邵敏　張小秋　張琨琨　楊麗濤　李楊瑞

摘要：【目的】對(duì)甘蔗宿根矮化病病原菌（Leifsonia xyli subsp. xyli， Lxx）一推測(cè)為抗K因子的膜蛋白基因（Lxx18460）進(jìn)行研究，為今后研究該基因在感病甘蔗體內(nèi)表達(dá)打下基礎(chǔ)?！痉椒ā空T導(dǎo)表達(dá)并純化含有推測(cè)為抗K因子的膜蛋白Lxx18460基因的pET-30a質(zhì)粒菌液，委托南京金斯瑞生物科技有限公司制備單克隆抗體；用Western blotting對(duì)細(xì)菌及感病和健康甘蔗樣品總蛋白進(jìn)行檢測(cè)?！窘Y(jié)果】Lxx18460基因具有特異性，只存在于甘蔗Lxx中。ELISA單克隆抗體效價(jià)大于 1∶512000，能夠靈敏地檢測(cè)細(xì)菌總蛋白和甘蔗樣品蛋白。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，Lxx18460基因在細(xì)菌中和感病甘蔗樣品中表達(dá)，在健康甘蔗樣品中幾乎不表達(dá)?！窘Y(jié)論】Lxx18460基因具有特異性，是Lxx中的抗K因子的膜蛋白基因，能夠在細(xì)菌和感病甘蔗樣品體外進(jìn)行表達(dá)。

關(guān)鍵詞： 甘蔗宿根矮化?。籐xx18460基因；單克隆抗體；ELISA檢測(cè)；Western blotting檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q-331 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）03-0382-07

0 引言

【研究意義】甘蔗宿根矮化?。≧atoon stunting disease， RSD）是普遍存在于植蔗地區(qū)的一種世界性重要病害（馬丁等，1982；黃應(yīng)昆和李文鳳，2002），其病原為棒狀桿菌屬Leifsonia xyli subsp. xyli（Lxx） （Davis et al.，1980），寄生于蔗株的維管束中，受害甘蔗發(fā)育慢，植株矮小，嚴(yán)重影響甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)，且該病原細(xì)菌特別細(xì)小，分離、培養(yǎng)和檢測(cè)都極其困難。 因子是細(xì)菌RNA聚合酶全酶（α2ββ ）的一個(gè)蛋白質(zhì)亞基，它可以識(shí)別目的基因啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)該區(qū)域與RNA聚合酶全酶的結(jié)合（Chan et al.，2008），而抗 因子能通過(guò)影響 因子的作用抑制轉(zhuǎn)錄。因此，對(duì)Lxx中抗 因子進(jìn)行研究，對(duì)于防治RSD具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】AsiA是大腸桿菌σ70 RNA聚合酶基因轉(zhuǎn)錄的一種抑制子，亦即抗 因子，Urbauer等（2002）通過(guò)將AsiA亞克隆進(jìn)pET-24b表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21（DE3）菌株中誘導(dǎo)表達(dá)，其大小約10 kD，進(jìn)一步分析表明該蛋白以二聚體的形式存在，是一種新型的螺旋折疊結(jié)構(gòu)，它的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致宿主基因轉(zhuǎn)錄關(guān)閉。RseA是大腸桿菌中跨膜的抗 因子，Campbell等（2003）采用PCR擴(kuò)增目的片段DNA，構(gòu)建σE和RseA的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）菌株中誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行共純化，結(jié)果表明，RseA能夠與 E結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄。周丹（2012）克隆了Lxx中推測(cè)為抗 K因子的膜蛋白Lxx18460基因去跨膜區(qū)域的基因可讀框349～717序列（385 bp），將該基因克隆至pET-30a表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21（DE3）菌株中誘導(dǎo)表達(dá)和純化，大小為27 kD，并對(duì)該基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，認(rèn)為該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)膜上。Rebecc等（2014）為了研究抗 因子FpvR與 因子PvdS、FpvR的關(guān)系，采用TAG標(biāo)簽的串聯(lián)親和層析方法對(duì)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中的抗 因子FpvR和 因子PvdS進(jìn)行共純化，從生理水平證明了抗 因子FpvR與 因子PvdS結(jié)合在一起；采用Western blotting對(duì)結(jié)合在一起的抗 因子FpvR與 因子PvdS進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果能檢測(cè)出目的條帶，大小為15 kD，但使用FpvI的多克隆抗體未能檢測(cè)到FpvI，到目前也未發(fā)現(xiàn)合適的單克隆抗體；通過(guò)構(gòu)建含有多克隆位點(diǎn)的載體，測(cè)定相關(guān)β-半乳糖苷酶的活性，證明FpvR的胞質(zhì)區(qū)會(huì)對(duì)FpvI和PvdS產(chǎn)生抑制?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)Lxx中推測(cè)為抗 K因子的膜蛋白Lxx18460基因單克隆抗體的制備和檢測(cè)未見(jiàn)報(bào)道，該基因在細(xì)菌及甘蔗體外的表達(dá)情況尚不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用PCR檢測(cè)和Western blotting對(duì)Lxx18460基因進(jìn)行研究，旨在了解該基因的特異性、是否存在于細(xì)菌體內(nèi)以及在細(xì)菌和感病甘蔗樣品體外的表達(dá)情況，為今后研究該基因在感病甘蔗體內(nèi)的表達(dá)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

感病甘蔗和健康甘蔗材料均采自廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)基地，Lxx細(xì)菌總蛋白、含有推測(cè)為抗 K因子的膜蛋白Lxx18460基因的pET-30a質(zhì)粒菌液由廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 抗原制備與純化 利用IPTG（0.1 mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)推測(cè)為抗 K因子的Lxx18460基因的pET-30a質(zhì)粒菌液，收集誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后的菌液100.0 mL左右，分裝在50.0 mL的離心管中，置于經(jīng)4 ℃預(yù)冷的離心機(jī)內(nèi)，4 ℃下5000 r/min離心20 min，棄盡上清液。用QIAGEN公司的Ni2+-NTA及配制的緩沖液純化重組蛋白，用變性緩沖液Buffer B（100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea，pH 8.0）重懸菌體，按緩沖液體積（mL）∶菌體濕重（g）=5∶1進(jìn)行超聲波破碎，加終濃度為1 mg/mL的溶菌酶。將破胞后的菌液分裝到1.5 mL離心管中，4 ℃下12000 r/min離心30 min，用1.5 mL離心管收集上清液，約收集3.0 mL左右。Ni2+-NTA搖勻，每個(gè)吸2.0 mL，4 ℃下400 r/min離心5 min，甩掉多余水分。加入Buffer B（4.0 mL左右），4 ℃下4000 r/min離心5 min，重復(fù)3次。加入2.0 mL變性緩沖液Buffer B，將2.5 mL破胞后的菌體上清液緩慢加入到Ni2+-NTA柱內(nèi)，使上清與柱內(nèi)填料混和均勻，放入搖床搖勻 2 h。取出層析柱，室溫靜置30 min，打開(kāi)柱底端封口，收集洗脫液。待液體流盡后，用4.0 mL Buffer B漂洗未結(jié)合蛋白，收集洗脫液。用Buffer C（100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea， pH 6.3）洗脫，每次0.5 mL，洗2次，收集洗脫液。用Buffer D（100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea，pH 5.9）洗脫，每次0.5 mL，洗7次。最后用Buffer E（100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HC，8 mol/L Urea，pH 4.5）洗脫，每次0.5 mL，洗4次，目的蛋白一般會(huì)在Buffer E中出現(xiàn)。經(jīng)SDS-PAGE分析鑒定后，用紫外分光光度法檢測(cè)獲得的純化蛋白質(zhì)量濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 樣品PCR檢測(cè) 本研究參考Pan等（1998）報(bào)道的Lxx 16S-23S rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）設(shè)計(jì)特異引物（表1），同時(shí)根據(jù)Lxx18460基因的特異性（周丹，2012）設(shè)計(jì)引物（表1），引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)DNA的特異擴(kuò)增條帶（438 bp）判斷樣品是否含有RSD病原菌Lxx。以RSD病原菌Lxx DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，水為負(fù)對(duì)照。

1. 2. 3 抗原透析與濃縮 選擇美國(guó)即用型透析袋，截留分子量為15000，用去離子水將透析袋浸泡10 min，配透析液N10（1 mol/L Tris，10% NP-40，0.1 mol/L PMSF，glycerol，2 mol/L NaCl，2 mol/L Imidazole）2 L左右，將透析袋剪成8 cm左右長(zhǎng)度，一頭用夾子夾好，放入水中，檢查是否漏水，用玻璃珠撐開(kāi)袋，將水吸出后加入2.0 mL左右的抗原，用鑷子夾出玻璃珠，再用夾子將透析袋的另一頭夾好，將透析袋放入裝有透析液的大燒杯中，再將大燒杯放在攪拌器上不停攪拌，每隔2 h更換一次透析液，約更換4次。在方形盒底部鋪一定厚度的PEG-2000，將透析完的透析袋放入，再覆蓋一定厚度的PEG-2000，置于4 ℃展示柜進(jìn)行濃縮，約濃縮 4 h。用紫外分光光度法檢測(cè)獲得的濃縮后蛋白質(zhì)量濃度，即為制備單克隆抗體的免疫抗原。

1. 2. 4 抗血清制備與純化 委托南京金斯瑞生物科技有限公司制備單克隆抗體。

1. 2. 5 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定 以Lxx18460蛋白為包被抗原，含有His標(biāo)簽的不相關(guān)蛋白為陰性對(duì)照，未加抗原的磷酸鹽緩沖液為空白對(duì)照，Lxx18460為免疫原制備的單克隆抗體為第一抗體，以辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG F（c）（GOAT）為酶標(biāo)抗體。單克隆抗體第一次稀釋1000倍，以后采用2倍等比稀釋法。在96孔酶聯(lián)板上檢測(cè)單克隆抗體的效價(jià)，用BIO-RAD Model 550型酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的OD值，計(jì)算S/N=樣品OD值/對(duì)照OD值，最大稀釋S/N≥2.1即為陽(yáng)性。

1. 2. 6 單克隆抗體Western blotting檢測(cè) Lxx18460蛋白跑完SDS-PAGE膠后，拆膠，去掉濃縮膠并用ddH2O沖洗2次。把膠、膜浸泡在Transfer Buffer（25 mmol/L Tris Base，192 mmol/L Glycin，0.037% SDS，20%甲醇）中搖15 min。厚濾紙、薄濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)膜之前用Transfer Buffer稍加浸泡，吸掉多余水后即可使用。自上而下依次擺放 1張厚濾紙、2張薄濾紙、膠、膜、2張薄濾紙、1張厚濾紙，200 mA，40 min。轉(zhuǎn)膜后，用鉛筆在膜正面左上角做好標(biāo)記，夾出膜，放在含有PBS-T的盒里，搖5 min，倒掉，倒入含有5%脫脂奶粉的PBS-T中，置于4 ℃展示柜，搖過(guò)夜。倒掉脫脂奶粉，用PBS-T洗4次，每次5 min。用含0.1%脫脂奶粉的PBS-T對(duì)一抗進(jìn)行稀釋?zhuān)ú牧贤扑]一抗最終濃度為10 μg/mL），置37 ℃恒溫箱孵育2 h。PBS-T洗4次，每次5 min，用含0.5%脫脂牛奶的PBS-T對(duì)二抗進(jìn)行稀釋?zhuān)ㄍ扑]二抗1∶1000），置37 ℃恒溫箱孵育1 h。PBS-T洗4次，每次5 min。ECL顯色，兩液等體積混勻，吸1 mL均勻滴在膜上，顯色1.0 min，拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2. 1 樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果

以F1/R1為引物的PCR檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，甘蔗樣品5、7、8、9含有RSD病原菌Lxx，樣品3、4、6不含RSD病原菌Lxx，DX120（克雷伯氏菌）、Escherichia coli（大腸桿菌）、HLB（柑橘黃龍病菌）不含RSD病原菌Lxx。以F2/R2為引物的PCR檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2），甘蔗樣品5、7、8、9含有RSD病原菌Lxx，樣品3、4、6不含有RSD病原菌Lxx，DX120、E. coli、HLB不含有RSD病原菌Lxx（圖2）。檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明Lxx18460基因引物具有特異性，可進(jìn)一步用于單克隆抗體檢測(cè)。

2. 2 抗原的純化和濃縮結(jié)果

通過(guò)進(jìn)一步的誘導(dǎo)表達(dá)獲得帶有His Tag標(biāo)簽的融合蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量大小約27.0 kD，采用His Tag蛋白純化試劑盒純化Lxx18460蛋白，并通過(guò)SDS- PAGE電泳分析，獲得清晰的蛋白條帶（圖3）。目的蛋白主要在Buffer E中出現(xiàn)，可以從E中收集目的蛋白用于進(jìn)一步透析和濃縮（圖4）。濃縮后，用紫外分光光度法檢測(cè)獲得的純化蛋白質(zhì)量濃度為17.1 μg/μL，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。從圖4可以看出，目的蛋白條帶較單一，純度較高，濃度和純度均達(dá)到制備單克隆抗體的要求，可以用作免疫抗原。

2. 3 單克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

將純化后的Lxx18460蛋白免疫小鼠，獲得特異性較好的單克隆抗體。用間接ELISA在96孔酶聯(lián)板上檢測(cè)鼠單克隆抗體的效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，將抗血清稀釋至256000倍時(shí)仍有明顯的陽(yáng)性反應(yīng)，而陰性對(duì)照OD值無(wú)明顯梯度，表明本研究制備的鼠單克隆抗體的效價(jià)大于1∶512000。

2. 4 單克隆抗體的Western blotting檢測(cè)結(jié)果

小鼠腹水中除有抗體外還含有一些復(fù)雜的混合物，如大量非抗體雜蛋白等，為了消除對(duì)試驗(yàn)干擾的物質(zhì)，需要對(duì)小鼠腹水進(jìn)行純化。為了檢測(cè)所制備單克隆抗體的特異性和免疫學(xué)活性，采用Western blotting對(duì)制備的Lxx18460蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果（圖5）顯示，純化后的血清抗體與His融合的Lxx18460蛋白具有特異性的結(jié)合反應(yīng)，只有一條主要條帶，說(shuō)明Protein A能較好地去除腹水中的雜蛋白，純化后的抗體檢測(cè)不出含有His標(biāo)簽的不相關(guān)蛋白，表明該抗體具有特異性，制備的單克隆抗體完全能滿足下一步試驗(yàn)的要求。

2. 5 甘蔗莖、葉樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)Lxx18460基因的特異性設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，以RSD病原菌Lxx DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，水為負(fù)對(duì)照，檢測(cè)甘蔗莖、葉樣品的帶病情況，結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖6可以看出，3～5、8、10～13為感病甘蔗葉，6、7、9、14、15為健康甘蔗葉，16～24為感病甘蔗莖，25、26為健康甘蔗莖。根據(jù)甘蔗帶病情況可進(jìn)一步提取蛋白，用于Western blotting檢測(cè)。

2. 6 感病和健康甘蔗莖、葉總蛋白及細(xì)菌總蛋白SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

用酚抽提的方法分別提取感病和健康甘蔗莖、葉的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。由圖7和圖8可以看出，蛋白條帶清晰，質(zhì)量較好，可以進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。

2. 7 感病和健康甘蔗莖、葉總蛋白及細(xì)菌總蛋白Western blotting檢測(cè)結(jié)果

將獲得的單克隆抗體稀釋后作為一抗，對(duì)感病和健康甘蔗莖、葉總蛋白及細(xì)菌總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，以Lxx18460蛋白為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明，Lxx18460蛋白在細(xì)菌中能夠表達(dá)且表達(dá)量較高（圖9）。對(duì)感病和健康甘蔗葉進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果表明，Lxx18460蛋白在健康甘蔗葉中不表達(dá)，在感病甘蔗葉中表達(dá)（圖10）。對(duì)感病和健康甘蔗莖進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果表明，Lxx18460蛋白在健康甘蔗莖中不表達(dá)，在感病甘蔗莖中表達(dá)（圖11）。可見(jiàn)，制備的單克隆抗體具有較好的特異性，能夠較靈敏地對(duì)材料進(jìn)行檢測(cè)。

3 討論

RSD是一個(gè)比較難研究的細(xì)菌病害，隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們開(kāi)始采用一些技術(shù)手段研究該菌的致病機(jī)理，并采取一些措施對(duì)該病菌進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)菌能根據(jù)胞外環(huán)境的變化而調(diào)節(jié)自身，為了適應(yīng)多變的環(huán)境，細(xì)菌能在細(xì)胞受到傷害之前感受和響應(yīng)這些變化。因此，細(xì)菌需要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)使其感受胞外環(huán)境的變化，從而啟動(dòng)不同基因的表達(dá)。在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的常見(jiàn)機(jī)制是 因子調(diào)節(jié)，決定了啟動(dòng)子的識(shí)別，而抗 因子與 因子又存在密切的聯(lián)系，抗 因子能結(jié)合在σ因子上影響甚至阻礙一些基因表達(dá)（Missiakas and Raina，1998；Bashyam and Hasnain，2004）。周丹（2012）克隆了RSD病原菌Lxx中推測(cè)為抗 K因子的Lxx18460基因，分析了基因結(jié)構(gòu)和在感病蔗株體內(nèi)的表達(dá)情況，但未證明該基因是否具有特異性、是否存在于RSD病原菌Lxx中及其體外表達(dá)情況。

本研究根據(jù)Lxx18460基因的特異性設(shè)計(jì)引物（周丹，2012），雖然PCR產(chǎn)物大小與Pan等（1998）存在不同，但通過(guò)比較分析得出該基因具有特異性。謝曉娜等（2013）分離純化了RSD的病原菌并制備了RSD的多克隆抗體，為甘蔗宿根矮化病的快速檢測(cè)提供了必要保證，但在Western blotting檢測(cè)中，多克隆抗體的特異性較低，產(chǎn)生的非特異性條帶更多，不能夠明確研究某個(gè)致病基因。為了進(jìn)一步研究Lxx18460基因的表達(dá)情況，本研究利用IPTG（0.1 mmol/L）誘導(dǎo)Lxx18460基因的蛋白表達(dá)并純化，委托南京金斯瑞生物科技有限公司制備單克隆抗體，ELISA單克隆抗體效價(jià)大于1∶512000，能夠檢測(cè)出目的條帶，初步證明該基因誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白在RSD病原菌Lxx中和感病甘蔗樣品體外能夠表達(dá)。但在檢測(cè)細(xì)菌和甘蔗樣品的過(guò)程中不可避免也會(huì)產(chǎn)生一些雜帶，一方面，樣品本身在提取的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生降解，尤其是細(xì)菌樣品較難培養(yǎng)，需要多次收集細(xì)菌蛋白進(jìn)行保存，操作相對(duì)繁瑣，蛋白在多次收集和保存的過(guò)程中產(chǎn)生降解；另一方面，Western blotting只是初步檢測(cè)，還不夠優(yōu)化，導(dǎo)致背景較深、雜帶較多，在后續(xù)試驗(yàn)中有必要進(jìn)一步優(yōu)化。由于Lxx18460基因誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白在細(xì)菌及樣品體外的具體表達(dá)量還不明確，因此在后續(xù)研究中有必要設(shè)計(jì)相關(guān)的內(nèi)參基因進(jìn)行Western blotting分析，以明確該基因誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白在細(xì)菌及樣品體外的具體表達(dá)量。目前，關(guān)于Lxx18460基因誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白在感病甘蔗體內(nèi)的表達(dá)情況尚不清楚，需要進(jìn)一步進(jìn)行切片觀察，并以該抗體為探針，直接作用于處理的感病甘蔗莖、葉等各部分，觀察在植物體內(nèi)的表達(dá)情況。

4 結(jié)論

Lxx18460基因具有特異性，只存在于感染RSD病原菌Lxx的甘蔗中，初步證明Lxx18460基因是Lxx中的抗 K因子的膜蛋白基因；利用該基因誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白制備單克隆抗體對(duì)細(xì)菌總蛋白和甘蔗樣品進(jìn)行檢測(cè)，能夠檢測(cè)出目的條帶，進(jìn)一步證明Lxx18460基因是Lxx中的抗 K因子的膜蛋白基因，且該基因能夠在細(xì)菌和感病甘蔗樣品體外進(jìn)行表達(dá)。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）