetry. The results showed that KGM improved the strength and thermal stability of SF nano fiber film effectively. The swelling temperature， substrate ratio and gel time were significant influence factors of the gel strength of spinning solution， and the interaction effect on the gel strength of spinning solution was significant. The value was 49.87 ℃， 84.41% and 58.80 min， respectively. The model predicted that the maximum value of gel strength of spinning solution was 828.231g·mm.

Key words Konjac glucomannan； Silk fibroin； Nano fiber membrane； Stability； Response surface design

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.013

靜電紡絲技術是通過高靜電壓的方法使紡絲液產(chǎn)生帶電射流，射流在電場中拉伸，凝固形成具有比表面積大、纖度低、孔隙率高的納米纖維材料[1-2]。其制備所得的納米結構材料已成為當前納米電子器件[3]、環(huán)境監(jiān)測[4]、污染治理[5]、食品[6]和生物醫(yī)學[7]等領域的研究熱點之一。

絲素蛋白（Silk Fibroin，簡稱SF）具有優(yōu)異的降解性和生物相容性[8]，但由于其紡絲液膠凝性較差，且紡絲所得纖維較粗，強度及熱穩(wěn)定性較差，在實際生產(chǎn)應用上受到一定的限制[9]。魔芋葡甘聚糖（Konjac Glucomannan，簡稱KGM）具有良好的親水、增稠、吸附和成膜等特性，在特定條件下可對多種蛋白質(zhì)發(fā)生一定的協(xié)同增效作用改變其結構和性質(zhì)[10-11]。通過糖基化改性，以期綜合多糖與蛋白質(zhì)兩類大分子的優(yōu)良性能，調(diào)節(jié)多糖與蛋白質(zhì)復合體系的膠凝性和生物相容性，制備具有良好強度和熱穩(wěn)定性等優(yōu)點的KGM/SF靜電紡絲復合納米纖維材料尚未見研究報道。

本研究運用響應面法優(yōu)化KGM/SF紡絲液凝膠特性，同時采用靜電紡絲技術制備納米纖維膜，通過力學測試及差式掃描量熱計（DSC）研究其強度及熱穩(wěn)定性。以期得到具有良好穩(wěn)定性的靜電紡絲納米纖維材料，為多糖與蛋白的進一步研究與開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 KGM：云南三艾有機魔芋發(fā)展有限公司（食品級）；家蠶蠶繭：廣州境宏生物科技有限公司；碳酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司（AR）；溴化鋰：國藥集團化學試劑有限公司（AR）。

1.1.2 儀器與設備 Netzsch DSC 200 F3 Maia差示掃描量熱儀，德國NETZSCH公司；TA.XT Plus質(zhì)構儀，英國Stable Micro Systems公司；SS-2535H靜電紡絲設備，北京永康樂業(yè)科技發(fā)展有限公司；AB-50電子分析天平：瑞士Mette公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；R30A電動攪拌器，上海弗魯克科技發(fā)展有限公司；AGS-X 型萬能拉伸試驗機，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 SF紡絲液的制備 將定量的經(jīng)0.5%Na2CO3脫膠蠶絲溶于9.3 mol/L LiBr水溶液中，在40 ℃的水浴條件下以350 r/min攪拌溶解40 min。過濾，除去少量未溶解的固態(tài)雜質(zhì)，所得的溶液用截留分子量為8 000～14 000 u透析袋在去離子水中透析以除去LiBr鹽，直至透析袋外溶液使用硝酸銀溶液檢驗不產(chǎn)生沉淀為止。經(jīng)離心后獲得濃度為3%的SF水溶液，置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆肹12]。

1.2.2 KGM紡絲液的制備 將定量的KGM在常溫下，以350 r/min 的轉速分散于100 mL去離子水中，攪拌1.0 h后獲得濃度為3%的KGM溶膠，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 KGM/SF紡絲液的制備 將SF水溶液和KGM溶膠液，按照一定的配比在恒溫水浴條件下以350 r/min的轉速攪拌1.0 h獲得KGM/SF紡絲液，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 KGM/SF紡絲液凝膠的制備 將定量的KGM/SF紡絲液灌入直徑為20 mm的塑料腸衣中，兩端用細線封口。將樣品置于90 ℃的水浴中凝膠一定時間后立即放入0 ℃的冰水中冷卻，置于4 ℃的冰箱中12 h即形成凝膠。將制成的凝膠取出后去掉塑料腸衣，切成高為20 mm的凝膠，待測。

1.2.5 KGM/SF紡絲液凝膠強度測定 使用英國Stable Micro Systems公司的TA-XTplus質(zhì)構儀，參考Koc等[13]的方法，通過對其方法的一些改動來測定KGM/RSF復合紡絲液凝膠。采用直徑為0.5英寸的P/0.5圓柱形探頭，測試距離為10 mm，測試速度為1.0 mm/s。每組樣品分別進行5次平行試驗，結果取平均值。

1.2.6 納米纖維膜的制備 取適量紡絲液于10 mL的注射器中，將靜電紡絲設備中的正極與內(nèi)徑為0.6 mm的針頭相連，收集平板裝置與負極相連，調(diào)節(jié)紡絲距離為13 cm，紡絲電壓為30 kV，紡絲溫度為50 ℃，紡絲流速為2.4 mL/h，紡絲時間為10 min，制備SF納米纖維膜及KGM/SF復合納米纖維膜。紡絲設備如圖1所示。

1.2.7 力學性能測試 將納米纖維膜裁剪成10 mm×10 mm的樣條，用萬能拉伸試驗機測試SF納米纖維膜及KGM/SF復合納米纖維膜的拉伸強度，傳感器載荷為50 N，拉伸速度為3 mm/min。

1.2.8 DSC分析 使用Netzsch DSC 200 F3型差示掃描量熱儀分析SF納米纖維膜及KGM/SF復合納米纖維膜的熱特性。準確稱?。?5.0±0.1）mg的膜材料放入鋁坩堝中密封，并使用空坩堝作參比。升溫范圍為25～150 ℃，升溫速率為5 ℃/min。整個過程均應在高純氮的保護下進行，設定吹掃氣及保護氣速率為50 mL/min。

1.3 響應面設計及數(shù)據(jù)分析

在單因素實驗的基礎上，采用響應面優(yōu)化的方法（Response surface methodology，簡稱RSM），通過Design-Expert.V8.0.6軟件，以KGM/SF紡絲液的溶脹溫度、底物配比、凝膠時間為因素，以KGM/SF紡絲液凝膠強度為響應值，進行3因素3水平的響應面優(yōu)化設計，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD），對結果進行分析[14]。

2 結果與分析

2.1 KGM/SF紡絲液凝膠工藝優(yōu)化

2.1.1 響應面設計與結果分析 根據(jù)BBD實驗設計原理，結合預先單因素實驗結果，選取溶脹溫度、底物配比和凝膠時間這3個與之密切相關的因素為自變量，以KGM/SF紡絲液凝膠強度為響應值，設計3因素3水平的響應面優(yōu)化實驗。實驗自變量因素編碼及水平如表1所示，BBD實驗設計方案及結果見表2。

圖2～4是由多元回歸方程所得到的不同因素間兩兩作用從而對紡絲液凝膠強度影響的響應面圖。圖2表示凝膠時間為30 min時，溶脹溫度和底物配比對紡絲液凝膠強度的影響?？梢钥闯?，隨溶脹溫度的升高和底物配比的增大，紡絲液凝膠強度先增大后減小。

圖3表示底物配比為5 ∶ 5時，溶脹溫度和凝膠時間對紡絲液凝膠強度的影響?？梢钥闯?，隨著溶脹溫度和凝膠時間的增大，紡絲液凝膠強度先增大后減小。

圖4表示溶脹溫度為50 ℃時，底物配比和凝膠時間對紡絲液凝膠強度的影響。可以看出，隨著凝膠時間的延長，紡絲液凝膠強度先增大后減小。隨著底物配比中KGM添加量的增大，紡絲液凝膠強度在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出明顯增大的趨勢，底物配比達到80%時紡絲液凝膠強度變化不大。

2.1.2 建立數(shù)學模型 根據(jù)BBD設計實驗所得結果，通過Design-Expert.V8.0.6軟件擬合響應指標建立數(shù)學模型，并對自變量的回歸曲線進行統(tǒng)計分析，結果如下：

凝膠強度=813.43-5.66A+105.93B+50.95C+9.73AB+13.54AC+24.47BC-94.71A2-233.09B2-191.87C2

對回歸曲線進行方差分析，以p值進行顯著性檢驗，結果如表3所示，并對模型進行驗證分析。

由表3可知，A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2的影響皆為極顯著（p值<0.01），失擬為0.058 4>0.05，不顯著，說明根據(jù)BBD實驗設計的結果擬合回歸方程具有顯著意義。決定系數(shù)（R-Squared）達到0.999 8，校正擬合度（Adj R-Squared）值和預測擬合度（Pred R-Squared）值分別為0.999 6和0.997 8，二者相近且其差值處于有意義的范圍內(nèi)，表明該回歸方程能顯著地表示本實驗中各個因素對紡絲液凝膠強度影響。根據(jù)回歸方程的方差分析結果可知，在本實驗的取值范圍內(nèi)，溶脹溫度、底物配比和凝膠時間均是影響KGM/SF靜電紡絲液凝膠強度的顯著性因素。根據(jù)F值的大小，可以判定影響KGM/SF紡絲液凝膠強度的順序依次為底物配比>凝膠時間>溶脹溫度。底物配比與凝膠時間相互作用、凝膠時間濃度與溶脹溫度相互作用、底物配比與溶脹溫度相互作用均為KGM/SF紡絲液凝膠強度的極顯著因素，說明應用響應面法進行優(yōu)化實驗的方法可行。

2.1.3 驗證分析 根據(jù)響應面法優(yōu)化設計實驗所得到的回歸方程及數(shù)據(jù)結果表明，溶脹溫度、底物配比和凝膠時間分別為49.87℃、84.41%和58.80 min時，可得到最優(yōu)凝膠強度為828.231 g·mm。根據(jù)最優(yōu)凝膠條件，通過驗證性實驗評估回歸方程及模型的準確性。實驗結果表明，5組平行實驗得到紡絲液凝膠的平均凝膠強度為824.947 g·mm，與模擬最優(yōu)凝膠強度值的誤差為0.39%，說明所得的最佳工藝參數(shù)是合理可靠的。

2.2 力學性能分析

表4給出了單一的SF納米纖維膜與KGM/SF復合納米纖維膜的拉伸強度?？梢钥闯觯砑覭GM后SF納米纖維膜樣品的拉伸強度有較大幅度的提升，說明KGM對納米纖維膜的拉伸強度影響顯著。這主要是因為KGM與SF分子間的氫鍵相互作用，增加了分子間的相互纏結率，纖維彼此間交織緊密，孔隙較少，形成致密穩(wěn)定的網(wǎng)絡結構，從而有利于得到拉伸強度高的納米纖維膜材料[15-16]。

2.3 DSC分析

從圖5中可以看出，單一的SF納米纖維膜與KGM/SF復合納米纖維膜樣品都出現(xiàn)了2個主要的熱躍遷峰，其中第1個為起始變性溫度峰，第2個為變性溫度峰。KGM后SF納米纖維膜樣品的Td為109.4 ℃，Ti為26.9 ℃，而單一的SF納米纖維膜樣品分別為107.9 ℃和32.18 ℃，添加KGM后SF納米纖維膜樣品的變性溫度有所提高。KGM/SF復合納米纖維膜的吸熱峰尖而窄，而單一的SF納米纖維膜吸熱峰平而寬，說明前者較后者更穩(wěn)定。熱焓值（ΔH）是研究蛋白質(zhì)相變的一個重要參數(shù)，可以看作是蛋白質(zhì)在變性過程中所需能量的變化[17]。對于熱焓值（ΔH）而言，KGM/SF復合納米纖維膜的0.222 6 J/g卻比單一的SF納米纖維膜高，這說明了添加KGM可能會提高SF納米纖維膜的熱穩(wěn)定性。

3 討論與結論

多糖和蛋白共存時提供了不同的結合區(qū)，大分子上部分基團可相互連接，分子間可以產(chǎn)生不同的協(xié)同增效作用，形成了緊密纏繞的空間網(wǎng)絡結構[18-19]。運用響應面法優(yōu)化KGM/SF紡絲液凝膠強度，可以連續(xù)對實驗的各個因素進行分析得到最優(yōu)值，還可以檢測因素之間的交互效應，從而達到調(diào)節(jié)KGM/SF紡絲液的膠凝性、降低單一SF膠凝臨界濃度，改善了單一SF的凝膠特性的目的。與單一膠相比較，KGM/SF紡絲液凝膠強度等特性得到很大改善[20]。

通過靜電紡絲技術制備KGM/SF復合納米纖維膜。研究結果表明KGM的存在有利于SF形成β-折疊結構，從而在一定程度上促進SF大分子結晶。KGM和SF分子間，以及SF與SF分子間存在較強的氫鍵相互作用，導致復合納米纖維膜中SF分子形成小的聚集體均勻分散在KGM中，并且形成新的交聯(lián)網(wǎng)絡[21]。KGM對SF具有良好的增強效果，與單一的成分的納米纖維膜相比，復合納米纖維膜既具有較高的強度，也具有良好的熱穩(wěn)定性。

本研究提供了一種制備良好凝膠特性的KGM/SF紡絲液的方法，同時采用靜電紡絲技術制備KGM/SF復合納米纖維膜，該復合納米纖維膜材料有望應用于食品、生物醫(yī)用材料領域。

參考文獻

[1] 李紀偉， 賀金梅， 尉 楓， 等. 膠原蛋白靜電紡絲納米纖維研究進展[J]. 高分子通報， 2015（5）： 43-49.

[2] Cao Y J， Xin B J， Wu X J， et al. Research on progress and possibility of electrospining of native cellulose and preparation of copper-based antimicrobial fiber[J]. Advanced Materials Research， 2013（850-851）： 53-56.

[3] Thapa A， Zhao Y， Poudel P， et al. Evaluation of counter electrodes composed by carbon nanofibers and nanoparticles in dye-sensitized solar cells[J]. IEEE Transactions on Electron Devices， 2013， 60（11）： 3 883-3 887.

[4] Shamloo A， Vossoughi M， Alemzadeh I， et al. Two nanostructured polymers： polyaniline nanofibers and new linear-dendritic matrix of poly（citric acid）-block-poly（ethylene glycol）copolymers for environmental monitoring in novel biosensors[J]. International Journal of Polymeric Materials， 2013， 62（7）： 377-383.

[5] Naeem S， Chen Q. Nanofibers-A simple and practical way forward for air pollution abatement[J]. Materials Science Forum， 2013， 756： 225-230.

[6] 褚蘭玲， 王 羽， 鄧劍軍， 等. 電紡納米纖維在食品分析中的應用[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報， 2014， 5（5）： 1 314-1 322.

[7] 楊文靜， 付 靜， 何 磊， 等. 靜電紡絲制備殼聚糖/聚己內(nèi)酯血管支架及表征[J]. 復合材料學報， 2011， 28（1）： 104-108.

[8] Banani K， Rangam R， Subhas C K， et al. Silk fibroin biomaterials for tissue regenerations[J]. Advanced Drug Delivery Reviews， 2013， 65（4）： 457-470.

[9] Elettro H， Neukirch S， Antkowiak A， et al. Adhesion of dry and wet electrostatic capture silk of uloborid spider[J]. Naturwissenschaften， 2015， 102（7-8）： 1 291.

[10] Du Xuezhu， Li Jing， Chen Jian， et al. Effect of degree of deacetylation on physicochemical and gelation properties of konjac glucomannan[J]. Food Research International， 2012， 46（1）： 270-278.

[11] Zhang Liqiong， Liu Xiaoyan， Zhao Sufeng， et al. Study on konjac glucomannan-carrageenan edible blend films[J]. Advanced Materials Research， 2013（641-642）： 521-525.

[12] Süleyman N， Süleyman Y， Erol T. Optimization of tool geometry parameters for turning operations based on the response surface methodology[J]. Measurement， 2011， 44（3）： 580-587.

[13] Koc M， Koc B， Susyal G， et al. Improving functionality of whole egg powder by the addition of gelatine， lactose， and pullulan[J]. Journal of Food Science， 2011， 76（9）： S508-S515.

[14] Ajaz A， Khalid M A， Tanveer A W， et al. Application of box-behnken design for ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from paeonia emodi[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2015， 72： 990-997.

[15] Pang J， Ma Z， Shen B S， et al. Hydrogen bond networks QSAR and topological analysis of konjac glucomannan chains[J]. Chinese Journal of Structural Chemistry， 2014， 33（3）： 480-489.

[16] Chen H， Mu R J， Pang J， et al， Influence of topology structure on the stability of konjac glucomannan nano gel microfibril[J]. Chinese Journal of Structural Chemistry， 2015， 34（12）： 1 939-1 941.

[17] Hossain M B， Brunton N P， Patras A， et al. Optimization of ultrasound assisted extraction of antioxidant compounds from marjoram（Origanum majorana L.）using response surface methodology[J]. Ultrasonics Sonochemistry， 2012， 19： 582-590.

[18] 莊遠紅， 王麗霞， 林嬌芬， 等. 響應面法優(yōu)化魔芋多糖-蛋白互配體系凝膠特性[J]. 揚州大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版）， 2013， 34（4）： 73-79.

[19] Melinda C， Kelvin C， Trevor J H， et al. Methodologies for the extraction and analysis of konjac glucomannan from corms of Amorphophallus konjac K. Koch[J]. Carbohydrate Polymers， 2012， 87（3）： 2 202-2 210.

[20] Wu Chunhua， Peng Shuhui， Wen Chengrong， et al. Structural characterization and properties of konjac glucomannan/curdlan blend films[J]. Carbohydrate Polymers， 2012， 89（2）： 497-503.

[21] Ma Z， Pang J， Lin M L， et al. Quantum mechanical analysis of sodium alginate effects on the konjac glucomannan stability[J]. Chinese J Struct Chem， 2015， 34（8）： 1 187-1 196.