鮑魚臟器β—葡萄糖苷酶提取工藝的優(yōu)化

羅小娟 楊娟 陳錦權 方婷 陳小藝

摘 要：該研究以鮑魚臟器為原料，通過冷提取工藝單因素試驗，探討了緩沖液種類、緩沖液pH、料液比、浸提時間對鮑魚臟器中β-葡萄糖苷酶活力的影響，并通過正交試驗確定提取的最佳工藝。在此基礎上，采用超聲波輔助提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液，確定超聲輔助提取的最佳工藝條件。結果表明：料液比、緩沖液pH對提取具有顯著性的影響（P<0.05），而浸提時間、緩沖液種類對提取的影響不顯著。通過比較超聲波輔助提取前后β-葡萄糖苷酶活力的大小，可以看出，超聲波處理有利于鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取，最佳提取工藝條件為：緩沖液為0.1mol/L pH3.5乙酸-乙酸鈉，料液比1∶4，浸提時間4h，超聲時間20min，超聲功率200W。

關鍵詞：鮑魚內臟；β-葡萄糖苷酶；超聲波；提取

中圖分類號 TQ281 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）18-0016-05

Extraction Technology Optimization of β-glucosidase from Abalone Viscera

Luo Xiaojuan1 et al.

（1College of Food Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China）

Abstract：Abalone viscera was used as raw materials，through single-factor experiments of cold extraction process，the main influence factors on β-glucosidase activity from abalone viscera such as buffer types，pH value of buffer solution，solid-liquid ratio and extraction time had been investigated. The optimum conditions were obtained by orthogonal test. Based on that，the ultrasound-assisted method was applied to extract crude β-glucosidase from abalone viscera and optimize the extractive conditions. The experimental results showed solid-liquid ratio and pH value of buffer solution had a significant effect on the extraction（P<0.05），but extraction time and buffer types had no significant effect on the extraction. By comparing the change of β-glucosidase activity of the samples which were treated by the ultrasonic treatment before and after，we found that ultrasonic treatment was conducive to extraction of the abalone viscera crude β-glucosidase. The optimum technology conditions were determined as follows：buffer was 0.1mol/L pH 3.5 acetic acid-sodium acetate，solid-liquid ratio was 1∶4，extraction time was 4h，ultrasonic time was 20min，ultrasonic power was 200W.

Key words：Abalone viscera；β-glucosidase；Ultrasonic；Extraction

鮑魚（Abalone）是一種原始的海洋單殼軟體貝類，屬軟體動物門（Mollusca）、腹足綱（Gastropoda）、前鰓亞綱（Prosobranchia）、原始腹足目（Archaeogastropoda）、鮑螺科（Haliotidae）、鮑屬[1]。鮑魚作為名貴的海產品，兼具高營養(yǎng)價值與藥用價值[2-3]。鮑魚臟器約占鮑魚軟組織總重量的1/3，含有豐富的生物活性物質。近年來，相關研究表明鮑魚臟器多糖含量豐富，具有抗氧化及免疫調節(jié)活性[4-5]。同時，已有報道鮑魚內臟中含有多種酶類，Go'mez-Pinchett等研究表明，鮑魚內臟中含有纖維素酶、瓊脂水解酶和藻酸酶等消化酶[6-7]，宮國君等從鮑魚內臟中提取出β-1，3-葡聚糖酶粗酶并進行了酶學性質研究[8]，E.Serviere-Zaragoza對鮑魚內臟中不同組織的消化酶的酶學性質進行了研究[9]。然而，國內外尚未有關于鮑魚內臟β-葡萄糖苷酶的研究。β-葡萄糖苷酶是一種纖維素酶，能催化水解結合于末端芳基或羥基與糖基原子團之間的非還原性β-D-葡萄糖苷鍵，生成配基和葡萄糖，可應用于降解纖維素，在生產上具有廣泛的應用[10-11]。為提高鮑魚內臟的利用價值，本研究以皺紋盤鮑內臟為原料，采用常規(guī)方法輔以超聲波提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液，探討最佳提取工藝，為該酶的應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 （1）材料：皺紋盤鮑內臟：漳州歐圣食品有限公司提供；（2）試劑：對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（p-NPG）購于北京索萊寶科技有限公司；對硝基苯酚，碳酸鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，檸檬酸，檸檬酸三鈉，乙酸鈉，乙酸，氫氧化鈉均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備 JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TGL-16M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；PH SJ-3F pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；FA1004A電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；HWS-28電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；UV-6300PC紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；QL-866旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；冰箱（西門子公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 β-葡萄糖苷酶粗酶液的冷提取 先把冷凍的皺紋鮑魚內臟解凍，用手術剪去除其尾部的結締組織，稱重，按一定比例（w/v）加入4℃預冷的一定pH緩沖液，用攪拌機間斷打漿2min，放置于4℃冰箱中浸提一定時間后，用高速冷凍離心機離心（9 000r/min，4℃，30min），取上清液。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶粗酶液的超聲波輔助提取 先把冷凍的皺紋鮑魚內臟解凍，用手術剪去除其尾部的結締組織，稱重，按一定比例（w/v）加入4℃預冷的一定pH緩沖液，用攪拌機間斷打漿2min后，放入超聲波細胞粉碎機中，同時采用冰浴冷卻，一次超聲時間5s，間歇時間10s，處理一段時間后取出，放置于4℃冰箱中浸提一定時間后，用高速冷凍離心機離心（9 000r/min，4℃，30min），取上清液。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶冷提取工藝的單因素試驗 以β-葡萄糖苷酶活力為指標，考察緩沖液種類、緩沖液pH、料液比、浸提時間對鮑魚臟器中β-葡萄糖苷酶冷提取的影響。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶冷提取工藝的正交試驗 在單因素實驗的基礎上，選取影響實驗的3個主要因素：緩沖液pH、料液比、浸提時間作為考察因素，在各因素最佳值附近分別取3個水平，采用L9（34）正交試驗表進行設計，做3因素3水平正交試驗，以確定β-葡萄糖苷酶冷提取的最佳工藝，并進行驗證性實驗。正交試驗設計因素水平見表1。

1.3.5 超聲波輔助提取β-葡萄糖苷酶的單因素試驗 從超聲波處理對鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力影響的角度出發(fā)，采用β-葡萄糖苷酶冷提取的單因素試驗和正交試驗所得的最佳提取條件，分別就影響超聲波處理效果的兩個主要因素：超聲處理時間、超聲功率，對所提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力進行考察。

1.3.6 β-葡萄糖苷酶活力測定方法 β-葡萄糖苷酶活力的測定：p-NPG比色法，以400nm處的吸光值來表示β-葡萄糖苷酶活力的大小[]。計算公式如下：

[酶活力（U）=Y×V2×V×NK×V1×T]

式中：Y為酶促反應的吸光度；V1為反應體系中酶液體積（mL）；V2為總反應液體積（mL）；V為酶液的提取體積（mL）；K為對硝基苯酚標準曲線的斜率；T為反應時間（min）；N為稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 對硝基苯酚標準曲線 對硝基苯酚標準曲線如圖1，回歸方程為y=18.944x+0.0169，R2=0.999 6，斜率K=18.944。

2.2 β-葡萄糖苷酶冷提取工藝的單因素試驗

2.2.1 緩沖液種類對酶活的影響 在浸提時間為7h，料液比為1∶2（w/v）的條件下，測定濃度均為0.1mol/L，pH值為3.5的不同種類的緩沖液對β-葡萄糖苷酶活力的影響如圖2。由圖2可知，緩沖液的種類對鮑魚臟器粗酶液中β-葡萄糖苷酶活的影響較明顯，用0.1mol/L pH6.0乙酸-乙酸鈉緩沖液浸提，所提取的上清液中β-葡萄糖苷酶的酶活性最高，故選用乙酸-乙酸鈉緩沖液最為合適。

2.2.2 緩沖液pH對酶活的影響 在浸提時間為7h，緩沖溶液為0.1mol/L乙酸-乙酸鈉，料液比為1∶2（w/v）的條件下，分別測定不同pH值浸提下粗酶液中β-葡萄糖苷酶活力，見圖3。由圖3可知，緩沖液的pH對鮑魚臟器粗酶液中β-葡萄糖苷酶活具有顯著的影響。0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液在pH3.0～6.0范圍內，隨著pH值的增大，所提的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力呈現出先增大后減小的趨勢；當0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液pH為3.5時，提取粗酶液的酶活力達到最大值。故應選擇pH值為3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液作為鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶的提取液。

2.2.3 料液比對酶活的影響 在浸提時間為7h條件下，選擇pH3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液與鮑魚臟器分別按料液比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5混合，測定粗酶提取液中β-葡萄糖苷酶活力，其結果見圖4。由圖4可知，所提的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力隨著料液比的增加而增大，當料液比為1∶4時酶活力達到最大值；但在料液比達到1∶4后出現明顯的下降。故提取的料液比應為1∶4比較適宜。

2.2.4 浸提時間對酶活的影響 在緩沖溶液為pH3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸鈉，料液比為1∶4（w/v）的條件下，分別測定浸提時間為1、3、5、7、9h下粗酶提取液中β-葡萄糖苷酶活力大小，其結果見圖5。由圖5可知，所提的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力隨著浸提時間的延長，呈現出先增大后減小的趨勢。在浸提時間為5h時，酶活力接近最大值。因此，最佳浸提時間在5h左右比較適宜。

2.3 鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液冷提取工藝的優(yōu)化 正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

根據極差R值的大小，可得到影響所提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力的因素主次順序為：料液比>緩沖液pH>浸提時間。

由表2的極差分析和表3的方差分析結果可以看出，在篩選鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液提取工藝條件的過程中，影響所提β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活的因素按關鍵性依次為B>A>C，即料液比>緩沖液pH>浸提時間。其中，料液比、緩沖液pH對鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取具有顯著性的影響（P<0.05），而浸提時間對鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取的影響不顯著。

綜合分析圖6和表3，可以得到提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液最佳工藝條件為：A2 B2 C3，即緩沖液pH3.5，料液比1∶4，浸提時間4h。

2.4 驗證試驗結果 由表4可知，采用最佳工藝條件提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力可達到140.58 U，與正交試驗表中最高基本一致。因此，通過實驗驗證，正交試驗的結果正確。

2.5 超聲波輔助提取單因素試驗 在上述試驗基礎上，考察在超聲輔助提取過程中，超聲處理時間、超聲功率對粗酶液的酶活力的影響。

2.5.1 超聲處理時間對酶活的影響 在固定超聲功率為200W時，考察不同超聲處理時間對所提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力的影響，結果如圖7所示。由圖7可知，當處理時間小于20min時，所提的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力隨時間的增加而增大；當處理時間大于20min時，粗酶液的酶活力隨時間的增大而下降。此結果出現的原因可能是由于超聲處理時間短（小于20min），不足以破碎細胞，釋放細胞內的β-葡萄糖苷酶；而長時間的超聲波振蕩容易引起溫度的劇烈上升，導致局部過熱，β-葡萄糖苷酶的高級結構遭到破壞，使部分酶變性失活。故選定超聲處理時間為20min時，酶活力最高。

2.5.2 超聲功率對酶活的影響 在固定超聲時間為20min時，考察不同超聲功率對所提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力的影響，結果如圖8所示。由圖8可知，超聲波的輸出功率對細胞破碎效果具有顯著的影響。當超聲功率小于200W時，隨超聲功率的增加，所提的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力逐漸增大；當超聲功率在200～600W范圍內，粗酶液的酶活力隨功率的增大而下降。該結果產生的原因可能是由于超聲功率較?。ㄐ∮?00W），超聲功率的增大，有利于液體中空穴的形成，產生更多的空化泡，使細胞破碎作用增強；而超聲功率過大導致局部過熱，使部分酶變性失活。故超聲功率采用200W較為適宜。

2.6 兩種提取方法的比較 冷提取的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力為140.58U，超聲波輔助提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力為174.71U，酶活力提高34.13U。由此可見，超聲波處理得到的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力更高，超聲波輔助方法更有利于鮑魚臟器中β-葡萄糖苷酶的提取。

3 結論

用新鮮的皺紋盤鮑臟器為原料，通過冷提取工藝的單因素試驗和正交試驗、超聲波輔助提取工藝的單因素試驗，最后確定了一整套冷提取方法輔以超聲波提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的工藝。冷提取方法各因素對酶活影響：料液比、緩沖液pH對提取具有顯著性的影響（P<0.05），而浸提時間、緩沖液種類對提取的影響不顯著。通過比較冷提取與超聲波輔助提取方法，可以看出，超聲波處理有利于鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取，其最佳提取工藝條件為：緩沖液為pH3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸鈉，料液比1∶4，浸提時間4h，超聲時間20min，超聲功率200W。研究結果為鮑魚臟器酶的開發(fā)利用提供了一定的試驗依據。

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