劉巖 劉銳 蘇新國 趙冠里 胡源媛

摘 要：該試驗(yàn)以LACCLR2細(xì)菌漆酶為研究對(duì)象，對(duì)漆酶的酶學(xué)性質(zhì)以及漆酶對(duì)染料的降解脫色效果進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：漆酶反應(yīng)的最適溫度是50℃，最適pH為6，銅離子濃度為0.01%時(shí)酶活力最高。針對(duì)染料的脫色實(shí)驗(yàn)，靛藍(lán)最顯著，褪色率達(dá)到77.4%，COD/BOD提高了43.5%。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌漆酶；酶學(xué)性質(zhì)；染料脫色

中圖分類號(hào) TQ925 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）18-0029-04

Study of LACCLR2 Bacterial Laccase Properties and Decolorization

Liu Yan1 et al.

（1Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，China）

Abstract：In this experiment，LACCLR2 as research subject，we studied its enzymatic properties and dye decolorization，conclusion as below：The optimum reaction temperature is 50℃，The optimum reaction pH is 6，the optimum copper ion concentration is 0.01%. Indigo decolorization most significant effect，decolorization rate is 77.4%.

Key words：Bacterial Laccases；Enzymatic properties；Decolorization

1 引言

漆酶（EC1.10.3.2）又名藍(lán)色多銅氧化酶，是一種含銅的多酚氧化酶，其與植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動(dòng)物的血漿銅藍(lán)蛋白都是屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族[1]。漆酶是一種可催化漆固化過程的蛋白質(zhì)，由日本學(xué)者吉田在漆樹的漆液中首先發(fā)現(xiàn)。漆酶可以氧化包括酚類、多酚類、苯胺、木質(zhì)素、多環(huán)芳香烴甚至無機(jī)物等一系列物質(zhì)，以分子氧氣為電子受體，生成唯一的副產(chǎn)物是水。漆酶在印染廢水處理、食品生產(chǎn)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，受到了世界科學(xué)界的重視。

長期以來，人們一直以為漆酶僅僅存在于真核生物。1993年，Givaudan在水稻根周圍的土壤中分離出一株產(chǎn)漆酶的脂固氮螺菌，證實(shí)了原核生物也可以產(chǎn)生漆酶[2]。2000年，Alexandre通過生物信息學(xué)技術(shù)，證實(shí)漆酶普遍存在于原核生物中。如今人們?cè)诖竽c桿菌、枯草芽孢桿菌、抗生鏈霉菌、交互單胞菌、嗜熱棲熱菌等多種原核生物中都檢測(cè)到了漆酶的存在。

漆酶主要有三類，分別是植物漆酶、真菌漆酶和細(xì)菌漆酶。其中，植物漆酶很難被檢測(cè)和純化，真菌漆酶又不耐受高溫和堿性環(huán)境，而通過對(duì)細(xì)菌漆酶的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌一般為單體蛋白，具有較好的穩(wěn)定性，偏向堿性的最適作用pH，抑制劑少，可以克服植物漆酶和真菌漆酶應(yīng)用的缺點(diǎn)，因而具有巨大的應(yīng)用潛力。但目前關(guān)于細(xì)菌漆酶的研究還較少，嚴(yán)重阻礙了細(xì)菌漆酶的應(yīng)用，因此，開展對(duì)細(xì)菌漆酶的廣泛研究具有重要的意義。

2 材料與方法

2.1 主要材料

2.1.1 產(chǎn)漆酶細(xì)菌菌種 本課題組提供。

2.1.2 試驗(yàn)器皿 三角瓶、燒杯、量筒、試管、玻璃棒、容量瓶、滴管、試管架、比色皿、移液槍、離心管、保鮮膜、pH試紙、培養(yǎng)皿、pH計(jì)。

2.1.3 試驗(yàn)設(shè)備 GT16-3小型臺(tái)高速離心機(jī)（廣州市正一科技有限公司）；BCD-222@HC華凌冰箱（華凌集團(tuán)有限公司）；722G可見光分光光度計(jì)（上海儀器分析儀器有限公司）；SW-CJ-2FD雙人潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；HR-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；電子天平（廣州市正一科技有限公司）；YH系列電熱器（江蘇建湖近湖鎮(zhèn)教學(xué)儀器廠）；精密電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；PHS-25實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（上海虹益儀器儀表有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2.1.4 試劑 愈創(chuàng)木酚（阿拉?。?；95%乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；硫酸銅（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；NaCl（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；酵母膏（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；蛋白胨（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；結(jié)晶紫（阿拉丁）；橙黃Ⅰ（阿拉?。粍偣t（阿拉?。?；鉻黑T（天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心）；麗春紅S（阿拉?。?；磷酸氫二鉀（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

2.1.5 改良LB培養(yǎng)基 酵母膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、硫酸銅0.04%、瓊脂1.5%、pH為7.4[3]。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 漆酶粗酶液的制備 （1）從平板中將單菌落接入5mL液體培養(yǎng)基的試管里，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d。（2）把試管的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入100mL錐形瓶中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d。（3）將培養(yǎng)好的菌液倒入4mL的離心管，然后離心3min，離心速度為9 000r/min，舍棄上清液。（4）用40mL水將離心沉淀的菌體復(fù)溶。（5）用細(xì)胞破碎儀破碎菌體，設(shè)定參數(shù)為全程破碎時(shí)間60min，功率為45%，每次3s，每次間隔3s。（6）破碎完畢，將細(xì)胞破碎液以12 000r/min的速度離心20min，丟棄沉淀，上清液即為所需粗酶液，置于4℃冰箱保藏備用。

2.2.2 酶活的測(cè)定 制備4mL的反應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為0.05%，硫酸銅的濃度為0.01%。然后每4mL的反應(yīng)體系中分別加入0.2mL之前制備的粗酶液，在50℃水浴中反應(yīng)30min，測(cè)出反應(yīng)后OD465差值。每個(gè)反應(yīng)都須平行三次。以每1min消耗1μmol底物定義為一個(gè)漆酶活力單位，以U/L表示。

2.2.3 漆酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.2.3.1 最適Cu2+濃度 取4mL反應(yīng)體系，愈創(chuàng)木酚的濃度為0.05%（50μL愈創(chuàng)木酚加到100mL去離子水），而Cu2+濃度各個(gè)不相同，其濃度依次為0.0025%、0.005%、0.01%、0.02%、0.04%、0.08%、0.16%。將全部反應(yīng)體系置于37℃預(yù)熱5min后，每個(gè)反應(yīng)體系加入0.2mL粗酶液，對(duì)照組添加相同量的滅活酶液。均置于37℃恒溫水浴鍋中水浴30min，測(cè)其反應(yīng)前后OD465，每組平行三次，求平均值。

2.2.3.2 最適溫度 制備4mL的反應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為0.05%，硫酸銅的濃度為0.01%，每4mL的反應(yīng)體系中加入0.2mL制備的粗酶液，然后搖勻。不同反應(yīng)體系分別放入30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃恒溫水浴鍋水浴30min，對(duì)照組添加相同量的滅活酶液，測(cè)其OD465，每組平行三次，求平均值。

2.2.3.3 最適pH 制備4mLpH分別為3、4、5、6、7、8、9的反應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為0.05%，硫酸銅的濃度為0.01%。向每個(gè)反應(yīng)體系加入0.2mL粗酶液，對(duì)照組添加相同量的滅活酶液。均置于50℃恒溫水浴鍋中水浴30min，測(cè)其反應(yīng)前后OD465，每組平行三次，求平均值。

2.2.3.4 溫度穩(wěn)定性 制備4mL反應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為0.05%，硫酸銅的濃度為0.01%。向每個(gè)反應(yīng)體系分別加入0.2mL經(jīng)過50℃、60℃、70℃、80℃水浴預(yù)處理過的粗酶液。對(duì)照組則添加相同量的滅活酶液。搖勻后均置于50℃恒溫水浴鍋中水浴30min，測(cè)其反應(yīng)前后OD465，每組平行三次，求平均值。

2.2.3.5 漆酶對(duì)染料的脫色效果研究 （1）酶對(duì)靛藍(lán)的脫色。制備4mL靛藍(lán)溶液反應(yīng)體系，其中硫酸銅的濃度為0.01%，向每個(gè)反應(yīng)體系加入0.2mL粗酶液，對(duì)照組添加相同量的滅活酶液。均置于50℃恒溫水浴鍋中水浴30min，測(cè)其反應(yīng)前后OD465，每組平行三次，求平均值。（2）其他染料的脫色。按照對(duì)靛藍(lán)的脫色實(shí)驗(yàn)，對(duì)結(jié)晶紫、剛果紅、橙黃Ⅰ、麗春紅S、橙黃G、鉻黑T做相似的脫色實(shí)驗(yàn)，算出脫色率，比較各個(gè)染料的脫色效果（表1）。

2.3 COD/BOD測(cè)定 COD按照國標(biāo)GB11914-1989測(cè)定，BOD按照標(biāo)準(zhǔn)HJ505-2009測(cè)定。

2.4 計(jì)算

2.4.1 酶活力的計(jì)算 酶活力以樣品與底物反應(yīng)30min后變化的OD值表示，以1min單位體積酶液消耗1μmol漆酶底物定義為一個(gè)漆酶活力單位，以U/L表示[4]。已知愈創(chuàng)木酚在465nm處消光系數(shù)ε=48mmol·L-1·cm-1。公式如下：

[U=OD×Vt×ε×10-6×V0] （2）

式中：OD：吸光度增加值；t：反應(yīng)時(shí)間（min）；V：反應(yīng)體積（mL）；ε：消光系數(shù)；V0：酶液體積（mL）。

2.4.2 脫色率的計(jì)算 根據(jù)染料溶液顏色深淺與吸光值呈現(xiàn)線性關(guān)系，可用分光光度計(jì)在相對(duì)應(yīng)的波長下測(cè)量該染料的吸光值便可反應(yīng)出染料的顏色變化。公式如下：

脫色率（%）=[（Ao-A）/Ao]×100

式中：A—經(jīng)脫色反應(yīng)后溶液的吸光值；A0—脫色反應(yīng)前溶液的吸光值。

3 結(jié)果與分析

3.1 酶活力的測(cè)定 以愈創(chuàng)木酚為底物，50℃反應(yīng)30min，用分光光度法測(cè)其OD值，每組平行三次，求其平均值，可得該漆酶的酶活力為8 750U/L（表2）。

3.2 漆酶的酶學(xué)性質(zhì)

3.2.1 最適Cu2+濃度 以愈創(chuàng)木酚為反應(yīng)底物，添加不同濃度的Cu2+，50℃反應(yīng)30min，用分光光度法測(cè)其OD值，每組平行三次，求其平均值。采用Design-Expert軟件處理對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。如圖1所示，Cu2+濃度在0.002 5～0.01，酶活力隨著Cu2+濃度增加而增加，在0.01～0.05隨著銅離子的濃度增加有少量下降，在0.05～0.16，酶活較為穩(wěn)定，其中在Cu2+濃度在0.01%時(shí)，酶活力達(dá)到最大值。由此判斷0.01%為實(shí)驗(yàn)漆酶的最適Cu2+濃度。當(dāng)Cu2+濃度超過0.01%時(shí)，酶活力會(huì)有所下降，但是下降幅度并不大，故少量Cu2+可以提高漆酶活力，但過高Cu2+濃度也會(huì)抑制漆酶酶活力。

3.2.2 最適溫度 制備4mL的反應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為0.05%，硫酸銅的濃度為0.01%，每4mL的反應(yīng)體系中加入0.2mL制備的粗酶液，然后搖勻，再至于不同的溫度下反應(yīng)30min，用分光光度法測(cè)其OD值，每組平行三次，求其平均值。采用Design-Expert軟件處理對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。如圖2所示，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度在30～50℃時(shí)，隨著溫度的增加酶活力也相對(duì)應(yīng)地增加，并在50℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值，故50℃為最適溫度。在50～60℃，酶活力有所下降，故溫度過高或者過低都會(huì)抑制漆酶的酶活力，反應(yīng)中應(yīng)該注意讓反應(yīng)溫度在最適溫度附近，利于漆酶催化反應(yīng)。由圖2可知，在60℃的時(shí)候，酶活力還相對(duì)較高，故可推斷出說明該酶能在較高溫度催化反應(yīng)。

3.2.3 最適pH 制備4mLpH分別為3、4、5、6、7、8、9的反應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為0.05%，硫酸銅的濃度為0.01%。向每個(gè)反應(yīng)體系加入0.2mL粗酶液，50℃下反應(yīng)30min。采用Design-Expert軟件處理對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。如圖3所示，pH為3時(shí)酶基本喪失活性，而在pH4～9，雖有所下降，但是下降幅度非常小，仍具有較高的酶活力，其中當(dāng)pH為6時(shí)酶活最高，是酶的最適作用pH。試驗(yàn)證明本漆酶對(duì)pH有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，在偏酸性、中性和偏堿性條件下該漆酶均可以發(fā)揮催化作用，這有利于其在工業(yè)上的應(yīng)用。

3.2.4 漆酶的熱穩(wěn)定性 制備4mL反應(yīng)體系，其愈創(chuàng)木酚的濃度為0.05%，硫酸銅的濃度為0.01%。向每個(gè)反應(yīng)體系分別加入0.2mL經(jīng)過50℃、60℃、70℃、80℃水浴預(yù)處理過的粗酶液，50℃下反應(yīng)30min，測(cè)其OD值，平行3次，取其平均值。采用Design-Expert軟件處理對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。如圖4所示，漆酶經(jīng)50℃處理30min后，酶活力損失達(dá)60.5%，并且隨著處理溫度的上升，酶活力損失率逐步提高，即酶活力逐步下降，在80℃處理30min后，酶活力損失率更是達(dá)到了98.5%。故該酶經(jīng)過高溫處理后，酶活力會(huì)顯著下降，即對(duì)溫度穩(wěn)定性較差。

3.2.5 漆酶對(duì)染料的脫色效果 由于漆酶能夠催化許多芳香族酚類物質(zhì)氧化，試驗(yàn)中為了研究該漆酶對(duì)于不同種類的染料的作用效果，選用多種染料如靛藍(lán)、結(jié)晶紫、剛果紅、橙黃Ⅰ、麗春紅S、橙黃G、鉻黑T等進(jìn)（下轉(zhuǎn)39頁）（上接31頁）行脫色實(shí)驗(yàn)，通過算出脫色率如表3所示。分析酶對(duì)染料的脫色效果，結(jié)果顯示：對(duì)照組還呈現(xiàn)較明顯的藍(lán)色，而實(shí)驗(yàn)組的顏色基本褪去。因此，添加了漆酶的實(shí)驗(yàn)組對(duì)靛藍(lán)有較明顯的脫色效果。

3.3 測(cè)定靛藍(lán)的COD/BOD值 按照標(biāo)準(zhǔn)的方法，處理前靛藍(lán)的COD/BOD為13.1%，處理后靛藍(lán)的COD/BOD為18.8%，提高率為43.5%。

4 討論與結(jié)論

本文針對(duì)課題組提供的產(chǎn)漆酶菌株，探究其胞內(nèi)產(chǎn)酶的酶學(xué)性質(zhì)，也對(duì)該漆酶的應(yīng)用做了初步的試驗(yàn)研究。根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步分析可知，Cu2+是該漆酶的激活劑，在一定范圍內(nèi)Cu2+可以提高漆酶的酶活力。加入反應(yīng)體系中的Cu2+濃度在0.01%時(shí)，漆酶的酶活力明顯增加，酶活力為8 750U/L，酶活力提高了2.2倍，故0.01% Cu2+為該漆酶催化反應(yīng)的最適添加量。該漆酶的較適宜的溫度范圍是45～50℃，其中50℃為該漆酶的最適溫度，而且在60℃時(shí)酶仍能保持較高酶活，酶活力僅損失4.9%，說明該酶作用溫度較高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該酶經(jīng)不同溫度下處理過后，酶活力損失較大，在50℃時(shí)就達(dá)到了60.5%，到80℃時(shí)更是達(dá)到了98.5%，故該酶穩(wěn)定性并不好。該漆酶對(duì)pH適應(yīng)性較強(qiáng)，pH范圍在4～9時(shí)，酶活力較高且較穩(wěn)定，并在pH為6時(shí)達(dá)到最大值，故pH為6是該漆酶的最適作用pH。

查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)漆酶對(duì)較多染料有脫色作用。本試驗(yàn)中用該漆酶對(duì)多種染料如結(jié)晶紫、鉻黑T、剛果紅、橙黃Ⅰ、麗春紅、橙黃G等進(jìn)行降解脫色試驗(yàn)，結(jié)果表明，該漆酶對(duì)靛藍(lán)有較明顯的脫色效果，脫色率達(dá)77.4%，對(duì)其他染料則無明顯的脫色效果。

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