羅娜 周德明 徐睿 周國英

摘 要 為提高降香黃檀-檀香人工林的土壤肥力，從不同林齡的降香黃檀、檀香根際土壤中分離篩選高效解鉀菌。從鉀細(xì)菌富集培養(yǎng)基上初篩和解鉀菌篩選培養(yǎng)基復(fù)篩得到可培養(yǎng)物89個(gè)。采用原子吸收分光光度法測定菌株解鉀能力。結(jié)果表明，可溶性鉀含量在70 μg/mL以上的菌株有6株，其中菌株JT-K21、JT-K11和JT-K18的解鉀率為80%以上。JT-K21培養(yǎng)液的可溶性鉀含量高達(dá)132.68 μg/mL，解鉀率達(dá)到221.18%。基于形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rDNA序列比較分析，初步鑒定JT-K21為惡臭假單胞菌Pseudomonas putida。不同碳氮源試驗(yàn)表明：JT-K21對蔗糖和硫酸銨的吸收效果最好。通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)結(jié)果表明：菌株JT-K21液體發(fā)酵菌體濃度最大培養(yǎng)組最優(yōu)組分為蔗糖（10 g/L）、硫酸銨（0.2 g/L）、氯化鈉（0.1 g/L）、鉀長石（5 g/L）；JT-K21液體發(fā)酵解鉀活性最佳時(shí)，培養(yǎng)基最優(yōu)組分為蔗糖（10 g/L）、硫酸銨（0.2 g/L）、氯化鈉（0.1 g/L）、鉀長石（3 g/L）。

關(guān)鍵詞 降香黃檀；檀香；解鉀菌

中圖分類號 S792.28；S182 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract To improve the soil fertility of the mixed forests Dalbergia Odorifera and Santalum album L.， the high efficiency potassium utilization bacteria were isolated and screened from the rhizosphere soil of different ages of D. Odorifera and S. album L.. By potassium bacteria culture medium and potassium-releasing bacteria culture medium， 89 bacteria strains were obtained and cultivated. The ability of dissolving potassium of the 89 isolates were determined with the atomic absorption spectrophotometer method. As the results showed that six bacteria strains had the content of soluble potassium more than 70 μg/mL. Among them， the strains JT-K21， JT-K11 and JT-K18 were of the potassium solvability above 80%. The culture medium of JT-K21 with the soluble potassium content reached 132.68 μg/mL， potassium solvability reached 221.18%. Based on morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis， strains JT-K21 was preliminarily identified as Pseudomonas putida. As the result of carbon and nitrogen source test showed that： strains of JT-K21 had the best absorptive effect on sucrose and ammonium sulfate. By single factor and orthogonal test， when JT-K21 liquid fermentation cell concentration reached the maximum， the optimal culture medium component was sucrose（10 g/L）， ammonium sulfate（0.2 g/L）， sodium chloride（0.1 g/L）， feldspar（5 g/L）. When JT-K21 liquid fermentation dissolved potassium activity reached the highest， the optimal culture medium component was sucrose（10 g/L）， ammonium sulfate（0.2 g/L）， sodium chloride （0.1 g/L）， feldspar（3 g/L）.

Key words Dalbergia Odorifera；Santalum album L.；Potassium releasing bacteria

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.018

解鉀菌稱硅酸鹽細(xì)菌（Silicate bacteria），能有效分解含鉀礦物，利用磷、鉀等礦物元素；主要有土壤芽胞桿菌（Bacillus edaphicus）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）和膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）等[1]。鉀是作物營養(yǎng)的三要素之一，在植物生長發(fā)育的過程中，參與了60種以上酶系統(tǒng)的活化、光合作用以及同化產(chǎn)物的運(yùn)輸、碳水化合物的代謝和蛋白質(zhì)的合成等過程，同時(shí)還能增強(qiáng)作物的抗病蟲害、抗倒伏、抗旱和抗寒等抗逆能力。中國土壤中可溶性鉀資源匱乏，但是以鉀長石為主的難溶性硅鋁酸鉀資源存儲豐富，分布廣泛，南方儲存尤為豐富[2]。化學(xué)肥料雖然見效快、投入小，但易造成土壤結(jié)構(gòu)破壞、有機(jī)質(zhì)含量下降[3]，且污染環(huán)境。近年來發(fā)現(xiàn)，根際解鉀微生物與普通解鉀菌相比，它不僅能轉(zhuǎn)化土壤難溶性鉀、改造土壤結(jié)晶構(gòu)造[4]；還能分泌促生物質(zhì)，活化植物根際土壤微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)植物生長[5]。Sugumaran等[6]從土壤中篩選得到一株解鉀菌，其解鉀能力達(dá) 4.29 mg/L，將其施用于土壤中，使得土壤可溶性鉀上升至99.60 mg/kg，植物干重增大125%，有機(jī)質(zhì)增加35.41%。通過從特定植物根際分離篩選出高效解鉀菌，對于發(fā)展現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)具有十分重要的意義。

降香黃檀（Dalbergia odorifera），別名黃花梨，商品名Scentedroswood（香紅木），是原產(chǎn)于中國海南的一種豆科蝶形花亞科的常綠喬木，國家二級重點(diǎn)保護(hù)野生瀕危樹種，珍稀的紅木樹種，廣泛分布于中國海南、廣東等地及東南亞地區(qū)。因其生長緩慢、極難成材，是高檔家具、香料的重要原料及名貴的藥材來源，現(xiàn)已瀕臨滅絕。多年來中國林業(yè)部門在研究“降香黃檀”的育苗工作中曾投入了大量的人力、物力、財(cái)力，但成活率較低[7-8]。檀香（Santalum album Linn.）為半寄生樹種，其根部的木質(zhì)部能長出新組織進(jìn)入被寄主植物的木質(zhì)部形成吸盤，進(jìn)行水分和養(yǎng)分交換。無寄主的情況下幼年期的檀香可存活1 a左右，甚至生活更久，但通常有寄主的檀香會生長更好[9-11]。野生的降香黃檀、檀香多生長在較貧瘠的土壤環(huán)境中，人工移植后抗逆能力較差，為加快降香黃檀、檀香產(chǎn)業(yè)發(fā)展，縮短人工培育周期，增強(qiáng)植株抗逆能力，顯得尤為迫切。本研究從降香黃檀、檀香原產(chǎn)地海南降香黃檀、檀香主要種植區(qū)的土壤中分離篩選高效解鉀菌，并對其進(jìn)行鑒定，同時(shí)對菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，為研制降香黃檀、檀香專用生物肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品采自海南省降香黃檀、檀香主要種植區(qū)，利用五點(diǎn)隨機(jī)采樣法。用小鏟除掉表層土，取4、5、6、7、10年生的降香黃檀、檀香根際土壤（20～40 cm）。分別裝入保鮮袋（無菌）中，貼上標(biāo)簽，4 ℃保存帶回實(shí)驗(yàn)室分離。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 （1）鉀細(xì)菌富集培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，CaCO3 5.0 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaSO4.2H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，瓊脂18 g/L，去離子水，pH7.2。

（2）鉀細(xì)菌篩選培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，CaCO3 5.0 g/L，Na2HPO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaSO4·2H2O 0.2 g/L，鉀長石（K2O·Al2O3·6SiO2）粉（150 目） 2.5 g/L，瓊脂18 g/L，去離子水，pH7.2。

（3）LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂18 g/L，去離子水，pH7.2[12]。

1.2 方法

1.2.1 根際高效解鉀菌分離 分別稱取不同土樣10 g，置入裝有90 mL0.85%NaCl溶液的150 mL三角瓶中，轉(zhuǎn)速160 r/min，振蕩20 min后，制成均勻的土壤懸液。用10倍稀釋法依次配制10-1～10-6的濃度梯度樣液，取10-4、10-5、10-6 3個(gè)濃度梯度的樣液，用于分離解鉀菌。每次每個(gè)濃度樣液吸取100 μL，涂布于鉀細(xì)菌富集培養(yǎng)基上，3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)2 d左右。挑取圓形、透明、表面濕潤黏稠的大型菌落，進(jìn)行平板劃線純化，反復(fù)進(jìn)行 3次，同時(shí)用顯微鏡觀察菌落純度，直至獲得純培養(yǎng)，用LB斜面培養(yǎng)基4 ℃保存并做好標(biāo)記。

解鉀菌的復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)： 將種子液按5% 接種量接種到50 mL/250 mL解鉀復(fù)篩培養(yǎng)基，30 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)7 d。設(shè)加等量滅活種子液的對照處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。再用解鉀菌篩選培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，進(jìn)一步分離純化解鉀菌，挑選出長勢較好的單菌落，進(jìn)行保存并做好標(biāo)記。

1.2.2 菌株解鉀能力測定 將已滅菌的50 mL 解鉀液體培養(yǎng)基及2 mL菌懸液（108 cfu/mL）加入300 mL 三角瓶中，160 r/min，30 ℃培養(yǎng)5 d，并設(shè)置不接菌液的空白對照組。培養(yǎng)液經(jīng)1 000 r/min、4 ℃離心5 min，吸取4 mL上清液與4 mL 6 mmoL/L的LiCl充分混勻，采用原子吸收分光光度法測定待測菌株及空白組培養(yǎng)液的可溶性鉀含量[13]。

1.2.3 菌株鑒定 （1）菌株形態(tài)觀察：記錄待鑒定菌株在鉀細(xì)菌富集固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d的菌落特征，并觀察其菌體形態(tài)特征。

（2）生理生化特征：參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第八版）及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]，進(jìn)行細(xì)菌生理生化試驗(yàn)。

（3）16S rRNA 序列測定及分析：以待測細(xì)菌菌株基因組DNA為模板，選用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F和1 492R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min， 94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30個(gè)，72 ℃10 min。將所得產(chǎn)物樣品送至上海博尚生物技術(shù)公司測序，測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，利用EGA5.05軟件，使用Neighbor-Joining法進(jìn)行計(jì)算分析（Bootstraps=1 000），構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹[15]。

1.2.4 功能菌株生長曲線測定 按5%的接種量將JT-K21菌液加入到解鉀菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中裝液量為100 mL/250 mL，保證菌液濃度為108 cfu/mL。在160 r/min 30 ℃培養(yǎng)48 h，間隔4 h取樣一次，測定培養(yǎng)樣液的OD值。

1.2.5 不同碳氮源對菌株活性的影響 采用試驗(yàn)效果最佳的菌群組合，研究不同碳氮源對菌株活性的影響（增設(shè)對照組）。選取不同碳氮源進(jìn)行液體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，其中不同碳源為葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉及甘露糖，不同氮源為酵母膏、氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、蛋白胨。用原子分光光度法測定解鉀菌培養(yǎng)液的可溶性鉀含量，并測定菌體濃度OD值。

1.2.6 培養(yǎng)基正交試驗(yàn) 以上述碳氮源實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)。將解鉀菌接種于裝有已滅菌的100 mL解鉀菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃ 160 r/min培養(yǎng)4 d?？扇苄遭浐坑迷臃止夤舛确y定，同時(shí)測定菌體濃度OD值，以確定最優(yōu)培養(yǎng)基成分配比。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和多重比較（LSD法和Duncan檢驗(yàn)）等，并用Excel 2010制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際高效解鉀細(xì)菌的分離、篩選

2.1.1 解鉀菌的分離純化 不同林齡（3、4、5、6、7、10年）的降香黃檀、檀香根際土壤，共純化出可培養(yǎng)物89個(gè)。菌落呈近圓形或橢圓形、白色或灰白色、半透明或不透明、大部分邊緣規(guī)則、生長速度中等。

2.1.2 菌株解鉀能力測定 由表1可知，對照組的可溶性鉀含量為41.31 μg/mL?？扇苄遭浐吭?0 μg/mL以上的菌株有6株，解鉀率在80%以上的菌株有3株，分別為菌株JT-K21、JT-K11及JT-K18，其中JT-K21培養(yǎng)液的可溶性鉀含量最高，高達(dá)132.68 μg/mL，解鉀率為221.18%。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察 在鉀細(xì)菌富集固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，菌株JT-K21的菌落呈淡白色，不透明，表面光滑，扁平，邊緣模糊，生長較快。JT-K21革蘭氏染色均呈陰性，無芽孢，桿狀，單個(gè)或成對排列，大小為（1.4～2.1）μm×（0.6～0.8）μm（圖1～2）。

2.2.2 菌株生理生化 JT-K21具有運(yùn)動(dòng)性，可利用葡萄糖、蔗糖，過氧化氫反應(yīng)、硫化氫試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)呈陽性，可水解明膠、淀粉，還原硝酸鹽，其余生理生化測定指標(biāo)見表2。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化指標(biāo)，初步判斷JT-K21屬于假單胞菌科，假單胞菌屬。

2.2.3 16S rRNA基因序列測定及分析 測序所得的功能菌株16S rDNA序列長度均在1 500 bp左右，將各菌株序列在NCBI中進(jìn)行BLAST同源性比較，同時(shí)與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，其中JT-K21與Pseudomonas putida（KF 831377）的同源性均達(dá)99%。篩選出有較高同源性的代表菌株，以各根際土壤功能菌的16S rRNA序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建各自的系統(tǒng)進(jìn)化樹。JT-K21與假單胞菌屬聚在同一族群，與Pseudomonas putida的遺傳進(jìn)化距離最近（圖3）。綜合各菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rRNA序列分析結(jié)果，初步鑒定菌株JT-K21為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。同時(shí)在GenBank中注冊得到菌株JT-K21的16S rRNA基因序列登錄號為KP216612。

2.2.4 菌株生長曲線 經(jīng)光譜掃描，菌株JT-K21在660 nm處吸光值最大。由圖4可知，培養(yǎng)12 h后，菌株JT-K12進(jìn)入對數(shù)生長期，24 h后處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)40 h后轉(zhuǎn)入衰退期，菌株JT-K21整體增長速度相對緩慢。

2.2.5 不同碳氮源對菌株的影響 由圖5可知，解鉀菌對蔗糖的吸收效果最好，此時(shí)培養(yǎng)液中菌體濃度及可溶性鉀含量最高，而解鉀菌對淀粉的吸收效果最差。說明同碳源對菌群活性產(chǎn)生不同的影響，結(jié)構(gòu)簡單的單糖更易于菌群吸收營養(yǎng)，從而更好地進(jìn)行細(xì)胞代謝活動(dòng)。

由圖6可知，以銨鹽（硫酸銨、氯化銨）為氮源時(shí)，更有利于菌群的營養(yǎng)吸收；硝酸鹽（硝酸鈉、硝酸鉀）的吸收效果比有機(jī)氮源（酵母膏、蛋白胨）好；解鉀菌JT-K21對硫酸銨的吸收效果最好，對蛋白胨的吸收效果最差。

2.2.6 培養(yǎng)基正交試驗(yàn) 由表3可知，各因素對解鉀菌菌體濃度的影響程度，依次為蔗糖>硫酸銨>氯化鈉>鉀長石；若使解鉀菌菌體濃度最大，則培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為蔗糖（10 g/L）、硫酸銨（0.2 g/L）、氯化鈉（0.1 g/L）、鉀長石（5 g/L）。各因素對解鉀菌發(fā)酵液中可溶性鉀含量的影響程度，依次為蔗糖>硫酸銨>鉀長石>氯化鈉；若使解鉀菌發(fā)酵液中可溶性鉀含量最大，則培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為蔗糖（10 g/L）、硫酸銨（0.2 g/L）、氯化鈉（0.1 g/L）、 鉀長石（3 g/L）。綜合考慮，在解鉀菌K21的菌體濃度最大化的基礎(chǔ)上，提高其解鉀活性，故最終選擇最優(yōu)組合（L2）。

3 討論與結(jié)論

根際解鉀菌不僅可以改良土壤結(jié)構(gòu)、降解有毒物質(zhì)，還可以促進(jìn)植物生長、防治植物病害[16-17]。目前有關(guān)與解鉀菌的解鉀機(jī)制，大部分研究認(rèn)為解鉀菌通過分泌酸性代謝物來酸溶及絡(luò)合難溶性礦物質(zhì)，導(dǎo)致晶格結(jié)構(gòu)被破壞，使得鉀、磷等元素游離出來[18-19]，調(diào)節(jié)土壤理化性質(zhì)，從而改良土壤結(jié)構(gòu)。而另一部分研究發(fā)現(xiàn)解鉀微生物通過分泌酸性物質(zhì)分解硅酸鹽中的Si-O-Si鍵，破壞晶體結(jié)構(gòu)，使得鉀、鎂等元素游離[20]。

近年來有研究表明，包括根際解鉀菌在內(nèi)的根際土壤功能菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生生長激素、增強(qiáng)植物對環(huán)境的忍耐力及對病原菌的抗性[21-22]，以達(dá)到促生防病的作用。雖然解鉀菌有改良土壤環(huán)境、促生防病等作用，但由于氣候、土壤類型及理化結(jié)構(gòu)、植物品系的不同，使得從植物根際土壤分離出的解鉀菌的解鉀能力存在較大差別。如盛下放等[23-24]分離篩選的解鉀硅酸鹽細(xì)菌NBT 菌株，其釋鉀量較對照增加了226.0%；而李新新等[25]從江西紅壤中篩選到一株類芽孢桿菌屬的解鉀菌株G4，其解鉀效率為27.62%。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，解鉀率在80%以上的菌株有3株（菌株JT-K21、JT-K11、JT-K18），而菌株JT-K21解鉀率達(dá)到221.18%。JT-K21的最佳培養(yǎng)基組分為蔗糖10 g/L，CaCO3 5.0 g/L，Na2HPO4 0.2 g/L，（NH4）2SO4 0.2 g/L， MgSO4·7H2O 0.3 g/L， NaCl 0.2 g/L， CaSO4·2H2O 0.2 g/L， 鉀長石粉（150 目）5 g/L，去離子水。下一步將對菌株JT-K21的液體發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以便降低大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)成本，有利于專用生物復(fù)合肥的推廣與應(yīng)用，從而改善人工種植降香黃檀、檀香的根際微生態(tài)環(huán)境。

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