馮歡歡 張一凡 任雪 徐彩紅

摘要：建立一種維生素D3（VD3）在大鼠體內(nèi)濃度的測定方法，為食品中營養(yǎng)素的生物利用研究奠定基礎(chǔ)。采用RP-HPLC法進(jìn)行檢測分析；采用甲醇沉淀蛋白結(jié)合乙醚液液萃取法進(jìn)行血漿樣品處理。結(jié)果表明：低、中、高3個(gè)濃度VD3的提取回收率分別為87.8%±5.14%，85.4%±3.00%和89.6%±5.71%；日內(nèi)、日間的精密度分別小于5.12%和6.30%。該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，可作為食品、藥學(xué)研究中大鼠體內(nèi)吸收動(dòng)力學(xué)相關(guān)試驗(yàn)研究的檢測分析方法。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；25-羥基維生素D3；大鼠血漿

中圖分類號：R446.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-1161（2016）02-0047-03

維生素D（Vitamin D，VD）是一種脂溶性維生素，見光極易分解，其作用主要是調(diào)節(jié)人體內(nèi)鈣和磷的代謝，促進(jìn)其吸收利用，促進(jìn)骨骼成長[1-2]。VD的主要活性形式有25-羥基維生素D3[25（OH）VD3]，1，25-二羥基維生素D3 [1，25（OH）2VD3]和24，25-二羥基維生素D3[24，25（OH）2VD3]3種。其中25（OH）VD3為血液中VD的主要循環(huán)形式，是顯示VD狀況的一個(gè)最佳指標(biāo)[3]，但其在血清中濃度相當(dāng)?shù)?，一般檢測方法無法檢出[4-5]。為此，本課題參考相關(guān)文獻(xiàn)，建立一種利用高效液相色譜法檢測維生素D3（VD3）的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

維生素D3（VD3，純度99.9%）：中國食品藥品檢定研究院；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）：上海永日藥品貿(mào)易有限公司；甲醇（色譜純）：山東禹王化工制品有限公司；無水乙醚（分析純）：天津凱信化工制品有限公司；其他試劑均為分析純；水為自制二蒸水。

1.2 供試動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量220±30 g，由沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 儀器設(shè)備

1200系列高效液相色譜儀，包括1200泵系統(tǒng)和可調(diào)波長紫外檢測器和工作站：美國Agilent公司；Avanti J-E離心機(jī)：BECKMAN COULTER公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ODS HYPERSIL C18色譜柱（200.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇—水（98∶2，V/V）；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：265 nm；進(jìn)樣量：20 μL；儀器靈敏度：0.001 AUFS。

1.4.2 血漿樣品處理 精密量取大鼠血漿100 μL，置10 mL具塞離心試管中，加入甲醇200 μL，渦旋混合1 min，加入無水乙醚2.0 mL，渦旋3 min，6 000 r/min離心5 min，吸取有機(jī)層1.5 mL置另一5 mL試管中，殘液中再加入無水乙醚2.0 mL。重復(fù)上述提取過程，合并兩次提取液，于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈伞埩粑镉?00 μL流動(dòng)相溶解，渦旋振蕩3 min，將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP離心試管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣，記錄藥物峰面積，并代入當(dāng)天制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算血漿中藥物濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜行為

在本試驗(yàn)所采用的色譜條件和血樣處理方法下，大鼠空白血漿色譜圖見圖1中A；一定濃度的VD3溶液加入空白血漿中的色譜圖見圖1中B，VD3的保留時(shí)間為8.165 min；大鼠給藥后某時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品色譜圖見圖1中C。結(jié)果表明：血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾血漿中藥物濃度測定。藥物色譜峰的理論板數(shù)均不低于2 000，藥物與雜質(zhì)峰的分離度大于2.0。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性關(guān)系與最低定量濃度

在大鼠空白血漿中分別添加適量VD3使血藥濃度相當(dāng)于0.15，0.40，0.60，1.00，2.00和5.00 μg/mL，按血漿樣品處理方法操作，將所得數(shù)據(jù)回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=42.11 x-7.73，R=0.999 0。最低定量濃度為0.125 μg/mL（RSD=7.81%，n=3）。

2.3 精密度

配制低、中、高3個(gè)濃度的VD3大鼠血漿樣品溶液（0.40，1.00，2.00 μg/mL），每一濃度進(jìn)行6個(gè)樣本分析，考察日內(nèi)和日間精密度（見表1）。結(jié)果表明：日內(nèi)、日間精密度（RSD）均小于15%，準(zhǔn)確度（RE）在±10%范圍內(nèi)，均符合生物樣品分析測定的要求。

2.4 提取回收率

配制低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，按血漿樣品處理方法操作，每一濃度進(jìn)行6個(gè)樣本分析，評價(jià)該方法的提取回收率（見表2）。結(jié)果表明：大鼠血漿中VD3低、中、高3個(gè)濃度下的提取回收率均高于80%。

2.5 凍融穩(wěn)定性

取空白大鼠血漿100 μL，分別配制低、中、高3個(gè)濃度的QC樣品，每一濃度進(jìn)行3個(gè)樣本分析，反復(fù)凍融3次，每次復(fù)融后，按血漿樣品處理方法操作，殘留物以100 μL流動(dòng)相溶解，進(jìn)樣分析（見表3）。結(jié)果表明：100 μL血漿樣品中VD3反復(fù)凍融3次后穩(wěn)定。

3 結(jié)論與討論

維生素D是人體生長發(fā)育過程中不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)之一，在維持機(jī)體代謝和預(yù)防疾病方面也發(fā)揮著重要作用。傳統(tǒng)的檢測方法是采用競爭結(jié)合試驗(yàn)和免疫測定法來檢測循環(huán)中總的維生素D（D2和D3），而本試驗(yàn)選擇25（OH）VD3最強(qiáng)吸收波長265 nm處HPLC檢測，采用沉淀蛋白結(jié)合乙醚液液萃取的血漿樣品處理方法，避免了血漿內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好。

VD3在光照條件下不穩(wěn)定，會有一定程度的降解，因此，本試驗(yàn)操作全程避光。血漿樣品的處理中，提取劑的選擇尤為重要，不少研究曾用過不同比例的正己烷與二氯甲烷或正己烷與乙醚的混合溶劑提取[6-9]，但是本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：以二氯甲烷和正己烷（4∶1，V/V）作為提取劑，樣品濃縮吹干耗費(fèi)時(shí)間較長，色譜峰中雜質(zhì)較多；若以純正己烷提取，VD3的提取率較低。經(jīng)過多次嘗試，最終選用甲醇沉淀蛋白，而后采用無水乙醚液液萃取法來提取VD3，結(jié)果表明：VD3的提取率穩(wěn)定在85%以上，色譜圖顯示血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。該檢測方法簡單、靈敏、穩(wěn)定、可靠，適用于大量樣本的分析，尤其適用于食物或藥品中VD3在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究。

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