任海霞 楊鵬 郭惠東 任鵬飛 李瑾 宮志遠(yuǎn)

摘要：采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)黑曲霉FSDZH-l搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：其最佳培養(yǎng)基配方（g/L）為：玉米粉40.0，蛋白胨3.0，（NH₄）₂SO₄2.0，Na₂HPO₄0.5，MgSO₄0.2，F(xiàn)eS04·7H₂O0.1，CaCO₃0.5。在最佳培養(yǎng)基條件下，發(fā)酵液酶活力可達(dá)315.6U/mL。

關(guān)鍵詞：黑曲霉；纖維素酶；培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S182

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A

文章編號(hào)：1001-4942（2016）01-0067-04

纖維素是地球上分布最廣的碳水化合物，同時(shí)又是自然界中數(shù)量最大的可再生資源 。在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生活廢料中，纖維素含量占有相當(dāng)大的比重。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年產(chǎn)生農(nóng)作物秸稈7億噸左右，目前這些秸稈通常被大量焚燒，不僅污染環(huán)境，而且浪費(fèi)資源 。利用微生物降解纖維素因具有效率高、無(wú)污染、作用條件溫和、節(jié)約等優(yōu)點(diǎn)而成為當(dāng)前熱點(diǎn)之一，具有很大的應(yīng)用潛力 。利用微生物處理纖維素其核心技術(shù)是優(yōu)良的纖維素酶生產(chǎn)菌株及其產(chǎn)酶技術(shù) 。而產(chǎn)酶過(guò)程是非常復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，因此，研究菌體的代謝規(guī)律以及影響菌體產(chǎn)纖維素酶的各種營(yíng)養(yǎng)因素和環(huán)境因素非常重要。本研究主要采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)影響產(chǎn)酶的各營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，以獲得黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）FSDZH-1，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要原料和試劑

小麥粉、玉米粉、玉米漿、豆粕粉、羧甲基纖維素鈉（美國(guó)Sigma公司），其它化學(xué)試劑。

1.3培養(yǎng)基及發(fā)酵條件

1.3.1 斜面培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基

1.3.2 初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基 淀粉3g，Na₂HPO₂0.1g， NaNO₃0.5g，CaCO₃0.05g，MgSO₄0.015g，F(xiàn)e-SO₄·7H₂O0.005g，水100mL，pH 7.0，121℃滅菌20min。

1.3.3 發(fā)酵條件將斜面菌種制成孢子懸液，接種于80mL基本培養(yǎng)基（500mL三角瓶）中，接種量為7.5×10⁴孢子/mL發(fā)酵液，30℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)32h。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化①單因素試驗(yàn)：在初始培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，依次以6種常見碳源（見表1）分別代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源、以常見的幾種無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源（見表2）代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源（添加量以N元素濃度相等為依據(jù)）以及不同濃度的MgS04、FeS04.7H20、CaCO。等無(wú)機(jī)鹽，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，通過(guò)纖維素酶活力篩選最適碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及相應(yīng)的濃度。

②正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)確定的最適Mg-SO₄、FeSO₄·7H₂O、CaCO₃濃度基礎(chǔ)上選擇不同濃度的玉米粉、蛋白胨、（NH₄）₂SO₄、NaNO₃、Na₂HPO₄進(jìn)行五因素四水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Latin正交軟件進(jìn)行處理，通過(guò)纖維素酶活力確定該菌株產(chǎn)纖維素酶最佳培養(yǎng)基。

1.4.2 纖維素酶活力測(cè)定 取1.0%羧甲基纖維素鈉溶液1.8mL，50℃預(yù)熱5min，準(zhǔn)確加入適當(dāng)稀釋酶液200μL，在50℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30min，立即分別加入DNS試劑3mL，空白管中加入滅活酶液200μL，立即沸水浴10min，終止反應(yīng)。冷卻后定容至25mL，于540nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品管中OD值，通過(guò)DNS法測(cè)定還原糖含量，并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算酶活力。

酶活力單位定義：在50℃反應(yīng)條件下，每分鐘從濃度為1%的羧甲基纖維素鈉溶液中釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)活力單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源物質(zhì)對(duì)產(chǎn)酶的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明玉米粉是最佳碳源，發(fā)酵液酶活達(dá)到了108.90U/mL，小麥粉次之，淀粉作為碳源，發(fā)酵液的相對(duì)酶活力也達(dá)80%以上。而葡萄糖等低聚糖作為碳源產(chǎn)酶較低，可能是因?yàn)樗鼈儾恍枰饷傅乃饩湍鼙患?xì)胞直接利用，對(duì)纖維素酶的合成產(chǎn)生了阻遏作用。

2.2 不同氮源物質(zhì)對(duì)產(chǎn)酶的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，有機(jī)氮源的酶活普遍高于無(wú)機(jī)氮源，與孫旭東等結(jié)論相近。蛋白胨、玉米漿作為有機(jī)氮源時(shí)，發(fā)酵液都有較高酶活，而且無(wú)機(jī)和有機(jī)混合作為氮源，發(fā)酵液酶活力普遍高于單獨(dú)使用有機(jī)或無(wú)機(jī)氮源。（NH₄）₂SO₄和蛋白胨混合作為氮源時(shí)，發(fā)酵液酶活最高，達(dá)到了214.54U/mL，可能是因?yàn)椋∟H₄）₂SO₄中的NH4+是比較容易被微生物利用的“速效氮源”，而蛋白胨中氨基酸含量比較高，也是易被菌體吸收利用的長(zhǎng)效氮源。

2.3 MgSO₄濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，Mg²⁺是金屬離子中較為重要的一種。本研究在培養(yǎng)基中添加不同量的MgSO₄，檢測(cè)發(fā)酵液的酶活。圖1結(jié)果表明，MgSO₄最適濃度為0.2g/L，超過(guò)0.2g/L會(huì)抑制酶的活性。2.4FeSO₄·7H₂O濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

鐵是維持微生物代謝活動(dòng)必需的微量元素之一。本研究在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加不同濃度的FeSO₂·7H₂O，檢測(cè)發(fā)酵液酶活。圖2結(jié)果表明，F(xiàn)eSO₄·7H₂O的最適濃度為0.10g/L，F(xiàn)e²⁺過(guò)量或不足都會(huì)影響發(fā)酵液酶活。

2.5 CaCO₃濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

鈣一般不參與微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)，但它是某些酶的激活劑，還可調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，而且鈣離子能調(diào)節(jié)細(xì)胞透性，對(duì)纖維素酶也有一定的激活作用。圖3結(jié)果可以看出，CaCO₃的最適濃度0.5g/L。

2.6 正交試驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基配方

前面分析了培養(yǎng)基中各單因素對(duì)產(chǎn)酶的影響，但在產(chǎn)酶過(guò)程中往往各個(gè)因素之間還有較大的影響，因此需要對(duì)各因素進(jìn)行綜合考察確定最佳產(chǎn)酶條件，尤其是選擇合適的碳、氮源濃度及碳氮比對(duì)菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶有直接關(guān)系。通過(guò)正交試驗(yàn)既可以確定合適的碳氮比和碳、氮源濃度，也可以從多個(gè)因素中分析主次，分析各因素對(duì)產(chǎn)酶的影響規(guī)律，還可以考察各個(gè)因素的相互作用對(duì)產(chǎn)酶的影響，從而得出最佳產(chǎn)酶條件。

由表3可知，玉米粉濃度是影響最顯著的因素，玉米粉濃度在40.0g/L以下時(shí)，發(fā)酵液酶活力隨小麥粉濃度的增大而增大，玉米粉濃度大于40.0g/L時(shí)，發(fā)酵液酶活力不再增長(zhǎng)，主要是因?yàn)槌跏继菨舛忍哂绊懥巳苎?，而且也抑制了菌體生長(zhǎng)，因而影響了產(chǎn)酶。五個(gè)因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的顯著性依次為A>B>C>E>D，最佳條件分別為A₃B₂C₂D₁E₂，即最適濃度（g/L）為玉米粉40，蛋白胨3.0，（NH₄）₂SO₄2.0，NaNO₃0，Na₂HPO₄0.5。按培養(yǎng)基配方（g/L）為玉米粉40.0，蛋白胨3.0，（NH₄）₂SO₄2.0，NaNO₃0，Na₂HPO₄0.5， MgSO₄0.2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.1，CaCO₃0.5進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵液纖維素酶活力315.60U/mL，每毫升發(fā)酵液比處理10高出9.24U。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)黑曲霉FSDZH-1產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基的研究，得出最佳培養(yǎng)基為（g/L）：玉米粉40.0，蛋白胨3.0，（NH₄）₂SO₄2.0，Na₂HPO₄0.5，MgSO₄0.2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.1，CaCO₃0.5。每毫升發(fā)酵液酶活力達(dá)315.6U，而且黑曲霉的酶系比較豐富，有進(jìn)一步深入研究進(jìn)而實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。但是搖瓶發(fā)酵工藝和大罐發(fā)酵工藝還不盡相同，如果擴(kuò)大生產(chǎn)，還需要在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵罐工藝，以獲得最佳生產(chǎn)參數(shù)。