李敏玲　陳富美　廖碧云　潘宏　黃德倫　黃鳳玲　陸陽(yáng)清　張明

摘要：【目的】探討表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量與早期胚胎發(fā)育能力的影響，為優(yōu)化水牛體外胚胎生產(chǎn)體系及提高其體外胚胎生產(chǎn)效率提供參考。【方法】在水牛卵母細(xì)胞體外成熟液中添加不同濃度的EGCG，以排出第一極體為細(xì)胞核成熟標(biāo)志，觀察卵母細(xì)胞核成熟情況，檢測(cè)MII期卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）和谷胱甘肽（GSH）含量，并統(tǒng)計(jì)經(jīng)孤雌激活及體外受精后早期胚胎的發(fā)育情況?！窘Y(jié)果】在體外成熟液中添加10～20 μmol/L EGCG有利于水牛卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中卵丘擴(kuò)展，卵丘擴(kuò)展指數(shù)（CEI）分別為2.49%和2.42%，卵母細(xì)胞成熟率（59.31%和50.98%）顯著高于未添加EGCG的CK組（P<0.05，下同），MII期卵母細(xì)胞的GSH含量（3.21和3.25 pmol/枚）也顯著高于CK組；添加20～30 μmol/L EGCG可顯著降低水牛MII期卵母細(xì)胞的ROS水平。以體外成熟培養(yǎng)獲得的水牛MII期卵母細(xì)胞分別進(jìn)行孤雌激活及體外受精，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以在體外成熟液中添加10 μmol/L EGCG的效果最佳，其對(duì)應(yīng)的卵裂率和囊胚發(fā)育率均顯著高于CK組?！窘Y(jié)論】EGCG可用于優(yōu)化水牛卵母細(xì)胞體外成熟體系，能有效提高卵母細(xì)胞的成熟率和體外發(fā)育潛力，且以水牛體外成熟液中添加10 μmol/L EGCG的效果最佳。

關(guān)鍵詞： 水牛；表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）；卵母細(xì)胞；體外成熟；胚胎發(fā)育

中圖分類號(hào)： S823.83 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）03-0478-05

0 引言

【研究意義】目前，雖然卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)在科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)生殖方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但囊胚率較低、囊胚質(zhì)量差、卵子得不到有效利用的問(wèn)題依然存在，其原因可能是卵母細(xì)胞在體外氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，體外操作與環(huán)境因素致使卵母細(xì)胞不可避免地接觸到更多的氧自由基，且得不到母體抗氧化劑的保護(hù)（彭中友等，2015）。因此，在卵母細(xì)胞體外成熟液中通常會(huì)添加外源抗氧化劑，以期有效解決上述問(wèn)題。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epi-gallocatechin-3-gallate，EGCG）提取自綠茶，其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，是高效的植物源性抗氧化劑。已有研究證實(shí)，EGCG可提高機(jī)體抗氧化能力，顯著降低機(jī)體過(guò)氧化物的生成（Devika and Stanely，2008），且能有效抑制Fe2+和H2O2誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)（李太坤，2012）。若將EGCG應(yīng)用到卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系中，勢(shì)必能促進(jìn)胚胎工程的快速發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，有關(guān)家畜卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系中添加外源抗氧化劑的研究已有較多報(bào)道。Bormann等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，在成熟液中添加適量的維生素能提高山羊卵母細(xì)胞達(dá)MII期的比率及胚胎發(fā)育率。Tao等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，維生素C和E對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟有促進(jìn)作用，可提高其體外成熟率。Gasparrini等（2006）報(bào)道，將半胱胺和胱氨酸添加至體外成熟液中，有利于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，提高其成熟率。Wang等（2007）研究表明，添加10和15 μmol/L綠茶多酚可促進(jìn)牛卵母細(xì)胞第一極體排出，獲得更高的體外發(fā)育率。彭中友等（2015）研究表明，豬卵母細(xì)胞體外成熟液中添加生長(zhǎng)分化因子9（GDF9）一定程度上能提高卵母細(xì)胞及胚胎的發(fā)育能力，同時(shí)添加GDF9和抗卵泡抑素（FST）抗體對(duì)胚胎發(fā)育的促進(jìn)作用具有加性效應(yīng)。有關(guān)EGCG在哺乳動(dòng)物體外受精研究方面的應(yīng)用也有報(bào)道，Roth等（2008）研究表明，EGCG可增強(qiáng)胚胎抵抗母體熱應(yīng)激的能力，促進(jìn)小鼠胚胎發(fā)育；Spinaci等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，在豬體外受精過(guò)程中，EGCG可減少H2O2產(chǎn)生，且以添加10 μg/mL的效果最佳；尚利青等（2009）研究表明，EGCG能促進(jìn)山羊卵母細(xì)胞體外成熟；李擁軍等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠HTF和TCM-199兩種體系中添加20 μmol/L的EGCG能提高卵母細(xì)胞體外成熟率、精子受精率和胚胎發(fā)育率?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】EGCG具有很強(qiáng)的抗氧化性，能清除健康細(xì)胞中的活性氧（ROS），保護(hù)細(xì)胞和DNA免受損害，且能作用于與自由基有關(guān)的酶類，從而改善細(xì)胞質(zhì)量及提高體外發(fā)育能力，但將EGCG用于水牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的研究尚無(wú)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在水牛卵母細(xì)胞體外成熟液中添加不同濃度的EGCG，探討EGCG對(duì)提高卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量與早期胚胎發(fā)育能力的影響，以期進(jìn)一步優(yōu)化水牛體外胚胎生產(chǎn)體系及提高其體外胚胎生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1. 1 卵母細(xì)胞體外成熟

水牛卵巢收集于南寧某屠宰場(chǎng)，卵母細(xì)胞的采集和體外成熟參照蔣麗等（2013）的方法。EGCG購(gòu)自成都普瑞發(fā)科技開發(fā)有限公司，純度99.4%。水牛卵母細(xì)胞體外成熟液添加EGCG的濃度分別為0（CK）、5、10、20和30 μmol/L。

1. 2 卵丘擴(kuò)展評(píng)定及卵母細(xì)胞成熟判定

卵丘擴(kuò)展評(píng)定及卵丘擴(kuò)展指數(shù)（Cumulus expansion index，CEI）計(jì)算參照Fagbohun和Downs（1990）的方法。卵母細(xì)胞成熟的判定標(biāo)準(zhǔn)為第一極體是否排出。水牛卵母細(xì)胞體外成熟22～24 h，去除卵丘細(xì)胞后，即可在體視顯微鏡下觀察第一極體的排出情況。

1. 3 卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平測(cè)定

選用索來(lái)寶（CA1410）活性氧檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ROS水平測(cè)定。其原理為活性氧可將無(wú)熒光的二氯二氫熒光素—乙酰乙酸酯（DCFH-DA）氧化成可發(fā)出熒光的二氯熒光黃（DCF），通過(guò)激光共聚焦顯微鏡拍照，然后根據(jù)DCF熒光強(qiáng)度記錄細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1. 4 卵母細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）含量測(cè)定

選用總谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒進(jìn)行GSH含量測(cè)定。單個(gè)卵母細(xì)胞GSH含量（pmol/枚）=樣本總含量/測(cè)定卵母細(xì)胞總數(shù)。

1. 5 孤雌激活與體外受精

孤雌激活采用化學(xué)激活法，將體外培養(yǎng)獲得的水牛MII期卵母細(xì)胞置于添加5 μmol/L離子酶素的洗卵液中激活5 min，再轉(zhuǎn)移至2 mmol/L的6-DMAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 h，經(jīng)培養(yǎng)液洗2～3次后置于單層顆粒中共培養(yǎng)。體外受精參照蔣麗等（2013）的方法。孤雌激活和體外受精胚胎均隔天更換一半培養(yǎng)液，第3 d統(tǒng)計(jì)卵裂率，第6～8 d統(tǒng)計(jì)囊胚發(fā)育率。

1. 6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用PASW Statistics 17.0軟件進(jìn)行單因素ANOVA分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 成熟液中添加EGCG對(duì)水牛卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展的影響

如表1所示，10和20 μmol/L處理組水牛卵母細(xì)胞的CEI分別為2.49%和2.42%，均顯著高于CK組（P<

0.05，下同），而5和30 μmol/L處理組的CEI與CK組間無(wú)顯著差異（P>0.05，下同）。說(shuō)明成熟液中添加10～20 μmol/L EGCG有利于水牛卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中卵丘的擴(kuò)展。

2. 2 成熟液中添加EGCG對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟率的影響

第一極體排出是卵母細(xì)胞從GV期發(fā)育到MII期的標(biāo)志，也是評(píng)定卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)準(zhǔn)。如表2所示，10和20 μmol/L處理組的水牛卵母細(xì)胞成熟率（59.31%和50.98%）顯著高于CK組（45.26%），且二者間差異顯著；5和30 μmol/L處理組的水牛卵母細(xì)胞成熟率（47.04%和42.81%）與CK組的差異不顯著。說(shuō)明成熟液中添加10～20 μmol/L EGCG能有效促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞第一極體的排出。

2. 3 成熟液中添加EGCG對(duì)水牛MII期卵母細(xì)胞ROS水平的影響

由表3可以看出，20和30 μmol/L EGCG處理組水牛MII期卵母細(xì)胞ROS的DCF熒光強(qiáng)度分別為18.77和25.39，與CK組（38.04）間存在顯著差異；雖然10 μmol/L EGCG處理組水牛MII期卵母細(xì)胞ROS的DCF熒光強(qiáng)度（28.90）也呈下降趨勢(shì)，但與CK組的差異不顯著；5 μmol/L EGCG處理組與CK組的DCF熒光強(qiáng)度基本一致。說(shuō)明在成熟液中添加20～30 μmol/L EGCG可顯著降低水牛MII期卵母細(xì)胞的ROS水平。

2.4 成熟液中添加EGCG對(duì)水牛MII期卵母細(xì)胞GSH含量的影響

由表4可以看出，在成熟液中添加EGCG后，各處理組水牛MII期卵母細(xì)胞的GSH含量均高于CK組，其中5、10和20 μmol/L處理組（3.03、3.21和3.25 pmol/枚）顯著高于CK組，但這3個(gè)處理組間差異不顯著。說(shuō)明在成熟液中添加EGCG不僅能促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞成熟，還能提高卵母細(xì)胞的GSH合成能力。

2. 5 成熟液中添加EGCG對(duì)水牛卵母細(xì)胞孤雌激活后發(fā)育潛力的影響

由表5可以看出，在成熟液中添加EGCG后，各處理組水牛MII期卵母細(xì)胞經(jīng)孤雌激活處理，其卵裂率和囊胚發(fā)育率均高于CK組。其中，10 μmol/L處理組孤雌卵的卵裂率（67.07%）和囊胚發(fā)育率為（31.69%）均顯著高于CK組。說(shuō)明在成熟液中添加EGCG可促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞的核成熟，進(jìn)而提高其早期胚胎發(fā)育能力。

2.6 成熟液中添加EGCG對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外受精后發(fā)育潛力的影響

由表6可以看出，各EGCG添加處理組水牛MII期卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精處理后，其卵裂率和囊胚發(fā)育率均高于CK組。其中，10和20 μmol/L處理組的受精卵卵裂率分別為59.64%和53.78%，顯著高于CK組（44.65%）；10 μmol/L處理組的囊胚發(fā)育率為24.68%，顯著高于CK組（15.02%）。說(shuō)明在成熟液中添加EGCG不僅能促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞成熟，還能提高卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量及其受精能力。

3 討論

卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞的核成熟和胞質(zhì)成熟中扮演重要角色（Tanghe et al.，2003）。Mattioli等（1988）報(bào)道，豬卵母細(xì)胞成熟后擴(kuò)散的卵丘細(xì)胞能誘發(fā)精子發(fā)生頂體反應(yīng)，從而有利于精子進(jìn)入卵母細(xì)胞。Fukui（1990）、Kikuchi等（1993）也研究發(fā)現(xiàn)，精子進(jìn)入卵子后雄原核的形成很大程度上取決于卵母細(xì)胞的成熟與受精過(guò)程中卵丘細(xì)胞的作用?？梢?jiàn)，卵丘擴(kuò)展對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在成熟液中添加一定濃度的EGCG能促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展，提高水牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力，與Mattioli等（1988）報(bào)道的研究結(jié)果一致。但Ralph等（1995）研究表明，牛卵母細(xì)胞的卵丘擴(kuò)展并不依賴卵母細(xì)胞；Vergara等（1997）研究發(fā)現(xiàn)，分別以去除卵丘細(xì)胞與保留卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精時(shí)無(wú)顯著差異。這可能與當(dāng)?shù)丨h(huán)境氣候、試驗(yàn)方法、動(dòng)物體系等因素有關(guān)，因此卵母細(xì)胞與卵丘擴(kuò)展的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

EGCG是綠茶中主要且含量豐富的黃酮類物質(zhì)，是一種天然無(wú)毒的強(qiáng)抗氧化劑（Fiorini et al.，2005；谷亞輕，2008），能與其他抗氧化劑相互作用而有效清除有害自由基（Leone et al.，2003；Singh et al.，2011；Jin et al.，2015）。本研究結(jié)果表明，在體外成熟液中添加20～30 μmol/L EGCG能顯著降低水牛MII期卵母細(xì)胞的ROS水平，與Leone等（2003）的研究結(jié)果一致。添加30 μmol/L EGCG能顯著減少水牛MII期卵母細(xì)胞的ROS水平，但對(duì)水牛卵母細(xì)胞成熟及早期發(fā)育效果沒(méi)有顯著影響，可能與過(guò)度清除ROS有關(guān)，卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育受氧化因子及相關(guān)酶類的同步影響，其主導(dǎo)或拮抗、協(xié)同等作用尚需進(jìn)一步探究。

GSH是一種三肽硫醇，幾乎存在于所有細(xì)胞中，主要功能是參與新陳代謝，可保護(hù)細(xì)胞抵抗活性氧中間體和自由基的危害。本研究在水牛卵母細(xì)胞體外成熟液中添加不同濃度的EGCG，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MII期卵母細(xì)胞的GSH含量均有所增加。其中，5～20 μmol/L EGCG處理組的MII期卵母細(xì)胞GSH含量顯著高于CK組，即EGCG促進(jìn)了水牛卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中GSH的合成，而有利于卵母細(xì)胞的后期發(fā)育。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在體外成熟液中添加10 μmol/L EGCG能顯著促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞的成熟和早期胚胎發(fā)育率，添加20 μmol/L EGCG雖然也能顯著促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞第一極體排出，但經(jīng)孤雌激活和體外受精后的早期胚胎發(fā)育潛力不及添加10 μmol/L EGCG的處理組。因此在本研究條件下，以成熟液中添加10 μmol/L EGCG對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的效果最佳。

4 結(jié)論

EGCG作為一種植物源的抗氧化劑，可用于優(yōu)化水牛卵母細(xì)胞體外成熟體系，能有效提高卵母細(xì)胞的成熟率和體外發(fā)育潛力，且以水牛體外成熟液中添加10 μmol/L EGCG的效果最佳。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）