美國引進甘蔗品種對黑穗病的抗性鑒定與初步評價

李毅杰　高軼靜　李翔　雷敬超等

摘 要 為篩選出抗甘蔗黑穗病的優(yōu)異親本材料，采用人工浸漬接種法對27個甘蔗品種進行1年新植試驗的黑穗病抗性鑒定。通過潛育期（LP）、持續(xù)發(fā)病期（SDD）、累計叢發(fā)病率（IP）、累計莖發(fā)病率（IS）和病情進展曲線下的面積（AUDPC）這5個病情參數(shù)，結合標準對照種的抗性表現(xiàn)，綜合評價參試品種的抗性，并采用系統(tǒng)聚類分析進行驗證。結果表明：5個病情參數(shù)之間的相關性均達到極顯著水平，是甘蔗黑穗病抗性鑒定與評價的重要指標。參試品種中，未發(fā)病品種6個，占22.22%；高抗（HR）品種5個，占18.52%；抗?。≧）品種10個，占37.04%；中抗（MR）品種1個，占3.70%；中感（MS）品種2個，占7.41%；感病（S）品種3個，占11.11%。系統(tǒng)聚類分析的結果與參試甘蔗品種的抗性表現(xiàn)一致。

關鍵詞 甘蔗；黑穗??；抗性鑒定；病害參數(shù)；聚類分析

中圖分類號 S435.661 文獻標識碼 A

由甘蔗鞭黑粉菌（Ustilago scitaminea Sydow）引起的甘蔗黑穗?。╯ugarcane smut disease）是一種世界性的重要甘蔗病害。自1877年南非納塔爾（Natal）發(fā)現(xiàn)該病害以來[1]，目前除巴布亞新幾內(nèi)亞（Papua New Guinea）外，所有植蔗國和地區(qū)均有該病發(fā)生的報道[2-3]。甘蔗黑穗病為系統(tǒng)性侵染病害，一旦有一株發(fā)病，其余分蘗均可發(fā)病，不但造成甘蔗產(chǎn)量損失，還使甘蔗糖分降低，影響品質(zhì)[4]。該病的廣泛流行使得許多植蔗國不得不淘汰一些豐產(chǎn)、高糖但感病的栽培品種，尤其在中國最大的甘蔗產(chǎn)區(qū)廣西，由于黑穗病菌分化和ROC系列品種單一化問題嚴重，甘蔗黑穗病發(fā)生情況日趨嚴重，在占廣西種植面積達到60%左右的主栽品種ROC22上發(fā)病率高達20%[5]。

抗病育種是防治甘蔗黑穗病最經(jīng)濟、最有效的措施，抗病性鑒定評價是抗病育種的重要環(huán)節(jié)，甘蔗黑穗病抗性水平受環(huán)境條件影響大，抗性評價的準確性和效率直接影響抗病育種的效率[6]。甘蔗黑穗病抗性鑒定所采用的接種方法主要有浸漬法[7]、針刺法[8-9]、催芽和真空滲透接種法[10-11]。其中浸漬法被普遍采用。但浸漬法也衍生出2個分支：第一種是采用冬孢子為接種體[12]，第二種是采用異型（“+”和“-”交配型）擔孢子等量混合作為接種體[13]。這2種浸漬法的鑒定結果均比較接近自然條件下黑穗病的侵染方式，但采用接種體為冬孢子時，不同小種黑穗病菌混合比例存在隨機性，不能保證每次接種病原的一致性，也不能明確評價寄主所感抗的黑穗病菌小種類型。另外，每次接種前需要檢測混合黑穗病菌冬孢子粉的萌發(fā)率以確定接種體的濃度。再者，需要采集大量的甘蔗黑穗病菌冬孢子作為接種體，工作量較大。而異型擔孢子混合接種的優(yōu)點在于：經(jīng)過分離、純化、鑒定小種類型并保存之后，每次接種可通過人工培養(yǎng)獲得新鮮的接種體，接種體的濃度和比例也較易控制，省去檢測接種孢子活力及田間采集的大量工序，接種的甘蔗黑穗病菌小種也是明確的。

本研究采用人工浸漬接種的方法，應用流行病學參數(shù)，對廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所從美國引進的甘蔗種質(zhì)材料的黑穗病抗性進行鑒定及綜合評價，以期篩選出抗黑穗病甘蔗優(yōu)異材料，為甘蔗新品種選育和推廣應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從美國引進的甘蔗種質(zhì)材料20份，分別為CPCL06-3179、CPCL06-3332、CPCL06-3458、CPCL06-3477、CP06-2422、CP06-2874、CP06-2897、CP06-3051、CP07-1527、CP07-1533、CP07-1618、CP07-2137、CP07-2518、CP07-2547、CP09-4147、CP09-4256、CP09-4257、CP09-4369、CP09-4448、CP09-4707；以廣西蔗區(qū)主栽品種ROC22、桂糖29號（GT29）和桂糖42號（GT42）（其中GT29和GT42均為廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所育成品種及黑穗病抗性鑒定標準對照種F134（感小種2，抗小種1）、NCo310（抗小種2，感小種1）、NCo376（高抗小種1和2）和Ya71-374（高感小種1和2），合計27份甘蔗品種材料，由廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所繁殖場和海南基地提供。

1.2 方法

1.2.1 黑穗病接種體的準備 將甘蔗黑穗病菌的“+”和“-”交配型菌株（實驗室保存，并鑒定為甘蔗黑穗病菌1號小種的2個交配型）分別在PDA平板培養(yǎng)基上活化后，挑取少許接入YEPS（蔗糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸膏10 g/L，pH值6.5）液體培養(yǎng)基中120 r/min 28 ℃培養(yǎng)3 d。然后分別取2 mL接入含有300 mL YEPS液體培養(yǎng)基的500 mL玻璃三角瓶中，120 r/min 28 ℃培養(yǎng)7 d。取少量培養(yǎng)液于光學顯微鏡下，將孢子懸浮液調(diào)整為1×106個/mL，然后將“+”和“-”交配型菌液等量混合，再以1 ∶ 2的比例用清水稀釋，待用。

1.2.2 浸漬接種 各材料選擇鱗芽良好的種莖，去除葉鞘后砍成雙芽段，并分別裝入網(wǎng)袋備用。將砍下的新鮮種莖放入黑穗病菌混合液中浸泡10 min，取出后用塑料袋保濕，24 h后播種于大田。

1.2.3 種植管理 各接種材料于2015年9月1日種植在廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所隆安試驗基地，種植地土壤類型主要以沙頁巖赤紅壤為主。采用隨機區(qū)組設計，設3個重復，2行區(qū)，行距1.2 m，行長3 m，每行下種量30個芽，每小區(qū)60個芽，每個材料共180芽。下種蓋土后噴施除草劑封閉，并在行溝封蓋白色地膜（種植前幾天降雨，土壤濕潤）。其余田間管理按常規(guī)大田生產(chǎn)操作。

1.2.4 調(diào)查記錄 種植后發(fā)現(xiàn)有黑穗病株出現(xiàn)時進行第一次調(diào)查，之后每隔15 d調(diào)查1次，直至發(fā)病情況穩(wěn)定為止。為了判斷新鞭，在發(fā)病蔗莖的每條黑鞭上掛吊牌標記，注明出現(xiàn)日期和順序數(shù)。記錄所有供試材料甘蔗黑穗病黑鞭出現(xiàn)的初始日期、發(fā)病叢數(shù)、總叢數(shù)、發(fā)病莖數(shù)及總莖數(shù)，并計算潛育期（LP）、持續(xù)發(fā)病期（SDD）、累計叢發(fā)病率（IP）、累計莖發(fā)病率（IS）和病情進展曲線下的面積（AUDPC）等5個病情參數(shù)。病情進展曲線下的面積（AUDPC）計算公式如下：AUDPC=（IS1+IS2）/2×（t2-t1），其中IS1和IS2分別是相鄰調(diào)查的IS，t2和t1分別是相鄰調(diào)查時間。

1.2.5 甘蔗抗黑穗病抗性分級 甘蔗黑穗病的分級參照前人1～9級分級標準進行抗性分級[14]，詳見表1。本試驗采用最終的累計莖發(fā)病率來確定供試材料的抗性水平，并且以3個重復中抗性較差的來確定該品種的抗性級別。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用DPS14.10版軟件進行相關性分析、方差分析和聚類分析[15]。相關分析類型選擇Pearson相關；對數(shù)據(jù)進行反正弦平方根轉(zhuǎn)換后，采用SNK法進行多重比較，得出方差分析結果；對5個病情參數(shù)SSD、LP、IS、IP和AUDPC的數(shù)據(jù)進行標準化轉(zhuǎn)換后，采用卡方距離x2和類平均法（UPGMA）對試驗材料進行系統(tǒng)聚類分析，評價試驗材料的抗病性。

2 結果與分析

2.1 病害參數(shù)間的相關分析

5個病情參數(shù)的相關分析結果（表2）表明，LP與SDD、IP、IS、AUDPC之間呈負相關，且均達到極顯著水平，說明潛育期的長短會顯著影響病情。SDD是衡量甘蔗抗再侵染能力的重要指標，其與IP、IS、AUDPC之間均存在極顯著的正相關，表明在整個病害流行季節(jié)中，抗再侵染能力的強弱對甘蔗抗病性的表型性狀存在顯著的影響。IP、IS與AUDPC三者之間均呈正相關，相關性均達到極顯著水平。因此，5個病情參數(shù)均與甘蔗黑穗病抗性關系密切，是甘蔗抗黑穗病性評價很有價值的指標。其中，IS與AUDPC之間的相關系數(shù)最大，高達0.990，這主要是由于在計算AUDPC過程中涉及到IS這一指標。

2.2 黑穗病抗性表現(xiàn)

供試的27份材料中，CP06-2874、CP07-1618、CP09-4147、CP09-4369、CP09-4448和CP09-4707等6個品種未發(fā)病，占參試品種數(shù)的22.22%，其余21個品種均有不同程度的發(fā)病表現(xiàn)，其中CP06-3051、CPCL06-3179、CP07-2137、CP07-2518這4個品種只有1個重復發(fā)病，病情參數(shù)值詳見表3。ROC22的累計叢發(fā)病率和累計莖發(fā)病率均最高，CPCL06-3477的病情進展曲線面積最大。參試材料的抗性級別和抗性水平根據(jù)最終累計莖發(fā)病率來劃分（見表1），抗性水平為HR的品種5個，占18.52%；抗性水平為R的品種10個，占37.04%；抗性水平為MR的品種1個，占3.70%；抗性水平為MS的品種2個，占7.41%；抗性水平為S的品種3個，占11.11%；沒有出現(xiàn)抗性水平為HS的品種。抗性鑒定的標準對照種F134、NCo310、NCo376、Ya71-374的抗性水平依次為R、MS、R、S。廣西蔗區(qū)主栽品種ROC22、GT29、GT42的抗性水平依次為S、R、R。主栽品種的IS與標準對照種的IS相比，在0.01水平上，ROC22與NCo310和Ya71-374之間差異不顯著，GT29、GT42與F134和NCo376之間差異不顯著。

2.3 聚類分析

聚類分析結果表明，供試材料的黑穗病抗性表現(xiàn)具有豐富的多樣性（圖1）。除CP06-2874、CP07-1618、CP09-4147、CP09-4369、CP09-4448和CP09-4707等6個品種未發(fā)病，自成1類，不參加聚類外，當閾值為0.52時，其余21個品種可分為4類。第Ⅰ類：包含5個品種，分別為CP06-3051、CPCL06-3179、CP07-2518、F134和CPCL06-3458，總體特征為潛育期長，持續(xù)發(fā)病期短，發(fā)病率低，抗性水平高。第Ⅱ類：包含GT29、GT42等10個品種，抗性水平比第Ⅰ類低，但是病情進展也比較緩慢，AUDPC值為1.79～4.36。第Ⅲ類：包含3個品種，分別為CP09-4256、NCo310和CP06-2897，表現(xiàn)為累計叢發(fā)病率平均達到20%以上，累計莖發(fā)病率平均達到10%以上，抗性水平中等。第Ⅳ類：包含3個品種，分別為ROC22、CPCL06-3477和Ya71-374，總體表現(xiàn)為潛育期短，持續(xù)發(fā)病期長，發(fā)病率最高，抗性最差。

3 討論與結論

甘蔗黑穗病的抗性評價通常采用最大累計莖發(fā)病率，也有采用最大累計叢發(fā)病率，個別采用病情進展曲線下的面積[16]。無論采用何種病情指數(shù)作為抗性評價的指標均為單一的指標。本試驗的相關分析結果表明，所調(diào)查的5個病情參數(shù)之間相關性均達極顯著水平，多指標的抗性綜合評價更為客觀。此外，在試驗中設置標準對照種也是必要的，盡管前人的分級標準中明確規(guī)定了發(fā)病率值所對應的抗性等級，但由于抗性的表現(xiàn)是品種（寄主）、病原小種（寄生物）和環(huán)境等因素共同作用的結果，所以抗性的表現(xiàn)及發(fā)病率的高低并非只取決于品種本身的抗性[17]，可以通過供試材料與標準對照種有關參數(shù)值的差異顯著性分析和聚類分析對鑒定材料做出評價，而不單依據(jù)病情參數(shù)的絕對值大小來判斷，降低了因環(huán)境互作影響表型而誤判的風險。

根據(jù)前人研究，普遍認為中國大陸的甘蔗黑穗病病菌小種存在小種1和小種2[18-19]。夏紅明等[20-21]認為，標準對照種F134和NCo310在接種不同的黑穗病菌后，田間的抗性表現(xiàn)不同，并以此來判斷小種的類型。筆者在前期研究中通過綜合應用BSA和SSR標記技術，獲得了一個同時抗2個小種的抗性連鎖標記[22]，后期也可以利用此技術作輔助鑒定。沈萬寬等[13]通過相異交配型1 ∶ 1的混合菌體注射接種甘蔗小苗，發(fā)現(xiàn)接種菌株的致病力明顯強于小種1和小種2的致病力，表明極有可能存在新的黑穗病菌小種。

甘蔗對黑穗病菌的抗性有形態(tài)學抗性、生理生化和分子水平抗性[23-27]。前人的研究結果表明，芽的大小、芽的深淺、芽鱗的緊湊程度、萌發(fā)孔的位置等結構特點以及芽的萌芽與否都對甘蔗品種的抗病性有顯著影響[28-30]。浸漬接種與其他研究中所采用的針刺接種[22]和注射接種[13]的方法相比，接種后的黑穗病發(fā)病率相對較低，但因其未破壞甘蔗植株及芽的形態(tài)學抗性，故其黑穗病抗性鑒定結果比較接近田間黑穗病的實際發(fā)生情況，抗性鑒定結果更合理。

采用浸漬法人工接種黑穗病抗性鑒定結果表明，從美國引進的20份甘蔗種質(zhì)材料，除CP09-4256、CP06-2897和CPCL06-3477這3個品種抗性較差外，其余材料抗性較強。其中CP06-2874、CP06-3051等10個品種表現(xiàn)為高抗黑穗病，可考慮選擇作為甘蔗黑穗病抗病育種的親本材料。廣西蔗區(qū)主栽品種ROC22在本試驗中發(fā)病率最高，表現(xiàn)為感病品種，試驗結果與前人研究一致[4，31-32]。近年來ROC22在田間自然感染黑穗病的發(fā)生率較高，導致廣西蔗區(qū)黑穗病發(fā)生嚴重，經(jīng)濟損失重大，不宜再擴大種植和推廣。GT29和GT42為廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所新近育成品種，在本試驗中鑒定為抗病品種，與往年試驗結果一致[33-34]，目前在廣西的種植面積不斷擴大，有望代替ROC系列品種，也可作為甘蔗黑穗病抗病育種的親本材料。由于本試驗只對供試材料進行了秋季新植蔗的抗性鑒定，缺少對宿根蔗的試驗觀察，然而抗性等級與作物季和年份的相關顯著[35]，且甘蔗對黑穗病抗性遺傳是中度可重復[36]，所以參試材料仍需多年多點鑒定，才能保證評價的準確性。

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