易春華 謝齊斌 唐薇薇 朱春剛 秦長串 伍和明 韋達有

摘要：【目的】對豬嵴病毒（PKV）VP1基因進行測序與同源性分析，確認其可能來源，為今后的生物學特性分析及仔豬腹瀉防治工作提供科學依據(jù)?！痉椒ā坎捎肦T-PCR對GXPKV-1毒株VP1基因進行克隆，運用DNASTAR軟件包中Megalign程序?qū)y序獲得的VP1基因進行核苷酸序列及其推導氨基酸序列同源性分析。【結(jié)果】GXPKV-1毒株VP1基因全長762 bp，共編碼254個氨基酸，與GenBank已公布的13株參考毒株VP1基因的核苷酸同源性為74.1%～85.4%，推導氨基酸同源性為81.1%～93.3%。根據(jù)VP1基因推導氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析，發(fā)現(xiàn)GXPKV-1毒株與Gansu-2012、JS1419等國內(nèi)參考毒株同屬于同一亞群，而與瑞士分離株Swine-S-1-2007、泰國分離株THA-2008、美國分離株H24-2012-USA及四川分離株CHN-SC-2011-02等的親緣關(guān)系較遠?！窘Y(jié)論】豬嵴病毒GXPKV-1毒株起源于國內(nèi)流行毒株的傳播，在新的環(huán)境下雖然其VP1基因核苷酸發(fā)生變異，但由于同義翻譯，推導氨基酸的同源性仍然較高，說明堿基突變并未引起蛋白結(jié)構(gòu)的改變。

關(guān)鍵詞： 豬嵴病毒；VP1基因；序列測定；分析

中圖分類號： S852.659.6 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）04-0670-04

0 引言

【研究意義】豬嵴病毒（Porcine kobuvirus，PKV）是一種新病毒，屬于RNA科、嵴病毒屬成員，于2007年首次在匈牙利被發(fā)現(xiàn)（Reuter et al.，2008）。迄今為止，愛知病毒（Aichi virus，AiV）和牛嵴病毒（Bovine kobuvirus，BKV）已被國際病毒分類委員會（ICTV）認定為嵴病毒的官方成員，而豬嵴病毒尚屬于嵴病毒屬的候選病毒（梁丹潔，2014）。自2007年以來，在我國、泰國、日本、韓國、巴西和荷蘭等國家（Yu et al.，2009；Khamrin et al.，2009，2010；Park et al.，2010；Barry et al.，2011）均有檢測出豬嵴病毒的文獻報道。嵴病毒可感染人類及牛、豬、羊、蝙蝠、狗、貓、小鼠等動物（Reuter et al.，2008），但是否具有跨種間傳播有待進一步證實。而關(guān)于嵴病毒是否是引起豬群腹瀉的原因目前也尚無定論，須通過基因生物學特性研究進一步驗證?！厩叭搜芯窟M展】豬嵴病毒屬于RNA病毒，單股正鏈且無囊膜，病毒顆粒的直徑20～30 nm。豬嵴病毒基因組成包括5'-端非編碼區(qū)（5'-UTR）、1個大的開放性閱讀框（ORF）、3'-非編碼區(qū)（3'-UTR）及Poly（A）尾，其核苷酸全長8210 bp[含Poly（A）序列]，編碼2488個氨基酸的多聚蛋白。多聚蛋白經(jīng)病毒蛋白酶作用，可裂解為非結(jié)構(gòu)蛋白（2A-2C、3A-3D）和結(jié)構(gòu)蛋白（VP0～VP1）。在5'-UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)基因沖突現(xiàn)象，前108個堿基可形成一個莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)域（SLA-C），是嵴病毒極具特色的地方，且該區(qū)域在傳染性病毒粒子的產(chǎn)生及RNA復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用（Sasaki et al.，2001）。VP1蛋白可刺激宿主并促使機體產(chǎn)生中和抗體，是豬嵴病毒的主要免疫原蛋白。陳蕾等（2012）曾對一株豬嵴病毒CHN/2012a（登錄號JX294863）的VP1基因進行生物學分析，結(jié)果表明，VP1蛋白屬于穩(wěn)定蛋白，穩(wěn)定系數(shù)35.93，屬信號肽，無跨膜區(qū)，具有氨基酸選擇偏向性?！颈狙芯壳腥朦c】近幾年，豬場發(fā)生仔豬腹瀉的情況日益嚴重，且在腹瀉豬群中以豬嵴病毒感染率非常普遍，但由于對豬嵴病毒的了解非常有限，無法確定其與近年來仔豬腹瀉的發(fā)生是否關(guān)聯(lián)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對豬嵴病毒GXPKV-1株的VP1基因進行序列測定與分析，確認其可能來源，為今后的生物學特性分析及仔豬腹瀉防治工作提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

豬嵴病毒疑似病料（豬糞便、腸樣及腸系膜淋巴結(jié)）由桂林市動物疫病預(yù)防控制中心到轄區(qū)各縣（區(qū)）采集、保存?？俁NA抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DL2000 DNA Marker、膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，Taq DNA合成酶、dNTPs、MgCl2購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、HIR抑制劑等購自寶生物工程（大連）有限公司。

1. 2 引物設(shè)計與合成

參照GenBank中豬嵴病毒全基因的核苷酸序列，利用Oligo 6.0及Primer Primer 5.0軟件合成1對以PKV 3D基因為參照的特異性檢測引物（Kobu-U/Kobu-L）和1對擴增豬嵴病毒VP1基因的特異性引物（VP1-U/ VP1-L），引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成，其序列如表1所示。

1. 3 豬嵴病毒基因RT-PCR擴增

1. 3. 1 病料處理 無菌采集伴有腹瀉癥狀豬群的組織病料（腸系膜淋巴結(jié)或豬腸粘膜等），對采集的組織病料進行研磨、離心取上清液進行病毒提取或-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3. 2 豬嵴病毒RNA提取 豬嵴病毒RNA采用動物組織總RNA提取試劑盒提取，具體操作步驟按照提取試劑盒說明。

1. 3. 3 合成反轉(zhuǎn)錄cDNA 利用隨機引物N9進行反轉(zhuǎn)錄（RT），反應(yīng)總體系25.0 μL：5×Buffer 5.0 μL，隨機引物N9 2.0 μL，dNTPmix（2.5 mmol/μL）2.0 μL，RNasin酶抑制劑0.5 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL） 0.5 μL，RNA模板15.0 μL。然后置于PCR儀中進行反轉(zhuǎn)錄（42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min），合成的cDNA產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3. 4 目的基因PCR擴增與鑒定 以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系25.0 μL：10×Buffer（含MgCl2）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，Taq DNA合成酶0.25 μL，cDNA模板5.0 μL，ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1. 3. 5 PCR產(chǎn)物膠回收、測序與分析 PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，切下含目的條帶的凝膠，以DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并將純化的PCR擴增產(chǎn)物送至華大基因進行測序。

2 結(jié)果與分析

2. 1 豬嵴病毒基因的鑒定結(jié)果

提取處理樣品的總RNA，并利用引物Kobu-U/ Kobu-L進行豬嵴病毒檢測，其1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，擴增獲得約500 bp的條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

2. 2 VP1基因的擴增結(jié)果

以攜帶豬嵴病毒陽性樣品的cDNA為模板，用引物VP1-U/VP1-L擴增VP1基因片段，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，擴增獲得約750 bp的條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。

2. 3 VP1基因核苷酸序列及其推導氨基酸序列同源性分析結(jié)果

測序結(jié)果表明，豬嵴病毒GXPKV-1毒株VP1基因全長762 bp，共編碼254個氨基酸。運用DNASTAR軟件包中Megalign程序?qū)y序獲得的VP1基因序列與從GenBank下載的13株參考毒株VP1基因序列進行核苷酸及其推導氨基酸同源性比對，結(jié)果表明，GXPKV-1毒株VP1基因序列與已公布參考毒株VP1基因間的核苷酸同源性為74.1%～85.4%；其中與JS1419毒株的同源性最高，為85.4%；與已公布參考毒株VP1基因的推導氨基酸同源性為81.1%～93.3%（表2）。

2. 4 系統(tǒng)發(fā)育進化分析結(jié)果

根據(jù)VP1基因推導氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GXPKV-1毒株與Gansu-2012、JS1419等參考毒株同處于一個分支（圖3），屬于同一亞群，說明其親緣關(guān)系較近；而與瑞士分離株Swine-S-1- 2007、泰國分離株THA-2008、美國分離株H24-2012- USA及我國四川分離株CHN-SC-2011-02等相距較遠，說明其親緣關(guān)系較遠。

3 討論

本研究中，GXPKV-1毒株VP1基因與GenBank已公布13株參考毒株VP1基因間的核苷酸同源性為74.1%～85.4%，推導氨基酸同源性為81.1%～93.3%，其中與JS1419毒株的同源性最高。該結(jié)果表明，雖然豬嵴病毒VP1基因核苷酸變異較大，但由于同義翻譯，推導氨基酸同源性仍然較高，即堿基突變并未引起蛋白結(jié)構(gòu)的改變。通過系統(tǒng)發(fā)育進化分析，發(fā)現(xiàn)GXPKV-1毒株VP1基因與Gansu-2012、JS1419等國內(nèi)參考毒株同處于一個分支，屬于同一亞群，說明其具有相似來源的可能性最大；而與瑞士分離株Swine-S-1-2007、泰國分離株THA-2008、美國分離株H24-2012-USA及四川分離株CHN-SC-2011-02等的親緣關(guān)系較遠。豬嵴病毒感染已覆蓋亞洲、歐洲及美洲，具有廣泛的存在性，但目前國內(nèi)外針對豬嵴病毒的研究時間較短，毒株的序列測定也僅局限于我國及瑞士、泰國、美國等幾個國家，有關(guān)毒株具體分群尚無統(tǒng)一結(jié)論，導致對毒株來源的確定缺乏有力依據(jù)。

目前，豬群腹瀉病發(fā)生是各生豬養(yǎng)殖場（戶）遇到的棘手問題，尤其是仔豬腹瀉可導致其存活率下降，嚴重影響生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展（李彬等，2014）。近年來，在對豬群進行疫病診斷分析時發(fā)現(xiàn)流行性腹瀉、傳染性胃腸炎、豬嵴病毒等病混合感染較常見（陳蕾等，2012；梁丹潔，2014），但當前的研究結(jié)果并未找到豬嵴病毒與豬群腹瀉間存在必然聯(lián)系的相關(guān)依據(jù)，因此還有待在今后的研究中對豬嵴病毒各基因片段的功能及作用進行更系統(tǒng)的生物學特性研究與分析。為了有效解決當前的困境，在開展仔豬腹瀉研究中不僅要注意流行性腹瀉、傳染性胃腸炎等常見病的預(yù)防，還應(yīng)加快對豬嵴病毒等不確定因素的探究，為養(yǎng)殖戶提供科學依據(jù)。

4 結(jié)論

豬嵴病毒GXPKV-1毒株起源于國內(nèi)流行毒株的傳播，在新的環(huán)境下雖然其VP1基因核苷酸發(fā)生變異，但由于同義翻譯，推導氨基酸同源性仍然較高，說明堿基突變并未引起蛋白結(jié)構(gòu)的改變。

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（責任編輯 蘭宗寶）