巴西橡膠樹(shù)冷應(yīng)答基因HbCOR47的鑒定與表達(dá)分析

程漢 陳相 黃華孫

摘 要 前期研究表明，在橡膠樹(shù)中存在著1個(gè)CBF信號(hào)途徑，然而該信號(hào)通路的下游COR家族功能基因卻一直未能被發(fā)掘。本研究通過(guò)檢索橡膠樹(shù)低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)COR47基因。通過(guò)對(duì)該基因的克隆、測(cè)序和生物信息學(xué)分析，表明HbCOR47可能是橡膠樹(shù)中唯一的COR家族成員。對(duì)該基因的低溫誘導(dǎo)表達(dá)特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HbCOR47受到低溫誘導(dǎo)表達(dá)，但反應(yīng)時(shí)間較擬南芥等溫帶植物的COR基因晚。針對(duì)HbCOR47基因的特性及其表達(dá)特征，結(jié)合橡膠樹(shù)CBF信號(hào)途徑的特征進(jìn)行了進(jìn)一步討論。

關(guān)鍵詞 橡膠樹(shù)；低溫應(yīng)答；CBF信號(hào)途徑；HbCOR47

中圖分類號(hào) Q78；S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract A CBF pathway was found existed in rubber trees in our previous study， while its downstream functional COR family genes were not identified yet until now. In this study， a COR47 homolog gene was identified by searching the rubber tree cold induced transcriptome data. Then the HbCOR47 gene was cloned， sequenced and bioinformatically analyzed， which was revealed to be the only one COR family member in H. brasiliensis. The expression of HbCOR47 exhibited a cold induced expression profile， while the responding pattern was relatively slow when compared with those in Arabidopsis. Finally， the characterization of HbCOR47 gene and CBF pathway of rubber tree were discussed in the context of non-cold acclimation plants.

Key words Hevea brasiliensis； Cold responding； CBF pathway； HbCOR47

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.013

巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）是天然橡膠的主要來(lái)源。20世紀(jì)我國(guó)在北緯18°大規(guī)模成功種植巴西橡膠樹(shù)，建立了海南、云南和廣東三大植膠區(qū)，基本保障了我國(guó)對(duì)天然橡膠的需求[1]。然而由于巴西橡膠樹(shù)起源于熱帶，對(duì)低溫極其敏感，加上我國(guó)植膠區(qū)處于熱帶北緣，時(shí)常受到冬春寒潮的影響。低溫寒害是限制我國(guó)天然橡膠種植的主要環(huán)境限制因子之一。建國(guó)后平均每隔10年就會(huì)遇到一次大的寒潮，造成橡膠樹(shù)大范圍死亡，給廣大膠農(nóng)和農(nóng)場(chǎng)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也威脅到我國(guó)天然橡膠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]。因此，抗寒育種始終是我國(guó)橡膠樹(shù)育種的一個(gè)主要研究方向。

開(kāi)展橡膠樹(shù)抗寒生理機(jī)制研究，一方面能弄清橡膠樹(shù)遭受寒害后的生理學(xué)變化，為橡膠樹(shù)抗寒栽培提供理論支持；另一方面可以摸清橡膠樹(shù)低溫應(yīng)答信號(hào)通路，克隆橡膠樹(shù)中與抗寒相關(guān)的功能基因。CBF信號(hào)通路是近年來(lái)在植物中發(fā)現(xiàn)的最重要的低溫信號(hào)途徑之一。CBF信號(hào)途徑作為非ABA依賴的低溫應(yīng)答途徑，在溫帶植物應(yīng)對(duì)低溫寒害過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。巴西橡膠樹(shù)起源于熱帶，對(duì)低溫極其敏感。之前程漢等[4]在橡膠樹(shù)中克隆了CBF信號(hào)途徑中最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子HbCBF1基因，也對(duì)該基因的表達(dá)特征和生物學(xué)功能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并推測(cè)橡膠樹(shù)中也存在著一個(gè)基于HbCBF1轉(zhuǎn)錄因子的CBF信號(hào)通路[4-6]。但通過(guò)常規(guī)分子生物學(xué)方法，筆者一直未能在橡膠樹(shù)中克隆到CBF信號(hào)通路的下游COR家族功能基因。利用擬南芥COR6.6、COR47、COR15a和RD29a 4個(gè)COR家族蛋白序列對(duì)橡膠樹(shù)低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)搜索，僅得到1條與AtCOR47同源的序列。本研究旨在對(duì)該序列所代表的基因進(jìn)行初步研究，試圖彌補(bǔ)橡膠樹(shù)中CBF信號(hào)通路的下游缺口。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)Solexa測(cè)序的材料來(lái)自巴西橡膠樹(shù)抗寒品種93-114，當(dāng)年嫁接苗保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所苗圃內(nèi)，待第一蓬葉穩(wěn)定后，搬回實(shí)驗(yàn)室中，放置于人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：25 ℃，16 h光照/8 h黑暗。經(jīng)過(guò)一周適應(yīng)性培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)移至設(shè)置為4℃的低溫培養(yǎng)室進(jìn)行低溫處理。分別在0，2，8和24 h取樣，提取總RNA，送交北京百邁客生物公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

菌種E. coli. JM109為國(guó)家橡膠樹(shù)育種中心實(shí)驗(yàn)室保存菌種，Taq酶、pUCm-T載體和DNA凝膠回收試劑盒、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA連接酶等分子生物學(xué)試劑購(gòu)自大連寶生物公司。所有引物及測(cè)序均由廣州英駿生物公司合成完成。其他生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 HbCOR47基因的鑒定和序列分析 由于COR家族基因不根據(jù)序列、而根據(jù)其功能和低溫應(yīng)答特征進(jìn)行分類。各個(gè)COR成員之間沒(méi)有序列同源性。為了全面鑒定橡膠樹(shù)中的COR家族成員，本實(shí)驗(yàn)使用擬南芥COR6.6、RD29a、COR15a和COR47四個(gè)基因的編碼蛋白質(zhì)序列，分別對(duì)橡膠樹(shù)低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行TBLASTN搜索（e-value<0.01），得到候選COR基因HbCOR47。

HbCOR47基因的ORF預(yù)測(cè)通過(guò)NCBI的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）程序進(jìn)行，其氨基酸序列理化特性分析通過(guò)ExPASy的在線軟件Compute PI/MW（http：//au.expasy. org/tools/pi_tool.html）、Protparam tool（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）、http：//www.ch.embnet.org/和NCBI的核酸、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征在線分析工具進(jìn)行。氨基酸功能保守區(qū)通過(guò)NCBI的CD-Search service工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）進(jìn)行預(yù)測(cè)。信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用SignalP 3.0程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進(jìn)行。疏水性圖譜使用ExPASy的ProtScale（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）進(jìn)行。蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)使用TMHMM軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行。亞細(xì)胞定位使用Psort程序（http：//psort.nibb.ac.jp）進(jìn)行分析。

1.2.2 HbCOR47全長(zhǎng)cDNA的克隆 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索得到的結(jié)果，設(shè)計(jì)引物：5′-CTTACGG

TGATCTAGAACAGCAT-3′，5′-CTACAAGCCACAC

ACTTATCATCAT-3′，以擴(kuò)增HbCOR47基因全長(zhǎng)序列。分別從cDNA和基因組DNA上擴(kuò)增目的片段，回收后克隆至T載體，送交廣州英駿公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中的序列進(jìn)行比對(duì)，證實(shí)擴(kuò)增到的序列來(lái)自HbCOR47基因。

1.2.3 基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析 利用在線軟件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對(duì)HbCOR47外顯子/內(nèi)含子組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用MEGA軟件對(duì)橡膠樹(shù)和其他植物的HbCOR47蛋白的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[7]，采用Neighbor-Joining方法，進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

1.2.4 基因的表達(dá)模式分析 基因表達(dá)采用qPCR方法進(jìn)行。橡膠樹(shù)抗寒品種93-114幼苗經(jīng)過(guò)0，0.5，2，8和24 h的低溫處理，提取葉片總RNA，經(jīng)過(guò)DnaseI消化、反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行qPCR分析，以橡膠樹(shù)18S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參，采用ΔΔct法進(jìn)行定量分析。HbCOR47的qPCR引物為5′-TCGTGGGTTGTTTGGTTTCTTGGG-3′，5′-CTCT

TTGTGCTCAGGTTCAGATACG-3′。每個(gè)樣品經(jīng)過(guò)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)實(shí)驗(yàn)學(xué)重復(fù)，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的一致性。表達(dá)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)student t-test進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbCOR47基因的鑒定和序列特征分析

通過(guò)同源性搜索，在橡膠樹(shù)低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中查詢到唯一一個(gè)與擬南芥COR47蛋白具有相似性的序列。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步電子延伸，得到1條1 112 bp的cDNA序列，經(jīng)過(guò)編碼區(qū)查找，發(fā)現(xiàn)其中有1個(gè)編碼224 Aa的蛋白質(zhì)編碼區(qū)。HbCOR47的cDNA序列和推導(dǎo)的編碼區(qū)氨基酸序列如圖1所示。經(jīng)過(guò)初步分析，發(fā)現(xiàn)在HbCOR47基因推導(dǎo)的多肽序列上，有1個(gè)明顯的脫水蛋白結(jié)構(gòu)域（dehydrin domain），該結(jié)構(gòu)域是COR47蛋白的典型特征[8]，因此推測(cè)該多肽與COR47具有同源性，故將該序列所對(duì)應(yīng)的基因初步命名為HbCOR47。

根據(jù)HbCOR47電子延伸序列，從橡膠樹(shù)cDNA中擴(kuò)增目標(biāo)序列，結(jié)果得到1個(gè)1.2 kb左右的DNA片段（圖2），將該片段從瓊脂糖凝膠中回收、克隆，送交測(cè)序。結(jié)果表明該DNA片段的序列與電子延伸的HbCOR47序列完全一致，表明從橡膠樹(shù)低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到的HbCOR47基因是存在的，且序列正確。

2.2 HbCOR47基因結(jié)構(gòu)分析

利用HbCOR47的全長(zhǎng)cDNA序列，搜索橡膠樹(shù)參考基因組序列，得到該基因的上游調(diào)控序列元件和基因結(jié)構(gòu)信息。如圖3所示，HbCOR47基因包含2個(gè)外顯子和1個(gè)104 bp的內(nèi)含子，該內(nèi)含子存在于編碼區(qū)內(nèi)部。檢索該基因的上游調(diào)控序列，還發(fā)現(xiàn)分別在-1 500 bp，-670 bp和-500 bp的位置存在著CRT/DRE轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件（圖3）。由于CRT/DRE元件可與CBF蛋白AP2 domain特異性地結(jié)合， 啟動(dòng)耐寒基因COR的表達(dá)[9]，推測(cè)HbCOR47基因可能是CBF信號(hào)途徑下游基因，受到CBF轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

2.3 HbCOR47編碼多肽序列特征分析

利用EMBOSS的PEPSTATS 工具對(duì)推導(dǎo)的HbCOR47蛋白進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)該推導(dǎo)多肽分子量為25.4 ku，等電點(diǎn)為5.275 6。富含賴氨酸殘基，達(dá)到44個(gè)，占總氨基酸殘基數(shù)目的19.64%。通過(guò)SignalP 3.0程序和ProtScale（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）對(duì)HbCOR47進(jìn)行信號(hào)肽和疏水區(qū)搜索，發(fā)現(xiàn)該蛋白的N端不存在明顯的信號(hào)肽，也沒(méi)有明顯的跨膜區(qū)域。用Psort程序（http：//psort.hgc.jp）分析HbCOR47蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示在第94個(gè)氨基酸殘基位置有一個(gè)KKKKKE

KKGLKEKIKEK的Robbins & Dingwall核定位序列[10]，表明該蛋白有較高可能性（0.973）定位在細(xì)胞核中。同時(shí)，該蛋白還有可能定位到葉綠體，主要存在于基質(zhì)、類囊體膜和間隙中（表1）。

筆者也利用擬南芥的COR47蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果表明，AtCOR47蛋白的亞細(xì)胞定位不同于橡膠樹(shù)，而是定位在細(xì)胞核、線粒體和溶酶體中。通過(guò)對(duì)比橡膠樹(shù)和擬南芥的COR47定位結(jié)果，發(fā)現(xiàn)橡膠樹(shù)COR47有更大的可能性定位到細(xì)胞核中，這個(gè)分值甚至比擬南芥COR47的定位分值還要高很多（表1）。

2.4 HbCOR47蛋白的進(jìn)化分析

將橡膠樹(shù)HbCOR47基因編碼多肽序列與來(lái)自擬南芥（P31168.2）、楊樹(shù)（XP_006383759.1）、蓖麻（XP_

002510636.1）、木薯（AGC51777.1）、可可（XP_007017965.1）、大豆（NP_001240106.1）、樟樹(shù)（XP_006829002.1）等其他植物的COR47基因編碼蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)橡膠樹(shù)HbCOR47蛋白與其他植物的COR47蛋白具有較高的相似性（圖4）。在比對(duì)中也發(fā)現(xiàn)，COR47家族蛋白中存在著數(shù)個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，其中包括核定位特征序列（128～150）和脫水蛋白家族結(jié)構(gòu)域（240～273）。

對(duì)橡膠樹(shù)和其他7種植物的COR47蛋白質(zhì)氨基酸序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明橡膠樹(shù)的COR47蛋白與同樣來(lái)自大戟科的蓖麻和木薯親緣關(guān)系較近，而與擬南芥和樟樹(shù)則關(guān)系較遠(yuǎn)（圖5）。

2.5 HbCOR47基因表達(dá)特征分析

COR47基因是CBF信號(hào)通路下游的功能基因之一，其啟動(dòng)子區(qū)域含有CRT/DRE結(jié)合元件，受到CBF轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[11-14]，因而受低溫誘導(dǎo)表達(dá)。為了檢測(cè)橡膠樹(shù)HbCOR47基因是否具有低溫應(yīng)答特征，利用qPCR技術(shù)對(duì)橡膠樹(shù)HbCOR47基因的表達(dá)模式進(jìn)行了研究。結(jié)果如圖6所示?？梢?jiàn)，HbCOR47基因在常溫下表達(dá)水平極低，在低溫處理前4 h內(nèi)，幾乎看不出表達(dá)量的上升。到第8小時(shí)，HbCOR47基因表達(dá)量幾乎上升了1倍，達(dá)到極顯著差異水平。隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，HbCOR47的表達(dá)量還在進(jìn)一步上升。HbCOR47基因表現(xiàn)出了典型的低溫誘導(dǎo)表達(dá)特征，表明該基因作為CBF信號(hào)通路下游功能基因的同源基因，參與了橡膠樹(shù)低溫應(yīng)答途徑。

3 討論

CBF信號(hào)通路包括CBF轉(zhuǎn)錄因子家族成員和下游的COR家族功能基因，構(gòu)成一個(gè)完整的低溫應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制。然而在非低溫馴化植物中，雖然發(fā)現(xiàn)了CBF家族基因，但對(duì)其下游的COR家族成員研究較少。筆者也曾經(jīng)在橡膠樹(shù)中克隆了CBF家族基因，但一直未能發(fā)現(xiàn)其下游功能基因。在本研究中，筆者通過(guò)深度轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，從橡膠樹(shù)中發(fā)現(xiàn)并克隆、分析了可能唯一的COR家族成員，并研究其特性及其低溫應(yīng)答特征。該研究對(duì)于進(jìn)一步闡述橡膠樹(shù)的低溫應(yīng)答機(jī)制、特別是其CBF信號(hào)通路的功能具有重要意義。

經(jīng)過(guò)研究，發(fā)現(xiàn)HbCOR47蛋白與擬南芥、楊樹(shù)等其他植物中的COR47蛋白同源，也含有一個(gè)脫水蛋白結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞核定位特征序列。需要指出的是，通過(guò)生物信息學(xué)方法分析HbCOR47蛋白的亞細(xì)胞定位，卻發(fā)現(xiàn)該蛋白非常有可能定位到細(xì)胞核中。這是之前的研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)過(guò)的。COR47蛋白含有脫水蛋白（dehydrin）結(jié)構(gòu)域，屬于脫水蛋白家族。脫水蛋白作為干旱和低溫應(yīng)答蛋白，在植物細(xì)胞受到非生物脅迫時(shí)，起到保護(hù)細(xì)胞的膜系統(tǒng)的作用。由于COR47蛋白不是轉(zhuǎn)錄因子，也沒(méi)有轉(zhuǎn)錄結(jié)合調(diào)控結(jié)構(gòu)域，因此推測(cè)HbCOR47蛋白定位到細(xì)胞核與保護(hù)橡膠樹(shù)細(xì)胞核的膜系統(tǒng)有關(guān)。但由于對(duì)COR47蛋白生物學(xué)功能的研究較少，需要更多的分子生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的證據(jù)才能支持該推論。

筆者之前的研究中證明了橡膠樹(shù)HbCBF1蛋白具有體外結(jié)合CRT/DRE結(jié)合元件的功能[4-5]，表明在橡膠樹(shù)中也存在CBF信號(hào)途徑，然而由于未能發(fā)現(xiàn)下游的COR家族基因，因而推測(cè)橡膠樹(shù)的CBF信號(hào)途徑是不完善的。本研究中通過(guò)搜索RNA-seq數(shù)據(jù)，找到一個(gè)COR47同源基因，同時(shí)也證明該基因是低溫應(yīng)答基因。表明橡膠樹(shù)中也存在CBF下游基因。然而，與擬南芥等溫帶植物不同的是，在擬南芥中至少存在8個(gè)COR家族蛋白[14]，在橡膠樹(shù)卻只找到一個(gè)COR47蛋白，在數(shù)量上比擬南芥少了很多。此外，在之前的研究中，筆者克隆了橡膠樹(shù)的HbCBF1基因，也證明了該基因具有調(diào)控CRT/DRE轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的作用。COR47作為CBF的下游功能基因，它對(duì)低溫應(yīng)答往往要比CBF基因慢。在擬南芥中，CBF1基因受低溫誘導(dǎo)15 min后即可表達(dá)，而COR47則要等到2 h之后[15-17]。在橡膠樹(shù)中，筆者發(fā)現(xiàn)HbCBF1基因在低溫處理4 h后才開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)，而HbCOR47則在低溫處理8 h后才開(kāi)始進(jìn)行低溫響應(yīng)。橡膠樹(shù)的CBF1和COR47蛋白的低溫應(yīng)答時(shí)間明顯比擬南芥晚很多，表明橡膠樹(shù)CBF信號(hào)途徑對(duì)低溫反應(yīng)相對(duì)遲鈍。這兩個(gè)因素可能決定了橡膠樹(shù)中的CBF信號(hào)途徑在橡膠樹(shù)的低溫應(yīng)答方面功能較弱，這也許也是橡膠樹(shù)對(duì)低溫敏感的原因之一。

當(dāng)然，本研究?jī)H僅對(duì)橡膠樹(shù)COR47基因進(jìn)行了初步研究，目前也只能推測(cè)HbCOR47是HbCBF1的下游基因。這些推論還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。未來(lái)研究將著重從COR47的生理功能和HbCBF1對(duì)HbCOR47的調(diào)控作用方面開(kāi)展，努力揭示橡膠樹(shù)CBF信號(hào)途徑的應(yīng)答狀態(tài)和生理功能。

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