傅華英 肖勝華 劉營(yíng)航 孫生仁 吳小斌 陳如凱 高三基

摘 要 為了解我國(guó)甘蔗銹病病原菌發(fā)生以及優(yōu)良甘蔗新品種（系）抗褐銹病基因Bru1的分布頻率情況，以來(lái)自我國(guó)5?。▍^(qū)）81份疑似甘蔗銹病葉片樣品為材料，分別用Pm1-F/Pm1-R和Pk1-F/Pk1-R引物對(duì)進(jìn)行褐銹病菌（Puccinia melanocephala）與黃銹病菌（Puccinia kuehnii）分子鑒定。結(jié)果表明，銹病病原菌檢出率為40.7%，除了福建省福州市葉片樣品僅檢測(cè)到P. melanocephala外，其他省（區(qū)）的葉片樣品均檢測(cè)到2種銹病病原菌，且存在混合侵染現(xiàn)象。對(duì)24份黃銹病菌陽(yáng)性PCR產(chǎn)物（527 bp）克隆并測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P. kuehnii間隔區(qū)1（ITS1）第183個(gè)核苷酸存在單核苷酸多態(tài)性（SNP），其中，A堿基（183A）、G堿基（183G）位點(diǎn)的病菌分離物分別占29.2%和25.0%，2種堿基（183A/G）位點(diǎn)的混合病菌分離物有45.8%。通過(guò)R12H16與9020-F4/RsaI兩種分子標(biāo)記對(duì)40份甘蔗新品種（系）抗褐銹病基因Bru1進(jìn)行分子檢測(cè)，結(jié)果表明，42.5%參試新品種（系）含抗褐銹病基因Bru1，這些材料可作為甘蔗抗褐銹病新品種加以推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 甘蔗銹??；病原菌；新品種（系）；抗褐銹病基因Bru1；分子檢測(cè)

中圖分類號(hào) S435.661 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The aim of this study was to investigate the incidence of causal pathogens causing sugarcane rust and frequency of Bru1 gene in new elite sugarcane clones. Two sets of primers of Pm1-F/Pm1-R and Pk1-F/Pk1-R were used for the identification of Puccinia melanocephala and Puccinia kuehnii respectively， causing the sugarcane rust in 81 leaf samples collected from five provinces in China. PCR assay revealed 40.7% of samples were verified to infect with P. melanocephala or/and P. kuehnii. Co-infection with two causal fungi was observed in leaf samples from most of provinces except for Fuzhou， Fujian. Subsequently， PCR products from 24 leaf samples infected with P. kuehnii were cloned and then sequenced to analyze the SNP（Single Nucleotide Polymorphism）in P. kuehnii ITS1 183A/G locus. Results showed that allele 183A and 183G were observed in 29.2% and 25.0% causal isolates， respectively， whereas 183A/G was detected in 45.8% causal isolates. Two marker-assisted R12H16 and 9020-F4/RsaI were used for screening of Bru1 resistance gene for brown rust in 40 new elite sugarcane clones. Bru1 frequency was 42.5% in the tested clones， of which would be applied in the effective and durable resistance in sugarcane against the P. kuehnii.

Key words Sugarcane rust； Pathogenic bacteria； New varieties（or lines）； Bru1（brown rust resistance genes）； Molecular detection

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.017

甘蔗銹病是一種重要的世界流行的甘蔗真菌性病害，分為褐銹?。˙rown rust）和黃銹病（Orange rust）2種類型，其病原菌分別為擔(dān)子菌綱柄銹科（Pucciniaceae）柄銹菌屬（Puccinia）的黑頂柄銹菌Puccinia melanocephala H. & P. Syd. 和屈恩柄銹菌Puccinia kuehnii Butler[1]。甘蔗褐銹病分布廣泛、為害較大，在多數(shù)種植甘蔗的國(guó)家或地區(qū)均有發(fā)生，可以引起感病品種產(chǎn)量損失10%～40%；甘蔗黃銹病主要分布于亞洲和澳大利亞，近年來(lái)已擴(kuò)散到美國(guó)的弗羅里達(dá)州以及墨西哥、巴西等西半球國(guó)家或地區(qū)，在非洲國(guó)家目前還未有黃銹病發(fā)生的報(bào)道[1-2]。

甘蔗褐銹病與黃銹病可以通過(guò)田間甘蔗感病癥狀及夏孢子的顏色和形態(tài)加以區(qū)別。然而，夏孢子形態(tài)特征上的差異細(xì)微，且僅當(dāng)孢子堆完全成熟時(shí)才可通過(guò)高倍顯微鏡鑒別，受到繁殖季節(jié)、病原保存、儀器設(shè)備等諸多因素的限制。利用分子生物檢測(cè)手段來(lái)區(qū)別這2種病原菌已有報(bào)道。Glynn等[2]針對(duì)P. melanocephala和P. kuehnii這2種病原菌分別設(shè)計(jì)了特異性常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR引物及探針；此外，利用PIRA-PCR（Primer-introduced restriction analysis PCR）技術(shù)檢測(cè)分析P. kuehnii病菌，發(fā)現(xiàn)PkPmF/PkPmR引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物（606 bp）第183個(gè)核苷酸存在SNP（Single Nucleotide Polymorphism）位點(diǎn)，為A或G堿基[2]。

甘蔗銹病的流行與品種抗病性密切相關(guān)，抗性品種的選育和推廣已成為控制褐銹病爆發(fā)流行最經(jīng)濟(jì)有效的措施[3]。因此，對(duì)已有的優(yōu)良甘蔗新品種（系）進(jìn)行抗褐銹病篩選成為選育高抗甘蔗品種的關(guān)鍵。然而，抗甘蔗褐銹病品種的篩選與鑒定主要使用人工接種表型觀察選擇，該傳統(tǒng)方法低效、費(fèi)時(shí)，且由于環(huán)境條件、病原活力以及接種壓力的影響，鑒定結(jié)果容易出現(xiàn)誤差[4]。為此，國(guó)內(nèi)外甘蔗分子遺傳學(xué)家試圖尋找與抗銹病相關(guān)的分子標(biāo)記。Daugrois等[5]發(fā)現(xiàn)了抗褐銹病主效基因Bru1；Costet等[6]研發(fā)出9020-F4/RsaI和R12H16 兩個(gè)針對(duì)抗褐銹病基因Bru1的PCR分子標(biāo)記，之后，許多國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果證實(shí)抗褐銹病基因Bru1與甘蔗抗P. melanocephala能力緊密相關(guān)[7-8]。早有報(bào)道，我國(guó)甘蔗銹病致病菌有P. melanocephala和P. kuehnii[9]。本研究擬了解這2種病原菌在我國(guó)主要蔗區(qū)的發(fā)生情況以及優(yōu)良甘蔗新品種（系）抗褐銹病基因Bru1的分布狀況，為及時(shí)有效開(kāi)展甘蔗銹病病原檢測(cè)和優(yōu)良甘蔗新品種（系）的篩選提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2013～2014年，從云南、廣東、廣西、四川、福建等?。▍^(qū)）的40個(gè)甘蔗新品種（系）采集的疑似甘蔗銹病癥狀葉片樣品81份（表1），-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

dNTPs、Ex Taq酶、限制性內(nèi)切酶RsaI、pMD19-T載體購(gòu)自TaKaRa（上海）公司；DNA Marker、大腸桿菌宿主菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 用于檢測(cè)褐銹病引物Pm1-F/Pm1-R和檢測(cè)黃銹病引物Pk1-F/Pk1-R的序列參照文獻(xiàn)[2]，甘蔗抗褐銹病基因Bru1的兩種分子標(biāo)記R12H16和9020-F4引物序列參照文獻(xiàn)[6]（表2）。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.2 DNA提取及銹病PCR檢測(cè) 甘蔗葉片總DNA提取參考CTAB法完成。DNA的質(zhì)量和數(shù)量分析分別通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和Naro Drop微量核酸測(cè)定儀完成，所有DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[2]?？傮w積均為25 μL，包括1.0 μL DNA（約100 ng）為模板，1.0 U Ex Taq DNA聚合酶，2.5 μL 10×Ex Taq buffer，0.25 μmol/L上下游引物Pm1-F/Pm1-R或Pk1-F/Pk1-R和0.2 mmol/L dNTPs。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.2.3 甘蔗抗褐銹病基因Bru1的分子檢測(cè) 甘蔗抗褐銹病基因Bru1分子標(biāo)記R12H16和9020-F4的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[6]?？傮w積均為25 μL，包括1.0 μL DNA（約100 ng）為模板，1.0 U Ex Taq DNA聚合酶，2.5 μL 10×Ex Taq buffer，0.25 μmol/L上下游引物R12H16-F/R12H16-R或9020-F4-F/ 9020-F4-R和0.2 mmol/L dNTPs。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

R12H16分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；9020-F4/RasI分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)限制性內(nèi)切酶RsaI 酶切檢測(cè)，并根據(jù)限制性內(nèi)切酶多態(tài)性判別。酶切體系總體積25 μL，含有純化后的PCR產(chǎn)物15.0 μL、10×NEB 緩沖液2.5 μL、RsaI酶（10 000 U）1.0 μL、無(wú)菌水 6.5 μL，酶切反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃ 2 h，然后65 ℃ 10 min。取酶切產(chǎn)物10 μL，用3%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 PCR產(chǎn)物純化和克隆 PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，取100 μL涂于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃暗培養(yǎng)16～18 h，挑取若干個(gè)單菌落分別接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，經(jīng)菌液PCR篩選得到陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆子送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 序列分析 PCR產(chǎn)物目的片段克隆和測(cè)序后，序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)在線blast分析（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），驗(yàn)證序列是否正確。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗銹病病原菌PCR鑒定

在我國(guó)主要蔗區(qū)采集的81份甘蔗葉片樣品中共檢測(cè)得到33份陽(yáng)性樣品，銹病病原菌的陽(yáng)性檢出率為40.7%。其中17份樣品PCR擴(kuò)增出現(xiàn)P. melanocephala目的片段，大小約480 bp，24份樣品PCR擴(kuò)增出現(xiàn)P. kuehnii目的片段，大小約527 bp，8份樣品PCR擴(kuò)增同時(shí)出現(xiàn)P. melanocephala和P. kuehnii目的片段（圖1）。所有陽(yáng)性樣品目的片段序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)在線Blast分析，證實(shí)為褐銹或黃銹病菌ITS序列，包括ITS1區(qū)（位于18S與5.8S rDNA之間）、ITS2區(qū)（位于5.8S與28S rDNA之間）的一部分序列和5.8S rDNA的全部序列。

2.2 甘蔗銹病病菌分布

根據(jù)甘蔗銹病樣品的地理來(lái)源，對(duì)我國(guó)主要蔗區(qū)銹病病原菌檢出率和地理分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表3），結(jié)果顯示，除了福建省福州甘蔗樣品僅檢測(cè)到褐銹病病菌外，其他?。▍^(qū)）廣東、廣西、云南、四川甘蔗樣品均檢測(cè)到2種銹病病原菌，其中廣東、廣西、四川樣品存在混合侵染現(xiàn)象。在33份陽(yáng)性樣品中，P. melanocephala和P. Kuehnii單獨(dú)侵染樣品檢出率分別為11.1%和19.8%，2種病原菌混合侵染樣品檢出率為9.8%。

2.3 甘蔗黃銹病菌的SNP多態(tài)性

已有報(bào)道PkPmF/PkPmR引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物（606 bp）第183個(gè)核苷酸存在SNP位點(diǎn)，為A或G堿基[2]。為此，對(duì)本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性的24份黃銹病樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆并測(cè)序。序列分析發(fā)現(xiàn)24份樣品PCR產(chǎn)物中第183個(gè)核苷酸為A堿基（183A）有29.2%，為G堿基（183G）有25.0%，而存在2種堿基（183A/G）有45.8%（圖2）。同一PCR產(chǎn)物同時(shí)存在183A或183G，可能由于2種類型的P. kuehnii病菌分離物同時(shí)侵染同一甘蔗品種（系）所致。

2.4 優(yōu)良甘蔗新品種（系）抗褐銹病基因Bru1的分子檢測(cè)

以我國(guó)各育種單位選育的40份甘蔗品種（系）的DNA為模板，抗褐銹病基因Bru1分子標(biāo)記R12H16-F/R12H16-R特異性引物檢測(cè)結(jié)果表明，有17個(gè)甘蔗品種（系）含有該基因（圖3-A），陽(yáng)性檢出率為42.5%；以另一對(duì)分子標(biāo)記特異性引物9020-F4-F/9020-F4-R進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)合RsaI限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析，含有該基因的甘蔗品種（系）陽(yáng)性樣品含有一條200 bp大小的特異性條帶（圖3-B），其檢出率與R12H16-F/R12H16-R分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果一致。

3 討論

我國(guó)蔗區(qū)銹病的發(fā)生以褐銹病為主，黃銹病是在上世紀(jì)80年代底在福建等蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)[9]。在云南西南濕熱蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)蔗茅柄銹菌（Puccinia erianthi Padw et Khan）引起了銹病[10-11]，但后來(lái)國(guó)外學(xué)者認(rèn)為蔗茅柄銹菌與黑頂柄銹菌屬于引起甘蔗褐銹病的同種病原菌[12-13]。本研究從我國(guó)5個(gè)?。▍^(qū)）蔗區(qū)采集了81份疑似銹病的甘蔗葉片樣品，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了福建福州葉片樣品沒(méi)有檢測(cè)到黃銹病菌，其他省份蔗區(qū)葉片樣品均檢測(cè)到黃銹病菌和褐銹病菌，且存在混合侵染現(xiàn)象。福州蔗區(qū)沒(méi)有檢測(cè)到黃銹病菌，可能由于采集樣品太少所致。

為了進(jìn)一步分析P. kuehnii病菌是否存在SNP位點(diǎn)，在Pk1-F/Pk1-R引物檢測(cè)P. kuehnii為陽(yáng)性的24份葉片樣品中，從它們的PCR產(chǎn)物克隆和測(cè)序分析得知目的片段第183個(gè)核苷酸存在SNP，183A、183G位點(diǎn)出現(xiàn)頻率分別為29.2%、25.0%，而同時(shí)存在2種類型183A/G的頻率為45.8%。同一葉片樣品存在2種類型P. kuehnii病菌分離物混合侵染，已排除因?yàn)镻CR擴(kuò)增、測(cè)序引起的誤差。Glynn等[2]利用PIRA-PCR方法檢測(cè)來(lái)自各國(guó)甘蔗銹病葉片樣品P. kuehnii病菌SNP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)自中國(guó)、澳大利亞的樣品P. kuehnii病菌存在183A或183G位點(diǎn)，而來(lái)自加勒比海盆地國(guó)家的樣品發(fā)現(xiàn)只有183A位點(diǎn)。同時(shí)，Glynn等[2]也對(duì)PkPmF/PkPmR引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，發(fā)現(xiàn)183A/183G等位位點(diǎn)頻率與PIRA-PCR方法檢測(cè)結(jié)果略有差異，這可能由于P. kuehnii病菌分離物183A/183G附近存在額外的差異堿基，導(dǎo)致PIRA-PCR方法無(wú)法檢測(cè)到這2種等位位點(diǎn)。

選育和推廣抗病品種是病害防治的最經(jīng)濟(jì)、最有效的方法。甘蔗為異源多倍體無(wú)性繁殖作物，基因型受環(huán)境條件影響較大，育種年限較長(zhǎng)，選育出1個(gè)優(yōu)良品種至少需要8～10年。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，利用與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可以作為甘蔗抗病分子育種重要的輔助手段。Daugrois[5]和Asnaghi[14]等分別在栽培品種R570上發(fā)現(xiàn)和定位甘蔗抗褐銹病主效基因Bru1，隨后，Costet等[6]開(kāi)發(fā)出2種與該基因密切相關(guān)的R12H16和9020-F4/RsaI分子標(biāo)記，研究發(fā)現(xiàn)在來(lái)自全球各蔗區(qū)的194份抗褐銹病材料中，有86%存在抗褐銹病基因Bru1，而感病材料均不含該基因。之后，許多學(xué)者將這2個(gè)分子標(biāo)記應(yīng)用于甘蔗品種及種質(zhì)資源[15]、雜交親本及其后代[4，7]、野生種質(zhì)資源[8]抗褐銹病材料的發(fā)掘、篩選和評(píng)價(jià)，認(rèn)為這些含有抗褐銹病基因Bru1的材料是選育抗褐銹病甘蔗品種很有利用前景的抗源種質(zhì)。本研究也利用R12H16和9020-F4/RsaI分子標(biāo)記對(duì)40個(gè)供試品種（系）開(kāi)展了抗褐銹病篩選，發(fā)現(xiàn)42.5%的品種（系）含有抗褐銹病基因Bru1，有意思的是，本實(shí)驗(yàn)中含有抗褐銹病基因Bru1的品種（系）均未檢測(cè)到P. melanocephala，然而這些供試材料的抗病性等級(jí)需要進(jìn)一步通過(guò)孢子懸浮液人工接種驗(yàn)證。

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