劉文波　李平　鄔國(guó)良　林春花　繆衛(wèi)國(guó)　鄭服叢

摘 要 研究南繁區(qū)棉花炭疽病菌的生物學(xué)特性為篩選其殺菌劑提供理論依據(jù)。從海南省南繁棉花區(qū)采集病樣分離得到病原菌，對(duì)病原菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明：棉花炭疽病菌（HNNC8）菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好；菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的最適溫度分別為25和30℃；最適pH值分別為7～9和6～8；連續(xù)黑暗條件較適合菌絲生長(zhǎng)；菌絲在以麥芽糖、阿拉伯糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好；在以蛋白胨為氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好；病菌分生孢子致死溫度為 55℃水浴處理 5 min。溫度過(guò)高或過(guò)低酸性環(huán)境都會(huì)影響菌絲生長(zhǎng)和分生孢子的萌發(fā)，且不同的碳源、氮源亦會(huì)影響病菌菌絲的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞 棉花 ；棉花炭疽病菌 ；生物學(xué)特性

分類號(hào) 435.621.2+2 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.01.011

Abstract The paper was to study the biological characteristics of Colletotrichum gossypii in Hainan， and preliminarily screen its fungicides. The pathogen was isolated from the infected leaves of cotton collected from breeding in Hainan province， The biological characteristics of C. gossypii. The mycelium had the best growth on the medium with Potato Dextrose Agar. The optimum temperature for mycelial growth and spore germination were 25 and 30℃，and the optimum pH was 7～9 and 6～8， respectively. The continuous dark condition was more suitable for mycelial growth. The suitable carbon sources were maltose， L-arabinose， and the suitable nitrogen sources were peptone. The lethal temperature of spore was 55 ℃ water bath for 5 min. Temperature too high or too low， acidic environment will affect the mycelial growth and spore germination， and different carbon sourceor nitrogen source， will also affect the growth of hypha.

Keywords cotton ； Colletotrichum gossypii Soutllw. ； biological characteristics

棉花是錦葵科（Malvaceae）棉屬（Gossypium）植物，該屬約含50個(gè)種[1]，是世界性重要經(jīng)濟(jì)作物，目前，全世界種植棉花的國(guó)家和地區(qū)有96個(gè)[2]。棉花也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，不僅涉及到農(nóng)業(yè)和紡織業(yè)，而且是中國(guó)農(nóng)民重要的收入來(lái)源，也是我國(guó)外貿(mào)出口的主要商品之一。近年來(lái)，隨著海南省南繁區(qū)棉花育種需求量的不斷增加，使該地區(qū)棉花生產(chǎn)中的病害問(wèn)題也日趨凸顯，由棉花炭疽菌（Colletotrichum gossypii Soutthw.）引起的棉花炭疽病是棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制因素之一。棉花炭疽病在棉花整個(gè)生育期均可以發(fā)生，主要為害棉苗和棉鈴，在多雨潮濕、低溫時(shí)容易發(fā)病，溫度和濕度是影響發(fā)病的重要原因[3]。Miller[4]和Hansford[5]認(rèn)為，多雨高濕是炭疽病菌侵染棉花的重要因素。鈴期高溫多雨及苗期低溫多雨都易導(dǎo)致炭疽病流行[6]。為此，本實(shí)驗(yàn)室在海南省三亞市中國(guó)農(nóng)科院棉花研究所基地、新疆農(nóng)科院三亞棉花基地、三亞藤橋棉花基地及陵水棉花地采集棉花病樣分離得到病原菌，對(duì)該病原菌進(jìn)行了生物學(xué)特性研究，為棉花田間的生產(chǎn)、防治棉花炭疽病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

菌株：2014年9～12月在海南省三亞市中國(guó)農(nóng)科院棉花研究所基地、新疆農(nóng)科院棉花基地、三亞藤橋棉花基地及陵水棉花地采集棉花病樣分離得到病原菌，按照常規(guī)方法進(jìn)行組織分離培養(yǎng)并經(jīng)單孢純化得到10株菌，編號(hào)為HNNC1～10， 通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、柯赫氏法則及ITS鑒定，確定為棉花炭疽菌（C. gossypii Southw） ，PDA 斜面保存。

1.1.2 供試藥劑

D-（+）-木糖（廣州化學(xué)試劑廠），麥芽糖（廣州化學(xué)試劑廠），阿拉伯糖（廣州化學(xué)試劑廠），葡萄糖（廣州化學(xué)試劑廠），乳糖，D-（+）-半乳糖（廣州化學(xué)試劑廠），淀粉（北京索萊寶），硫酸銨（廣州西隴化工），硝酸銨（廣州西隴化工），甘氨酸（廣州西隴化工），蛋白胨（廣州西隴化工），酵母浸膏（北京索萊寶），牛肉浸膏（北京索萊寶），尿素（廣州西隴化工）。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

5 mL滅菌水洗脫培養(yǎng)6 d的病原菌，制成10×40倍鏡視野下 20～30個(gè)孢子濃度的懸浮液。

1.2.2 菌餅的制備

病原菌孢子用無(wú)菌水稀釋為107個(gè)/mL，均勻的涂于PDA平板上， 25℃恒溫培養(yǎng) 3 d 后，用直徑 4 mm 的打孔器打取菌餅。

1.2.3 致病性測(cè)定

參照Viaud等[7]的離體葉片接種法：在磁盤(pán)內(nèi)鋪雙層濾紙，加少量滅菌水。剪取生長(zhǎng)一致的幼嫩棉花葉片，自來(lái)水沖洗后，75%的酒精表面消毒 30 s，滅菌水沖洗3遍，吸干葉表水，平鋪到磁盤(pán)上，用滅菌的針輕輕刺傷棉花葉片，每張葉片刺傷3個(gè)點(diǎn)， 用直徑為4 mm的打孔器在培養(yǎng)好的不同地點(diǎn)的棉花炭疽菌打取菌餅，接于刺傷葉片上。每片葉接3塊菌餅，對(duì)照接相同大小的PDA培養(yǎng)基塊。用保鮮膜封好，置于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，5 d后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.4 棉花炭疽病菌DNA提取及ITS鑒定

接棉花炭疽病菌菌塊（直徑4 mm）于200 mL的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，在 25℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)8 d，倒入滅菌的50 mL的離心管，4 500 r/min 離心10 min ，收集各菌株菌絲，液氮速凍，-80℃下保存?zhèn)溆谩?提取DNA時(shí)取50 mg 菌絲，在液氮中將其研磨成粉末。 DNA的提取方法按照OMGA試劑盒的方法提取[8]，DNA 用濃度測(cè)定儀（Bio-rab，美國(guó)）測(cè)定其濃度。置于冰箱（-20℃）下保存?zhèn)溆谩TS1、ITS4引物在上海生工生物科技有限公司合成。ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應(yīng)程序：參照王芝娜等方法[9]，PCR反應(yīng)體系（25 μL）：10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL dNTPs（各2.5mmol/L）2 μL；引物ITS1/ ITS4各1 μL；模板DNA 1 μL；dd H2O 17.5 μL。PCR的擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性1 min；94℃變性1 min；57℃退火30 s；72℃延伸1 min；最后72℃延伸7 min；35個(gè)循環(huán)。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照，所得產(chǎn)物經(jīng)OMEGA膠回收試劑盒回收，連接到TaKaRa pMDTM18-T Vector Cloning Kit載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，驗(yàn)證陽(yáng)性克隆送華大基因公司測(cè)序。

1.2.5 棉花炭疽病菌生物學(xué)特性研究

1.2.5.1 不同培養(yǎng)基對(duì)棉花炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)基包括PDA培養(yǎng)基、PDA+1‰酵母培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、PSA+1‰酵母培養(yǎng)基、西瓜肉榨汁培養(yǎng)基、西瓜皮榨汁培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基和胡蘿卜培養(yǎng)基。將培養(yǎng)好的棉花炭疽菌，用4 mm的打孔器制成的菌餅移入不同培養(yǎng)基平板中央，每種培養(yǎng)基3次重復(fù)，置于25℃恒溫培養(yǎng)6 d。分別于3和6 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑[10]。

1.2.5.2 溫度對(duì)棉花炭疽菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

將棉花炭疽菌接種在PDA平板上，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35、40℃恒溫培養(yǎng)， 培養(yǎng)和測(cè)量方法參照“1.2.5.1”。用無(wú)菌水稀釋已經(jīng)培養(yǎng)6 d的棉花炭疽菌，用移液槍吸取孢子懸浮液于凹玻片上，置于上述9個(gè)溫度處理保濕培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)6和12 h后，用1%棉藍(lán)乳酚油固定，鏡檢孢子萌發(fā)率（注：分生孢子的萌發(fā)以芽管的長(zhǎng)度超過(guò)分生孢子直徑長(zhǎng)度的50%為標(biāo)準(zhǔn)），每次檢查孢子300個(gè)[10]。

1.2.5.3 pH對(duì)棉花炭疽菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

用1 mol/L的HCl和NaOH溶液，調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12共10個(gè)處理，接棉花炭疽菌于平板中央，培養(yǎng)和測(cè)量方法參照“1.2.5.1”。將棉花炭疽菌的孢子懸浮液調(diào)節(jié)成上述10個(gè)pH處理，培養(yǎng)和計(jì)數(shù)方法參照“1.2.5.2”。

1.2.5.4 光照對(duì)棉花炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響

將棉花炭疽菌接到PDA平板上，置于連續(xù)光照、光/暗交替和連續(xù)黑暗3種光照條件下，培養(yǎng)和測(cè)量方法參照“1.2.5.1”。

1.2.5.5 孢子致死溫度的測(cè)定

用移液槍吸取1 mL棉花炭疽菌的孢子懸浮液于無(wú)菌試管內(nèi)，分別置于40、45、50、55、60 ℃ 恒溫水浴鍋中，每處理分別保持5、10 min后取出迅速冰浴，將各處理的孢子懸浮液滴加于凹玻片上，培養(yǎng)和計(jì)數(shù)方法 參照“1.2.5.2”。

1.2.5.6 碳源和氮源對(duì)棉花炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響

采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Czapek培養(yǎng)基）[11]，分別用D-（+）-木糖、麥芽糖、阿拉伯糖、葡萄糖、乳糖、D-（+）-半乳糖、淀粉7種碳源等量替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖；分別用硝酸銨、硫酸銨、蛋白胨、甘氨酸、牛肉浸膏、酵母浸膏、尿素7種氮源等量替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硝酸鈉。將棉花炭疽菌菌餅接種于不同碳源、氮源培養(yǎng)基平板中央，以無(wú)菌水培養(yǎng)基為對(duì)照。培養(yǎng)和測(cè)量方法參照“1.2.5.1”。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用DPS、Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花炭疽病菌的致病性測(cè)定

將經(jīng)過(guò)單孢分離純化后的棉花炭疽菌分別接種到健康棉花葉片上，5 d后觀察，接種的葉片可以觀察到明顯的癥狀（圖1-D），而對(duì)照的葉片未發(fā)?。▓D1-C）。從葉片的發(fā)病部位分離到與接種菌菌落生長(zhǎng)性狀和分生孢子形態(tài)一致的病原菌（圖1-B）。結(jié)果6株發(fā)病，經(jīng)過(guò)ITS鑒定，其中4株為Colletotrichum gloeosporioide，2株為Colletotrichum gossypii，確定分離到的菌株為棉花炭疽菌。選擇致病性強(qiáng)的HNNC8（C. gossypii）菌株做生物學(xué)測(cè)定。

2.2 棉花炭疽病菌的ITS鑒定

用ITS1、ITS4進(jìn)行PCR-ITS鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得約550 bp大小的片段（圖2）。經(jīng)OMEGA膠回收試劑盒回收，連接到TaKaRa pMDTM18-T Vector Cloning Kit載體，轉(zhuǎn)化DH 5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。每個(gè)菌株隨機(jī)挑取5個(gè)白色菌落進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。所挑選的轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增得到550 bp左右的條帶（圖3），為陽(yáng)性克隆。

取菌液送往深圳華大基因公司測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。經(jīng)NCBI的Blast搜索，棉花炭疽HNNC8菌株與登錄號(hào)為JX844099.1菌株相似性達(dá)99%。經(jīng)NCBI的Nucleotide搜索，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（表1、圖4）。

2.3 棉花炭疽病菌的生物學(xué)特性

2.3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)棉花炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在供試的9種培養(yǎng)基中，棉花炭疽病菌在各種培養(yǎng)基中菌落直徑差異比較明顯。棉花炭疽病菌菌絲在PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，培養(yǎng)3和6 d后菌落平均直徑分別為 4.54和 7.18 cm；其次在PSA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)也較好，分別為 4.26和 6.88 cm；西瓜皮榨汁培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基和燕麥培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 d的菌落平均直徑分別為5.98、5.75和5.65 cm；菌絲在胡蘿卜培養(yǎng)基、PSA+1‰酵母、西瓜肉榨汁培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較差，培養(yǎng)6 d的菌落平均直徑分別為5.44、5.16和 5.05 cm；菌絲在PDA+1%酵母培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差，培養(yǎng)3和6 d的菌落平均直徑分別僅為 3.16和4.93 cm（圖4、表2）。

2.3.2 溫度對(duì)棉花炭疽菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

實(shí)驗(yàn)表明，在PDA平板上，棉花炭疽菌的菌絲在15～35℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，不同溫度條件下菌絲生長(zhǎng)有差異。隨著溫度升高，菌絲生長(zhǎng)速度加快，25℃的溫度最利于菌絲生長(zhǎng)，培養(yǎng)6 d的菌落平均直徑為8.45 cm，極顯著優(yōu)于其他溫度處理；低于15℃或高于30℃時(shí)，不利于病菌菌絲生長(zhǎng)；低于 10℃或高于 40℃時(shí)，病菌菌絲停止生長(zhǎng)（圖5，表3）。

孢子在10～40℃的溫度條件下均可萌發(fā)，低于5℃時(shí)分生孢子不能萌發(fā)，隨著溫度升高，孢子萌發(fā)率也隨之升高，28～30℃最適宜孢子萌發(fā)，經(jīng)過(guò)12 h培養(yǎng)后，萌發(fā)率分別為89%和90%，當(dāng)溫度高于30℃時(shí)，孢子萌發(fā)率明顯降低（圖6）。

2.3.3 pH對(duì)棉花炭疽菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

在供試10種不同pH值的PDA培養(yǎng)基中，棉花炭疽病菌在各種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)存在差異。pH值3～12 時(shí)，菌絲均能生長(zhǎng)，小于4時(shí)菌絲生長(zhǎng)明顯受到抑制，在7時(shí)最適宜菌絲生長(zhǎng)，5～12內(nèi)菌絲生長(zhǎng)差別不明顯（圖7，表4）。

分生孢子在 pH值為 3～12 時(shí)均能萌發(fā)，最適合分生孢子萌發(fā)的 pH 值為 6～8，分生孢子培養(yǎng)12 h 后，其萌發(fā)率分別為88%、90%和89%，pH值較高或較低均不利于棉花炭疽菌孢子萌發(fā)（圖8）。

2.3.4 光照條件對(duì)棉花炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響

棉花炭疽菌在不同光照條件下均能生長(zhǎng)，連續(xù)黑暗條件最利于菌絲生長(zhǎng)，培養(yǎng)3和6 d的菌落平均直徑分別為 5.01和 8.25 cm；其次為光暗交替條件，培養(yǎng) 3和6 d的菌落平均直徑分別為4.75和7.95 cm；連續(xù)光照條件下菌落生長(zhǎng)最慢，培養(yǎng)3和6 d后，菌落平均直徑分別為4.55和7.70 cm（圖9，表5）。

2.3.5 棉花炭疽菌孢子的致死溫度

棉花炭疽病菌分生孢子在45℃水浴處理10 min后萌發(fā)率顯著降低。分生孢子經(jīng)55℃水浴處理5 min后，培養(yǎng)12 h后在顯微鏡下觀察分生孢子，分生孢子無(wú)萌發(fā)，再經(jīng)凹玻片保濕培養(yǎng)48 h仍不見(jiàn)萌發(fā)，分生孢子喪失活性。從實(shí)驗(yàn)可知，棉花炭疽病菌孢子致死溫度為55℃水浴處理5 min。

2.3.6 碳源和氮源對(duì)棉花炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響 供試的7種碳源中，棉花炭疽病菌在各種碳源中菌落直徑差異不大，但麥芽糖、阿拉伯糖作為碳源的培養(yǎng)基較適合病菌菌絲生長(zhǎng)，培養(yǎng)6 d的菌落平均直徑分別為7.16、7.14 cm；以乳糖、D-（+）-木糖和淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)較差，培養(yǎng)6 d的菌落平均直徑分別為6.85、6.47和6.46 cm；而在以葡萄糖和D-（+）-半乳糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最差（圖10，表6）。

供試的7種氮源中，棉花炭疽病菌在各種氮源中菌落直徑差異顯著。在參試氮源中，病菌菌絲在含蛋白胨的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，培養(yǎng)3和6 d的菌落平均直徑為3.95、8.11 cm；以牛肉浸膏、酵母浸膏和甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)較好；而以尿素、硝酸銨和硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基不利于菌絲的生長(zhǎng)（圖11，表7）。

3 討論與結(jié)論

從海南省4個(gè)地方采集棉花病樣，分離得到10個(gè)菌株，經(jīng)致病性測(cè)定及ITS鑒定，確定為棉花炭疽菌的菌株為HNNC5和HNNC8 2個(gè)菌株。4株為Colletotrichumg loeosporioide和楊友聯(lián)等報(bào)道一致[12]，從ITS的鑒定表明，棉花炭疽病是由不同的膠孢復(fù)合群侵染引起[12]。本實(shí)驗(yàn)室選擇了致病性最強(qiáng)的HNNC8做生物學(xué)特性測(cè)定，研究表明，HNNC8菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好。菌絲在15～35℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，25℃最適合菌絲生長(zhǎng)，孢子萌發(fā)的最適溫度為30℃。pH值為3～12時(shí)菌絲均能生長(zhǎng)，pH 值為 7時(shí)最適合菌絲生長(zhǎng)，最適合孢子萌發(fā)的pH 值為6～8。連續(xù)黑暗條件下較適合菌絲生長(zhǎng)。分生孢子致死溫度為55℃水浴處理5 min。供試碳源中，病菌菌絲在含有麥芽糖、阿拉伯糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好；供試氮源中，病菌菌絲在含蛋白胨的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好，這與湯吉[13]觀點(diǎn)一致。在國(guó)內(nèi)，還鮮少有關(guān)棉花炭疽病的生物學(xué)特性的報(bào)道，筆者認(rèn)為，溫度過(guò)高或過(guò)低、酸性環(huán)境都會(huì)影響菌絲生長(zhǎng)和分生孢子的萌發(fā)，不同的碳源、氮源亦會(huì)影響病棉花炭疽菌菌絲的生長(zhǎng)。詳細(xì)了解棉花炭疽病菌的生物學(xué)特性，對(duì)生產(chǎn)中預(yù)防該病的發(fā)生具有指導(dǎo)作用。

海南省南繁育種基地具有獨(dú)一無(wú)二的氣候資源[14]，海南省已成為我國(guó)最大的種子、苗木等育種基地。南繁育種主要是在海南的冬天進(jìn)行，這時(shí)的天氣溫度在10～28℃，而且濕度比較大。特別適合南繁區(qū)棉花炭疽病的發(fā)生[15]，給棉花育種上造成的危害和損失不容忽視。該研究結(jié)果為南繁區(qū)棉花炭疽病的防治奠定病原學(xué)基礎(chǔ)。

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