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      菠蘿蜜多糖提取工藝優(yōu)化及初步鑒定

      2016-05-30 10:54:28朱科學(xué)張彥軍譚樂和徐飛賀書珍
      熱帶作物學(xué)報(bào) 2016年2期
      關(guān)鍵詞:菠蘿蜜提取工藝多糖

      朱科學(xué) 張彥軍 譚樂和 徐飛 賀書珍

      摘 要 以菠蘿蜜果肉為試驗(yàn)原料,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用三因素三水平的Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法優(yōu)化液料比、提取時(shí)間和提取溫度對多糖類物質(zhì)的提取工藝和建立數(shù)學(xué)模型,并對制備的多糖進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果表明,二次方程模型擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)效果顯著,菠蘿蜜多糖提取工藝為:液料比為30 ∶ 1,提取時(shí)間為2.5 h,提取溫度為90 ℃,驗(yàn)證試驗(yàn)得率為6.18%,多糖初步鑒定結(jié)果顯示,菠蘿蜜精制多糖中總糖含量為31.6%,不含有還原糖、含有微量多酚類物質(zhì)(含量為0.6%)。

      關(guān)鍵詞 響應(yīng)曲面法;菠蘿蜜;多糖;提取工藝

      中圖分類號 Q946.3;O658 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

      Optimized Extraction and Identification of Polysaccharides Isolated

      From Jackfruit(Artocarpus heterophyllus Lam.)Pulp

      ZHU Kexue, ZHANG Yanjun, TAN Lehe*, XU Fei, HE Shuzhen

      Spice and Beverage Research Institute, CATAS, Wanning, Hainan 571533, China

      Abstract On the basis of single-factor experiments, Design-Expert software was utilized to optimize the extraction process and establish the mathematical model of polysaccharides extracted from jackfruit(Artocarpus heterophyllus Lam.)pulp. The physicochemical properties of jackfruit polysaccharides(JFP)was analyzed by measuring the contents of total sugar, reduction sugar and total polyphenols. The results showed that quadratic model was the best model with R-Squared was 0.978 5 and adjusted R-Squared was 0.951 0. The optimal extraction conditions were found that the optimal water to material ratio, extraction time and extraction temperature were 30 ∶ 1(mL/g), 2.5 h and 90 ℃, respectively. Under these conditions, the actual yield of JFP was 6.18%.The physicochemical properties results indicated that JFP contained 31.6% total sugar, small accounts of total polyphenols and no reduction sugar included. The results might be useful for future studies on the activity and structure-activity relationship of JFP.

      Key words Response surface meltmdology; Jackfruit(Artocarpus heterophyllus Lam.); Polysaccharides; Extraction optimization

      doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.030

      菠蘿蜜(Artocarpus heterophyllus Lam.)作為一種??疲∕oraceae)木菠蘿屬(Artocarpus)熱帶果樹,素有“熱帶珍果”、“熱帶水果皇后”等美譽(yù)[1]。其果肉中含有豐富的糖類化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、多酚、脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分,可作為一些重要營養(yǎng)素的食物來源。Baliga等[2]通過分析發(fā)現(xiàn)菠蘿蜜果肉中含碳水化合物16.0%~25.4%,蛋白質(zhì)1.2%~1.9%,脂肪0.1%~0.4%,礦物質(zhì)0.87%~0.9%。研究還發(fā)現(xiàn),菠蘿蜜對人體相關(guān)生理活動具有抗氧化、抗炎、降血糖等多種藥理藥效活性[3-5]。近年來,有關(guān)菠蘿蜜營養(yǎng)成分及其生物活性的相關(guān)研究越來越受到重視,但大多集中在微量元素、多酚和黃酮類物質(zhì)等方面,菠蘿蜜多糖的研究仍處于摸索階段。

      多糖是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物,在自然界分布很廣,常見的有植物多糖、真菌多糖、海洋生物多糖。同時(shí),關(guān)于多糖生物活性的研究主要集中在其抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗糖尿病等方面[6]。鄒勇芳等[7]對菠蘿蜜水提物中多糖含量進(jìn)行測定,苯酚-硫酸法測定結(jié)果顯示菠蘿蜜多糖含量為5.53%;Tan等[8]研究發(fā)現(xiàn)菠蘿蜜果肉中粗多糖具有免疫增強(qiáng)活性。但目前對于菠蘿蜜多糖的提取工藝優(yōu)化及鑒定尚未進(jìn)行系統(tǒng)的研究。因此,本研究擬利用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法,優(yōu)化菠蘿蜜多糖的提取工藝,并通過總糖、還原糖及總酚含量分析進(jìn)行初步鑒定,結(jié)果可為菠蘿蜜多糖類物質(zhì)的深入研究和精深加工提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 材料與試劑 菠蘿蜜鮮果(馬來西亞1號品種),由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供。

      無水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、無水乙醚均為分析純試劑,購自西隴化工股份有限公司;苯酚、濃硫酸為分析純試劑,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖標(biāo)品,購自美國Sigma公司;沒食子酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司出品;福林酚,上海荔達(dá)生物科技有限公司出品。

      1.1.2 儀器與設(shè)備 ME4002E電子天平(梅特勒-托利多);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RV10(IKA儀器設(shè)備有限公司);SHB-IIIB循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);LXJ-IIB多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);JDG-0.2真空冷凍干燥機(jī)(蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司);ST-987沙冰料理機(jī)(松泰電器有限公司);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司);透析袋MD34(截留分子量10000,美國光譜醫(yī)學(xué)公司);分液漏斗(蜀牛玻璃儀器有限公司);SPECORD 250 PLUS紫外可見分光光度計(jì)(德國耶拿分析儀器公司)。

      1.2 方法

      1.2.1 菠蘿蜜多糖提取工藝流程 菠蘿蜜鮮果去除果皮、果絲和種子后,收集菠蘿蜜果肉,采用ST-987冰沙料理機(jī)粉碎,加入無水乙醇使乙醇-菠蘿蜜水溶液的終濃度為80%,浸泡過夜,重復(fù)2次,脫除色素及醇溶性物質(zhì),干燥備用。菠蘿蜜多糖按照圖1所示流程進(jìn)行提取。

      菠蘿蜜果肉凍干粉末經(jīng)水浴加熱浸提,抽濾收集上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行真空濃縮,濃縮液加入無水乙醇至乙醇濃度為70%(V/V),攪拌均勻,4 ℃靜置過夜,3 000 r/min離心5 min,收集醇沉物,真空冷凍干燥,制備菠蘿蜜粗多糖。稱取一定重量的粗多糖樣品用蒸餾水溶解后,再用Sevag(氯仿 ∶ 正丁醇=4 ∶ 1,V/V)脫除游離蛋白質(zhì),透析(自來水48 h,蒸餾水24 h),濃縮后70%醇沉,再分別用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌,冷凍干燥得精制多糖。

      1.2.2 菠蘿蜜多糖得率 根據(jù)精制多糖的質(zhì)量和菠蘿蜜果肉干燥粉末的重量,按如下公式計(jì)算菠蘿蜜多糖得率:

      菠蘿蜜多糖得率=×100%(1)

      1.2.3 單因素試驗(yàn) 選取液料比、提取時(shí)間和提取溫度3個(gè)因素,每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平,每個(gè)水平重復(fù)3次:①固定提取溫度和提取時(shí)間,研究液料比(分別為10 ∶ 1、20 ∶ 1、30 ∶ 1、40 ∶ 1、50 ∶ 1)對菠蘿蜜多糖得率的影響;②固定液料比和提取溫度,分別考察不同提取時(shí)間(1、2、3、4、5 h)對菠蘿蜜多糖得率的影響;③固定液料比和提取時(shí)間,分別考察不同提取溫度(55、65、75、85、95 ℃)對菠蘿蜜多糖得率的影響。提取工藝按照圖1流程進(jìn)行,并按照公式(1)計(jì)算菠蘿蜜多糖的得率。

      1.2.4 響應(yīng)曲面法 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,分別考察液料比、提取時(shí)間、提取溫度對多糖得率的影響。采用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)及響應(yīng)曲面法優(yōu)化菠蘿蜜多糖提取工藝。

      1.2.5 菠蘿蜜多糖理化性質(zhì)鑒定 苯酚-硫酸反應(yīng)分析樣品中總糖含量,費(fèi)林試劑反應(yīng)[9]鑒定還原糖含量,F(xiàn)olin-Ciocalteu法[10-11]檢測總酚含量。

      1.3 數(shù)據(jù)分析

      采用Design-Expert軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及模型的建立,以液料比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)3個(gè)變量為參數(shù),試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。運(yùn)用Design-Expert軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,模型方程的擬合性質(zhì)由決定系數(shù)R2及方差分析判定,統(tǒng)計(jì)顯著性和回歸系數(shù)顯著性由F值來檢測,P值取0.05、0.01二個(gè)不同水平。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 液料比對菠蘿蜜多糖得率的影響

      由于多糖類生物大分子物質(zhì)在水中的溶解度不高,因此浸提過程中用水量是限制多糖得率的重要因素[12]。結(jié)果如圖2所示,在10 ∶ 1~20 ∶ 1間,菠蘿蜜多糖得率顯著上升,在30 ∶ 1之后得率有所降低。因此,初步選定液料比在20 ∶ 1~40 ∶ 1范圍。

      2.2 提取時(shí)間對菠蘿蜜多糖得率的影響

      提取時(shí)間對菠蘿蜜多糖得率的影響見圖3,結(jié)果顯示,提取時(shí)間在2 h時(shí)多糖的得率達(dá)到最高,之后隨著提取時(shí)間的延長呈下降的趨勢。故本實(shí)驗(yàn)初步選擇提取時(shí)間范圍為2~3 h。這表明,菠蘿蜜多糖的浸出過程與時(shí)間密切相關(guān):浸提初期,時(shí)間過短,產(chǎn)物溶解不充分;但浸提時(shí)間過長,可能由于部分多糖水解的原因,造成多糖得率降低[13]。

      2.3 提取溫度對菠蘿蜜多糖得率的影響

      提取溫度對菠蘿蜜多糖得率的影響效果顯著,多糖提取率隨著溫度的升高而增加(圖4)。溫度在85~95 ℃范圍內(nèi),溫度的作用效果趨于平穩(wěn),可能與溫度越高,體系中溶液的粘度越低,有助于胞內(nèi)多糖分子向外擴(kuò)散有關(guān)。

      2.4 響應(yīng)曲面分析方案及結(jié)果

      根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取液料比、提取時(shí)間和提取溫度對菠蘿蜜多糖提取率影響的3個(gè)因素,每一個(gè)自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1、0、+1進(jìn)行編碼。試驗(yàn)方案、菠蘿蜜多糖得率試驗(yàn)值及預(yù)測值見表2。

      2.5 菠蘿蜜多糖得率與各變量關(guān)系模型

      表3和表4分別為Design-Expert給出的多糖得率與不同操作參數(shù)之間關(guān)系多種擬合模型的方差分析。從表3多種模型方差分析中的均方及F值和概率>F檢驗(yàn)結(jié)果綜合來看,二次方程模型的擬合效果要好于其他方程模型,Design-Expert系統(tǒng)推薦二次方程模型。表4對多種擬合模型的標(biāo)準(zhǔn)偏差、相關(guān)系數(shù)R2、校正系數(shù)R2值及偏差平方和的結(jié)果進(jìn)行了分析,表明自變量與響應(yīng)值之間線形關(guān)系顯著,可以用于菠蘿蜜多糖實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測。

      結(jié)合上述分析,用Design-Expert進(jìn)行二次方程回歸擬合,得到菠蘿蜜多糖得率與編碼自變量液料比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)的二次多項(xiàng)回歸方程:

      Y=5.90+0.19A-0.066B+1.11C-0.31A2-0.052AB+0.042AC-0.31B2-0.25BC-1.03C2

      2.6 菠蘿蜜多糖得率回歸模型方差分析

      對響應(yīng)曲面回歸方程方差分析發(fā)現(xiàn),提取溫度和液料比對多糖得率的影響顯著,而提取時(shí)間較不顯著,各影響因素對多糖得率作用大小的順序依次為提取溫度>液料比>提取時(shí)間。方程的決定系數(shù)為R2=0.978 5,校正系數(shù)R2值為0.951 0,表明用上述二次多項(xiàng)回歸方程預(yù)測各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí),因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著,說明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好(表5)。

      2.7 因素間的交互對菠蘿蜜多糖得率的影響

      通過固定液料比、提取時(shí)間或提取溫度其中一個(gè)因素,觀察另外兩個(gè)因素及其交互作用對多糖得率的影響,進(jìn)而得到一組響應(yīng)曲面和等高線圖[14]。圖5~7直觀地反映了液料比與提取時(shí)間、液料比與提取溫度及提取時(shí)間與提取溫度相互作用對菠蘿蜜多糖得率的影響;結(jié)果顯示,提取溫度與提取時(shí)間對多糖提取率作用顯著,液料比與提取時(shí)間、液料比與提取溫度作用不顯著,與表5結(jié)果顯示一致。

      2.8 Design-Expert系統(tǒng)的模擬尋優(yōu)與檢驗(yàn)

      由上述分析結(jié)果可知,響應(yīng)值存在最大值,通過軟件進(jìn)一步分析計(jì)算,得到菠蘿蜜多糖提取率預(yù)測值最大時(shí)的最優(yōu)條件:液料比為34 ∶ 1,提取時(shí)間為2.78 h,提取溫度為90.5℃,預(yù)測值為6.27%??紤]到實(shí)際提取條件,提取液量的增加會提高能源的消耗,同時(shí)過高的提取溫度可能會對多糖的活性具有一定的損害[15]。因此,綜合考慮能耗問題與活性保持問題,將菠蘿蜜多糖提取工藝條件修正為:液料比為30 ∶ 1,提取時(shí)間為2.5 h,提取溫度為90 ℃。為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性,采用修正條件進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn),結(jié)果得出菠蘿蜜多糖實(shí)際得率為6.18%,表明利用響應(yīng)曲面分析法得到的菠蘿蜜多糖提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

      2.9 菠蘿蜜多糖的鑒定

      苯酚-硫酸法的基本原理是利用糖類在濃硫酸作用下,水解生成糠醛或其衍生物,與苯酚試劑縮合反應(yīng)后溶液呈橙黃色,且其顏色深淺與糖的濃度成正比;本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,菠蘿蜜多糖樣品溶液經(jīng)苯酚硫酸法分析后,溶液呈橙黃色,證明菠蘿蜜提取物中含有多糖類物質(zhì),經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)總糖含量為31.6%。費(fèi)林試劑反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)原理為糖中的還原糖(如葡萄糖、果糖)與斐林試劑發(fā)生作用,可以生成磚紅色沉淀;本實(shí)驗(yàn)菠蘿蜜精制多糖樣品與費(fèi)林試劑后沒有磚紅色沉淀產(chǎn)生,說明菠蘿蜜精制多糖中不含游離的還原糖。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用Folin-Ciocalteu法測定樣品中總酚含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菠蘿蜜多糖中多酚類物質(zhì)含量為0.6%。

      3 討論與結(jié)論

      多糖是自然界中廣泛存在的一類生物大分子化合物,不僅廣泛參與各種生命活動,而且還具有包括免疫調(diào)節(jié)在內(nèi)的多種生物功效。多糖常用的提取純化方法為水提醇沉后去蛋白、超濾;常用的分析方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、菲林試劑反應(yīng)等。Tan等[8]研究發(fā)現(xiàn),水提醇沉菠蘿蜜果肉多糖的得率為3.91%,總糖含量為21%。本實(shí)驗(yàn)菠蘿蜜精制多糖得率最高可達(dá)6.18%,其總糖含量為31.6%,說明本研究工藝明顯提高多糖的得率及總糖含量。

      響應(yīng)曲面法是一種以回歸模型函數(shù)近似擬合多因子試驗(yàn)中因素與指標(biāo)關(guān)系的工具,通過分析函數(shù)的等高線和響應(yīng)面,討論因素之間以及因素與響應(yīng)面之間的相互關(guān)系,對反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化[16]。本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化菠蘿蜜多糖提取工藝,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)曲面法對影響菠蘿蜜多糖提取率的3個(gè)主要因素:液料比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行了優(yōu)化。分析結(jié)果表明,二次方程模型的擬合效果要好于其他方程模型,用Design-Expert進(jìn)行擬合得到二次方程式為:

      Y=5.90+0.19A-0.066B+1.11C-0.31A2-0.052AB+0.042AC-0.31B2-0.25BC-1.03C2,方程的決定系數(shù)為R2=0.978 5,R2校正值為0.951 0,說明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好。

      綜上所述,通過響應(yīng)曲面和等高線圈,直觀地反映了各影響因素之間交互作用,優(yōu)化得到菠蘿蜜多糖提取工藝條件為:液料比為30 ∶ 1,提取時(shí)間為2.5 h,提取溫度為90 ℃,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示菠蘿蜜多糖實(shí)際得率為6.18%,說明利用響應(yīng)曲面分析法得到的菠蘿蜜多糖提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠。菠蘿蜜多糖的初步鑒定結(jié)果顯示,提取得到的樣品為多糖類物質(zhì),且樣品中不含有還原糖及含有微量多酚類物質(zhì),實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為菠蘿蜜多糖后續(xù)的研究提供理論參考。

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