阿吾提·艾買爾 古力齊曼·阿布力孜 迪麗努爾·馬里克

摘要：【目的】優(yōu)化野薔薇根多糖的過氧化氫（H2O2）法脫色工藝條件，為野薔薇根多糖的脫色純化提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳砸八N薇根為試驗(yàn)材料，以多糖脫色率和保留率為考察指標(biāo)，利用響應(yīng)曲面法對H2O2法脫色野薔薇根多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化?！窘Y(jié)果】通過響應(yīng)曲面法建立野薔薇根多糖脫色的回歸模型為：Y=94.84+3.08A+1.83B+0.88C+0.17AB+0.23AC-0.055BC-3.17A2-1.31B2-0.87C2（Y為多糖脫色率，A為H2O2體積分?jǐn)?shù)、B為溶液pH、C為脫色時(shí)間），該模型擬合度較好。H2O2法脫色野薔薇根多糖的最佳工藝條件為：H2O2體積分?jǐn)?shù)35.0%、溶液pH 9.00、脫色時(shí)間4.5 h，在此條件下多糖脫色率和保留率分別為95.48%和75.17%，脫色率與理論值96.55%的相對誤差為1.11%。H2O2體積分?jǐn)?shù)、溶液pH和脫色時(shí)間3個(gè)因素對野薔薇根多糖脫色效果均有極顯著影響（P<0.01）?！窘Y(jié)論】H2O2脫色法具有操作簡便、脫色效果明顯、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可對野薔薇根多糖進(jìn)行有效脫色。

關(guān)鍵詞： 野薔薇根；多糖；脫色；過氧化氫；響應(yīng)曲面法

中圖分類號： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）04-0629-06

0 引言

【研究意義】野薔薇（Rosa multiflora Thunb）具有一定的健脾理氣、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、助消化等作用，廣泛用于胃功能失調(diào)、慢性氣管炎、腸炎等疾病治療（劉士俠和叢者福，2000）。野薔薇根中含有多種有效成分，如多酚、黃酮、皂苷、多糖等（李延芳等，2002；其買古麗·阿沙木等，2013）。多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗病毒、降血脂、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化、抑菌等作用（李明春等，2010；周妍等，2010；黃秀香等，2013）。植物多糖在制備過程中，常因?yàn)橹参锉旧砗写罅可仡愇镔|(zhì)而使浸提液呈現(xiàn)不同顏色，即使經(jīng)乙醇沉淀，得到的粗多糖中仍含有色素，影響多糖質(zhì)量及其應(yīng)用。因此，在多糖的分離純化過程中，有必要對多糖進(jìn)行脫色?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，常見的脫色方法主要有活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法、過氧化氫（H2O2）脫色法等（李敏晶等，2014）。楊云等（2004）分別以多糖含量、多糖提取率和脫色率為指標(biāo)研究活性炭法對大棗渣多糖的脫色效果，通過正交試驗(yàn)法對脫色條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果多糖提取率、多糖含量及脫色率分別為30.8%、54.6%和31.2%。李元元等（2012）采用活性炭法對沙棗多糖進(jìn)行脫色，得到脫色率為45.52%。李小蓉等（2013）用水提法提取倒卵葉五加多糖，分別采用H2O2法和大孔樹脂法對其進(jìn)行脫色，其中H2O2法的多糖脫色率和保留率分別為84.45%和90.94%，大孔樹脂法的多糖脫色率和保留率分別為79.50%和82.80%。何釗等（2014）利用大孔樹脂法對白蠟蟲多糖進(jìn)行脫色，在最佳脫色條件下得到白蠟蟲多糖脫色率為71.4%，多糖回收率為60.0%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】H2O2脫色法操作簡單、脫色效果明顯、成本低、適于大規(guī)模生產(chǎn)（汪鵬榮等，2012），但目前尚無利用此法對野薔薇根多糖進(jìn)行脫色的相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以野薔薇根多糖為研究對象，以野薔薇根多糖脫色率和保留率為考察指標(biāo)，對H2O2脫色法進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，確定最佳脫色工藝條件，為野薔薇根多糖的脫色純化提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

野薔薇根采自新疆巴楚縣，由新疆大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院努爾拜·阿布都沙勒克教授鑒定為野薔薇的干燥根。葡聚糖、95%乙醇、H2O2、苯酚、石油醚、濃硫酸、正丁醇、三氯甲烷等試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：XH-300B型微波超聲波組合合成/萃取儀（北京樣祥鵠科技發(fā)展有限公司）、UV-2100紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）、SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、AL204型電子天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]、HFP-200型高速多功能粉碎機(jī)（永康市紅太陽機(jī)電有限公司）、ZHWY-110X型恒溫水浴振蕩搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1. 2 樣品預(yù)處理

取一定量野薔薇根，粉碎后過16目篩，用石油醚脫脂，干燥后用密封袋包裝，置于干燥器內(nèi)備用。

1. 3 野薔薇根多糖提取

準(zhǔn)確稱取樣品20 g，按30倍量加入去離子水，在微波功率300 W、提取溫度80 ℃的條件下，置于超聲—微波協(xié)同萃取儀中提取20 min；趁熱減壓抽濾提取液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至適當(dāng)體積，取濾液，加入4倍體積的95%乙醇沉淀，放置過夜，離心，棄上清液，得到的沉淀即為粗多糖；再用去離子水將其溶解，加入Sevag試劑脫去蛋白，過濾，取其濾液，用去離子水定容于容量瓶中，即得粗多糖溶液。

1. 4 野薔薇根多糖含量測定

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡聚糖0.010 g，溶于100 mL容量瓶中，定容，搖勻，配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取此溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mL置于10.0 mL具塞比色管中，用去離子水補(bǔ)足至2.0 mL，再加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL濃硫酸，搖勻，室溫放置20 min后置于沸水加熱15 min，取出冷卻30 min，于488 nm處測其吸光值，以去離子水作空白。以吸光值y和葡萄糖質(zhì)量濃度x計(jì)算回歸方程，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0667x+0.005786（R=0.9994）。精密吸取粗多糖溶液2.0 mL，按照上述方法測定脫色前后的野薔薇根多糖含量。多糖保留率計(jì)算公式為：

多糖保留率（%）=脫色后多糖含量/脫色前多糖含量×100

1. 5 單因素試驗(yàn)

配制成0.5 mg/mL的多糖溶液，移取10.0 mL，加入H2O2，以氨水調(diào)節(jié)溶液pH，于50 ℃下水浴加熱一定時(shí)間后，在450 nm波長處測定吸光值，考察H2O2體積分?jǐn)?shù)、溶液pH和脫色時(shí)間3因素對多糖脫色率的影響。脫色率的計(jì)算公式為：

脫色率（%）=（A前-A后）/A前×100

式中，A前、A后分別為脫色前后野薔薇根多糖溶液在450 nm波長處的吸光值。

1. 6 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以H2O2體積分?jǐn)?shù)、溶液pH和脫色時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以野薔薇根多糖脫色率和保留率為影響值，采用Design-Expert 8.0.5軟件中的Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對試驗(yàn)的各因素進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

利用Design-Expert 8.0.5和Origin 8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 1. 1 H2O2體積分?jǐn)?shù)對野薔薇根多糖脫色效果的影響 在固定溶液pH 9.00、脫色時(shí)間3.0 h的條件下，考察不同H2O2體積分?jǐn)?shù)（5.0%、10.0%、20.0%、30.0%和40.0%）對野薔薇根多糖脫色效果的影響。由圖1可知，隨著H2O2體積分?jǐn)?shù)的增大，野薔薇根多糖脫色率逐漸升高；當(dāng)H2O2體積分?jǐn)?shù)大于30.0%后，脫色率緩慢升高，但多糖保留率一直降低。這是因?yàn)镠2O2對野薔薇根多糖具有較強(qiáng)的氧化作用，從而破壞多糖結(jié)構(gòu)，因此H2O2體積分?jǐn)?shù)以30.0%左右為宜，此時(shí)多糖保留率為78.84%。

2. 1. 2 溶液pH對野薔薇根多糖脫色效果的影響

在固定H2O2體積分?jǐn)?shù)30.0%、脫色時(shí)間3.0 h的條件下，考察不同溶液pH（8.00、8.50、9.00、9.50和10.00）對野薔薇根多糖脫色效果的影響。由圖2可知，隨著溶液堿性的增強(qiáng)，野薔薇根多糖脫色效果越來越好。這是由于野薔薇根多糖為弱酸性，在堿性條件下能促進(jìn)H2O2分解生成HO2-，HO2-與有機(jī)物的發(fā)色基團(tuán)作用，破壞發(fā)色基團(tuán)從而起到脫色作用。當(dāng)溶液pH大于9.00時(shí)，脫色率已達(dá)較高值，說明此時(shí)H2O2分解趨于平衡，對野薔薇根多糖的脫色能力也趨于穩(wěn)定；同時(shí)，溶液堿性過強(qiáng)也可能促使多糖分解，從而導(dǎo)致多糖保留率急劇降低。因此，溶液pH控制在9.00左右為宜，在此條件下多糖保留率為78.72%。

2. 1. 3 脫色時(shí)間對野薔薇根多糖脫色效果的影響

在固定H2O2體積分?jǐn)?shù)30.0%、溶液pH 9.00的條件下，考察不同脫色時(shí)間（2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 h）對野薔薇根多糖脫色效果的影響。由圖3可知，脫色時(shí)間越長，脫色率越高；當(dāng)脫色4.0 h時(shí)，脫色率基本達(dá)最高值，此后隨著脫色時(shí)間的延長，脫色率無明顯變化，但多糖保留率明顯降低。故脫色時(shí)間以4.0 h為宜，此時(shí)多糖保留率為76.27%。

2. 2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化野薔薇根多糖脫色工藝

2. 2. 1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果 利用Design-Expert 8.0.5軟件對響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果（表2）進(jìn)行多元回歸擬合，得到野薔薇根多糖脫色率（Y）對H2O2體積分?jǐn)?shù)（A）、溶液pH（B）、脫色時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=94.84+3.08A+1.83B+0.88C+0.17AB+0.23AC-0.055BC-3.17A2-1.31B2-0.87C2。

對回歸模型及其系數(shù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見表3。由表3可知，模型P<0.01，表明回歸模型極顯著；回歸方程的失擬項(xiàng)P>0.05，差異不顯著，說明模型選擇合適；模型的R2=0.9974、R2Adj=0.9927，說明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值間線形關(guān)系顯著，試驗(yàn)誤差小，可用于野薔薇根多糖脫色試驗(yàn)的理論預(yù)測。此外，模型一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對野薔薇根多糖脫色效果的影響均為極顯著（P<0.01，下同）；交互項(xiàng)的影響均不顯著（P>0.05，下同）。

2. 2. 2 響應(yīng)曲面與等高線分析 根據(jù)回歸模型繪制的響應(yīng)面圖形是三維空間的曲面圖及二維平面上的等高線圖，可以直觀反映各因素對響應(yīng)值的影響，分析出因素間的交互作用，如等高線為橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則與之相反，同時(shí)等高線的密集程度可以判定兩交互因素中對響應(yīng)值影響較大的因素。由圖4～6可知，脫色率隨著H2O2體積分?jǐn)?shù)和溶液pH的增大及脫色時(shí)間的延長而提高，同時(shí)導(dǎo)致多糖保留率降低，因此，應(yīng)合理控制H2O2體積分?jǐn)?shù)、溶液pH和脫色時(shí)間。兩因素間的交互作用均不顯著，各因素的影響均達(dá)極顯著水平，影響程度的排序?yàn)椋篐2O2體積分?jǐn)?shù)>溶液pH>脫色時(shí)間，與交互項(xiàng)及一次項(xiàng)P的分析結(jié)果一致。

2. 3 脫色參數(shù)的優(yōu)化與模型驗(yàn)證試驗(yàn)

2. 3. 1 最佳脫色條件 利用Design-Expert 8.0.5軟件對回歸模型進(jìn)行分析，得到野薔薇根多糖脫色的最佳條件為：H2O2體積分?jǐn)?shù)35.24%、溶液pH 9.36、脫色時(shí)間4.55 h，在此條件下野薔薇根多糖脫色率預(yù)測值為96.55%。

2. 3. 2 回歸模型驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 為了檢驗(yàn)所得試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件對野薔薇根多糖進(jìn)行脫色，考慮到實(shí)際操作的便利，將優(yōu)化工藝參數(shù)修正為：H2O2體積分?jǐn)?shù)35.0%、溶液pH 9.00、脫色時(shí)間4.5 h，在此修正條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，實(shí)際測得的平均脫色率為95.48%，與預(yù)測值相比，相對誤差為1.11%，多糖保留率為75.17%。說明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化多糖脫色工藝的實(shí)際性較高。

3 討論

脫色是多糖分離純化中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，目前多糖脫色的方法主要有活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法、H2O2脫色法等。陳建等（2010）通過對比H2O2脫色法和大孔樹脂法對香菇多糖的脫色效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用H2O2脫色所得的香菇多糖外觀好，且工藝簡單，多糖保留率高。宿瑋等（2011）利用樹脂D392對海地瓜多糖進(jìn)行脫色，在優(yōu)化后的工藝條件下得到多糖脫色率為84.2%、多糖保留率為82.9%。彭友舜等（2014）采用活性炭法對蘆筍多糖進(jìn)行脫色，脫色率為67%、多糖保留率為56%。對比這3種脫色方法發(fā)現(xiàn)，活性炭法脫色效率較低，糖損失量大，且活性炭法脫色后的溶液中活性炭殘?jiān)y以完全去除；樹脂脫色效果較好，但樹脂價(jià)格較高，且需再生使用，生產(chǎn)周期較長，僅適合少量樣品的脫色；H2O2脫色法的多糖脫色率和多糖保留率較高，成本低，且操作簡單。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化野薔薇根多糖的H2O2法脫色工藝，并建立了野薔薇根多糖脫色率與H2O2體積分?jǐn)?shù)、pH及脫色時(shí)間之間的二次多項(xiàng)回歸模型；利用該模型優(yōu)化得到的最佳脫色工藝條件為：H2O2體積分?jǐn)?shù)35.0%、溶液pH 9.00、脫色時(shí)間4.5 h，在此條件下野薔薇根多糖脫色率和保留率分別為95.48%和75.17%，脫色率與理論值96.55%的相對誤差為1.11%，高于李元元等（2012）利用活性炭法、何釗等（2014）利用大孔樹脂法得到的多糖脫色率?？梢?，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化的H2O2法脫色條件準(zhǔn)確可靠，脫色效果明顯，可用于野薔薇根多糖的實(shí)際脫色。

黎國慶等（2013）采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化H2O2脫色法對油茶多糖的脫色工藝，得到多糖脫色率為97.06%，但未對多糖保留率進(jìn)行研究。沈巳焱等（2013）采用H2O2脫色法對紅松松塔多糖進(jìn)行脫色，并通過正交試驗(yàn)法優(yōu)化其脫色工藝，在優(yōu)化條件下多糖脫色率為95.62%，多糖保留率為61.00%～67.00%。與正交試驗(yàn)法相比，響應(yīng)曲面法提供了有效的試驗(yàn)方法，各因素間的交互更均勻，通過此法可尋找出最優(yōu)試驗(yàn)條件以大幅度降低開發(fā)的時(shí)間和成本，使產(chǎn)品具有更高的可靠性，從而提高產(chǎn)出率，減少不良品。本研究的二次多項(xiàng)回歸模型顯著性分析結(jié)果表明，H2O2體積分?jǐn)?shù)、溶液pH和脫色時(shí)間3個(gè)因素對野薔薇根多糖脫色率均有極顯著影響，影響排序?yàn)椋篐2O2體積分?jǐn)?shù)>溶液pH>脫色時(shí)間；但雙因素交互作用對脫色率的影響均不顯著。脫色率隨著H2O2體積分?jǐn)?shù)和溶液pH的增大及脫色時(shí)間的延長而提高，同時(shí)多糖保留率逐漸降低，是因?yàn)镠2O2具有較強(qiáng)的氧化作用，導(dǎo)致多糖分解，因此在使用時(shí)須合理控制試驗(yàn)條件。

4 結(jié)論

H2O2脫色法具有操作簡便、脫色效果明顯、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可對野薔薇根多糖進(jìn)行有效脫色。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）