姜科植物染色體制片方法的優(yōu)化

涂紅艷 張愛玲 肖望 陳丹 曾海敏

摘 要 以白姜花根尖為材料，通過預處理、固定、解離和染色等步驟，對染色體制片技術進行改良，得到了一種簡單高效的可用于植物染色體數(shù)目分析的制片技術，主要步驟包括“取材-酸解離-低滲-染色-壓片”。采用改良技術得到的制片細胞膨大、染色體分散、形態(tài)清晰、分色良好。用該方法對白姜花、金姜花、所羅門姜黃和紅艷郁金等的體細胞染色體數(shù)目進行檢測，結果分別如下：白姜花2n=34，金姜花2n=34，所羅門姜黃2n=63，紅艷郁金2n=49。

關鍵詞 白姜花；染色體制片；染色體數(shù)目

中圖分類號 Q949.718.33 文獻標識碼 A

Abstract Plant chromosome analysis technology is the most common and useful method in cytogenetics research. In the present study，three methods for plant chromosome preparation of Hedychium coronarium were compared including material pretreatment，fixation，dissociation and dyeing on the root tips. The results showed that the best experimental protocol for chromosome number analysis was ‘sample selection，acid dissociation，hypotonic，staining with improve phenol fuchsin，chromosome slide preparation，and the best dissociation way was with 37% HCl ∶ 95% C2H5OH=1 ∶ 3 at 28-30 ℃ for 6 min. Clear metaphase chromosome images with large cells，spreading and clear chromosome were obtained with the improved method. Subsequently，this method was applied to analyze the somatic chromosome numbers of H. coronarium，H. gardnerianum，Curcuma soloensis，Curcuma rubescens at metaphase，which were 2n=34，2n=34，2n=63，2n=49 respectively.

Key words Hedychium coronarium；Chromosome preparation；Chromosome number

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.026

姜科（Zingiberaceae）植物是熱帶、亞熱帶的特有植物，全世界約有50屬1 500種[1]，其中中國約19屬143種，主要分布在西南部至東部，姜科植物具較好的藥用、香料、調(diào)味、觀賞等價值，且資源豐富[2]。

植物染色體制片技術是植物細胞遺傳學、染色體工程、植物細胞生物學、植物細胞分類學等學科的基本實驗技術。植物染色體的數(shù)目、組型分析對于研究植物的分類、起源和演化都有重要的意義[3]。目前對國產(chǎn)姜科植物的染色體研究已開展了很多[1，4-5]，但仍有很多種類尚未有染色體資料或者結論多樣。以白姜花（Hedychium coronarium）為例，不同學者對其染色體數(shù)目進行分析得出不同的結果，分別為34[4，6-8]、51[9]、54[10]。結果的不同可能與取材和實驗方法有關。目前國內(nèi)外常用的染色體制片技術為2種，分別是壓片技術和去壁低滲干燥技術。壓片技術操作快速簡單，但制片得到的染色體多交聯(lián)重疊，如胡秀等[7]以根尖為材料，利用壓片技術對白姜花染色體數(shù)目進行分析，發(fā)現(xiàn)即使制片圖像良好，也總是有幾條染色體相互貼近，難于對其進行準確的計數(shù)。采用去壁低滲干燥技術制片，染色體分散性好，但操作繁瑣、技術要求高，如陳瑞陽[8-9]以白姜花根尖為材料，結果得到分散性好的染色體圖譜。

本研究分別以姜科植物白姜花（Hedychium coronarium）、金姜花（Hedychium gardnerianum）、 所羅門姜黃（Curcuma soloensis）和紅艷郁金（Curcuma rubescens）根尖為材料，將去壁低滲干燥技術中的后低滲程序結合到壓片技術中，同時結合優(yōu)化的解離方法，旨在建立一種適合于姜科植物染色體數(shù)目分析的改良制片技術，為姜科植物的遺傳育種提供細胞學研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料白姜花購自廣州芳村嶺南花卉市場，將其根狀莖埋于沙土中進行催根；所羅門姜黃、金姜花和紅艷郁金采自廣州市農(nóng)業(yè)技術推廣中心，將其種植于本課題組試驗田，取根狀莖埋于沙土中進行催根。

1.2 方法

1.2.1 取材 上午9∶00～10∶30，分別取白姜花、金姜花、所羅門姜黃、紅艷郁金的白嫩根尖泡于冰水混合物中，帶回實驗室，洗干凈后用于制片。

1.2.2 常規(guī)制片技術 具體步驟及方法見表1[11]。

1.2.3 去壁低滲干燥技術 具體步驟及方法見表2[8]。

1.2.4 改良的制片技術 將去壁低滲干燥技術的后低滲程序加入到壓片技術中，具體方法見表3。

1.2.5 不同解離液對制片的影響 配制不同成分的解離液，研究解離液的組成和解離溫度對制片的影響，解離液的組成見表4。

2 結果與分析

2.1 不同方法所得白姜花染色體制片比較

利用常規(guī)的壓片技術進行制片，解離后材料較硬，細胞很難分散開，無法把細胞壓到同一個平面，因此也無法制得能觀察到染色體的清晰圖像（圖1-A）。采用去壁低滲干燥技術時，經(jīng)酶解去壁、低滲干燥后能制得分散性好的染色體裝片，且染色效果好，制得的圖片染色體圖像清晰（圖1-B），但該技術操作程序復雜，技術難度大，耗時長，耗材昂貴。利用改良制片技術簡單快速、耗材少，但實驗效果與去壁低滲干燥技術相當，細胞較為膨大，染色體分散性好，且形態(tài)清晰、分色良好，細胞能輕易被壓到同一平面（圖1-C）。

2.2 不同解離方法對白姜花細胞大小和染色體分散程度的影響

對不同解離方法得到的白姜花細胞大小和染色散開區(qū)域大小的數(shù)據(jù)分別進行差異性分析。結果顯示（表5），采用方法B、C、D，即解離液中37%HCl與95%乙醇的比值為1 ∶ 1、1 ∶ 2與1 ∶ 3時，實驗結果沒有顯著差異；但采用方法E、F，即解離液中37%HCl與95%乙醇比值為1 ∶ 4、1 ∶ 5時，與采用方法D（比值為1 ∶ 3的解離液）的實驗結果存在顯著差異。解離液中37%HCl與95%乙醇的比值為1 ∶ 3時，解離效果最好，制片質(zhì)量最高。對比常規(guī)方法A（即解離液組成為1 mol/L HCl，于60 ℃解離6 min），方法D[即解離液中37% HCl與95% 乙醇比值為1 ∶ 3，于常溫（28～30 ℃）下解離6 min]所得的細胞體積擴大到原來的1.5倍，染色體分散區(qū)域擴大了1.6倍（表5），這表明解離液的組成以及解離方法會直接影響到制片的效果。

不同的解離方法所得到的實驗效果存在明顯的差異。6種解離方法中，白姜花染色體制片的最適解離方法為D，即37% HCl與95%乙醇比值為1 ∶ 3，制片得到的細胞較大，染色體染色深、分散性好，容易被壓在同一平面，且結構完整、著絲點清晰可見（表5，圖2-D）。白姜花的染色體數(shù)為2n=34，這與之前幾位學者的研究結果相符[4，6-8]。

在濃度較高的HCl下解離，細胞壁被分解軟化，低滲后細胞膨脹較明顯（圖2-B、C、D），染色體分散。但HCl濃度太高，易導致染色體斷裂成小片段（圖2-B），無法準確判斷染色體的數(shù)目。而采用低濃度HCl時，無法使細胞壁軟化，染色體很難被壓到同一平面（圖2-A），染色體多重疊交聯(lián)、分散性差（圖2-E、F）。

2.3 改良制片技術獲得的幾種姜科植物染色體數(shù)目

分別利用改良制片技術對金姜花、所羅門姜黃和紅艷郁金的染色體數(shù)目進行研究，均獲得了分散度高、染色清晰的圖像，如圖3所示。從實驗結果分析可知，金姜花的染色體數(shù)目為2n=34（圖3-A），所羅門姜黃的染色體數(shù)為2n=63（圖3-B），這與Skornickova等[12]的報道一致；紅艷郁金的染色體數(shù)目為2n=49條（圖3-C）。

3 討論與結論

染色體壓片技術是以人工外加的機械壓力而使染色體分散[11]，去壁低滲干燥技術是以酶分解細胞壁，再用低滲液使細胞吸脹，經(jīng)火焰干燥時借用水的表面張力使染色體分散開[8]。本研究在常規(guī)壓片技術的基礎上加入了去壁低滲干燥技術中的低滲程序，目的是使細胞吸水膨脹，染色體分散到細胞質(zhì)中，制片時便于使染色體分散開。在解離過程中，HCl起到分解細胞壁的果膠物質(zhì)和部分細胞質(zhì)的作用，從而使細胞易于分散，同時，HCl也可以使細胞壁適度軟化便于壓片。用HCl解離除了成本低外，解離后還能使細胞保留部分細胞壁成分，確保細胞不會因低滲過度而脹破并影響染色體的分辨。但是HCl對細胞壁的軟化程度直接影響到低滲的效果，濃度過高時容易導致染色體嚴重受損甚至完全分解；濃度過低又使細胞難以分散，導致低滲沒有任何效果。本研究采用添加乙醇的方法對HCl解離的最適濃度進行了梯度設計和分析，得到了最適合用于酸解的HCl與乙醇的比例。

在改良制片技術中采用了改良苯酚品紅染液，其具有染色快、著色深、適應性廣的特點，適合于多數(shù)植物根尖、幼芽、花藥以及細胞愈傷組織染色[13]。同時，由于其本身也是固定液，因此省去了固定材料的程序。經(jīng)固定的材料，細胞更松軟，更便于壓片。

采用去壁低滲干燥法制片需要通過預處理獲得較多的中期分裂相，以促進染色體的收縮，使染色體變得短而粗。之前姜科植物染色體制片中多采用預處理這一步驟，如陳瑞陽[8]用秋水仙素預處理白姜花根尖3.5 h，Skornickova等[12]用二氯苯飽和溶液預處理姜黃根尖3 h，李維秀等[5]用8-羥基喹啉預處理10種姜科植物根尖4 h。上述預處理所耗時間較長，且預處理藥物濃度使用不當會對細胞產(chǎn)生毒害作用，如秋水仙素會引起多倍體的產(chǎn)生，8-羥基喹啉會引起染色體排列紊亂。本研究采用的改良制片技術，去除了預處理這一步驟，直接取材、酸解離、低滲、染色和壓片，方法簡便快速，并減少了對細胞的毒害作用，但實驗效果與去壁低滲干燥技術相當，且細胞膨大、染色體分散性好、形態(tài)清晰、分色良好。

根尖染色體計數(shù)是鑒定植株染色體數(shù)最常用最可靠的方法之一。胡秀等[7]利用小孢子母細胞為材料對白姜花進行染色體分析，從實驗材料方面對白姜花的染色體數(shù)目研究方法進行了改良。但植物的染色體數(shù)一般以體細胞染色體數(shù)目為準，處于減數(shù)分裂期的細胞， 由于價體分析難以保證準確，所以，除苔鮮和蕨類等因材料所限而用減數(shù)分裂細胞計數(shù)染色體外，針對其他植物，則一般只宜將其作為輔助計數(shù)材料[14]，利用根尖進行染色體計數(shù)仍然是最理想的方法。

參考文獻

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