喻思揚(yáng)，　王　燕，　曾高峰，　劉　洋，　徐健強(qiáng)，　曾夢(mèng)雅，　唐業(yè)華，　曾志英，　石小橋，　陳　瑩，　趙國(guó)軍

(南華大學(xué)附二醫(yī)院 1心血管內(nèi)科， 2麻醉科， 3衡陽(yáng)市中心醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421001； 4桂林醫(yī)學(xué)院組胚教研室，廣西 桂林 541004)

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阿托伐他汀通過(guò)下調(diào)NLRP1炎性體表達(dá)抑制IL-1β和IL-18的釋放*

喻思揚(yáng)1▲，王燕2▲，曾高峰1，劉洋1，徐健強(qiáng)1，曾夢(mèng)雅1，唐業(yè)華3，曾志英2，石小橋2，陳瑩2，趙國(guó)軍4△

(南華大學(xué)附二醫(yī)院1心血管內(nèi)科，2麻醉科，3衡陽(yáng)市中心醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421001；4桂林醫(yī)學(xué)院組胚教研室，廣西 桂林 541004)

[摘要]目的： 探討核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1(NLRP1)炎性體在阿托伐他汀抑制THP-1巨噬細(xì)胞白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-18(IL-18)分泌中的作用。方法: 用10 μg/L脂多糖誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞分泌IL-1β和IL-18，以不同濃度阿托伐他汀(1、10和20 μmol/L)孵育細(xì)胞24 h，或以10 μmol/L阿托伐他汀處理細(xì)胞不同時(shí)間(12、24和48 h)，或轉(zhuǎn)染NLRP1 siRNA以沉默細(xì)胞內(nèi)NLRP1的表達(dá)。采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NLRP1炎性體mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NLRP1炎性體蛋白的表達(dá)，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18的含量。結(jié)果: 阿托伐他汀可抑制THP-1巨噬細(xì)胞NLRP1炎性體mRNA和蛋白的表達(dá)，且這種效應(yīng)呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。轉(zhuǎn)染NLRP1 siRNA后，THP-1巨噬細(xì)胞NLRP1的蛋白表達(dá)明顯下降，且阿托伐他汀對(duì)IL-1β和IL-18分泌的抑制作用明顯增強(qiáng)。結(jié)論: 阿托伐他汀通過(guò)抑制NLRP1炎性體表達(dá)減少巨噬細(xì)胞IL-1β和IL-18的釋放，發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)而延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞]阿托伐他汀； 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1炎性體； 白細(xì)胞介素-1β； 白細(xì)胞介素-18； 動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是一種血管的慢性炎癥性疾病，脂質(zhì)堆積伴固有免疫激活是As的特征性病理改變之一[1]。阿托伐他汀能有效預(yù)防和延緩As形成，這一效果除得益于調(diào)脂作用外，還與其抗炎作用密切相關(guān)[2]。然而，阿托伐他汀是通過(guò)何種機(jī)制發(fā)揮抗炎效應(yīng)，目前不甚清楚。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)是一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的固有免疫模式識(shí)別受體，其能調(diào)控炎性體活化，參與As等疾病的發(fā)展[3-4]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1，NLRP1)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)參與炎性體組成的NLRs成員，廣泛存在于單核-巨噬細(xì)胞中[5-6]，被細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等物質(zhì)激活后，NLRP1可協(xié)同半胱天冬酶-1(caspase-1)和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain，ASC)完成炎性體組裝，促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細(xì)胞介素-18(interleukin-18，IL-18)的釋放，對(duì)炎癥反應(yīng)起重要作用[7]。本研究旨在通過(guò)觀察阿托伐他汀對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞NLRP1炎性體表達(dá)及其下游IL-1β和IL-18分泌的影響，探討阿托伐他汀的抗炎機(jī)制，為深入認(rèn)識(shí)阿托伐他汀的非調(diào)脂作用提供新依據(jù)。

材料和方法

1細(xì)胞、主要試劑和儀器

THP-1細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞中心；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、LPS購(gòu)于Sigma；阿托伐他汀鈣購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；RNA抽提試劑購(gòu)自GeneCopoeia；Reverse Transcription System購(gòu)自Promega；TaqMan? Gene Expression Master Mix購(gòu)于Applied Biosystems；NLRP1、caspase-1、ASC和β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；NLRP1、caspase-1和ASC兔抗人 I 抗購(gòu)自Life Technologies；β-actin antibody購(gòu)于Immunechem；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔 II 抗購(gòu)自Santa Cruz；jetTEI轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Polyplus；人IL-1β和IL-18酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；CO2培養(yǎng)箱為BiNEDER CB150；電泳裝置及凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含青霉素和鏈霉素各1.0×105U/L。培養(yǎng)2～4代后，將狀態(tài)良好、呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前以100 nmol/L PMA刺激細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)其分化為貼壁的巨噬細(xì)胞，換不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，予以相應(yīng)的處理因素。

2.2RT-PCR采用TRIzol法提取總RNA，測(cè)定RNA樣品的純度和含量。取1 μg RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，建立20 μL反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)循環(huán)為50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min(40個(gè)循環(huán))。取5 μL反應(yīng)底物，瓊脂糖凝膠電泳，電泳后凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像。引物序列和PCR產(chǎn)物片段大小見(jiàn)表1。

表1　RT-PCR的引物序列

F: forward; R:reverse.

2.3Western blot提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，S-麗春紅染色觀察PVDF膜上的蛋白條帶，以明確轉(zhuǎn)膜效率。將PVDF膜置入用TBST配制的含5%脫脂牛奶的封閉緩沖液中，室溫封閉2 h，加入TBST稀釋過(guò)的 I 抗，4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。室溫復(fù)溫后，TBST洗膜3次，每次10 min，加入TBST稀釋過(guò)的 II 抗，室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。使用高靈敏ECL發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，采集圖像后保存。

2.4RNA干擾根據(jù)GenBank中人NLRP1 mRNA序列設(shè)計(jì)siRNA，經(jīng)BLAST明確其特異性。人NLRP1 siRNA的正義鏈序列為5’-UUAAAAUCCUCAUUUUUCCAG-3’，反義鏈序列為5’-GGAAAAAUGAGGAUUUUAACC-3’；另設(shè)計(jì)陰性對(duì)照siRNA的正義鏈序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列為5’-ACUUGACACGUUCGGAGAATT-3’；并在BLAST中對(duì)其進(jìn)行同源性分析，確定與其它基因無(wú)同源性。用jetTEI轉(zhuǎn)染試劑將siRNA轉(zhuǎn)染至THP-1巨噬細(xì)胞(具體操作按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行)，48 h后采用Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率。

2.5ELISATHP-1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，加入各種處理因素后，收集各孔上清液，IL-1β、IL-18含量的測(cè)定嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品實(shí)際濃度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析, 兩兩比較使用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1不同濃度阿托伐他汀對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞NLRP1炎性體表達(dá)的影響

THP-1巨噬細(xì)胞經(jīng)10 μg/L LPS及不同濃度(1、10和20 μmol/L)的阿托伐他汀處理24 h后，采用RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)NLRP1、caspase-1和ASC mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果顯示LPS組NLRP1、caspase-1和ASC的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05)；經(jīng)不同濃度阿托伐他汀處理后NLRP1、caspase-1和ASC的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)較LPS組則明顯下降(P<0.05)，且濃度越大，下降越明顯，表明阿托伐他汀可呈濃度依賴(lài)性抑制THP-1巨噬細(xì)胞NLRP1炎性體mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，見(jiàn)圖1、2。

2阿托伐他汀作用不同時(shí)間對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞NLRP1炎性體表達(dá)的影響

以10 μg/L LPS及10 μmol/L阿托伐他汀處理THP-1巨噬細(xì)胞不同時(shí)間(12 h、24 h和48 h)后，采用RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)NLRP1、caspase-1和ASC的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果顯示LPS組NLRP1、caspase-1和ASC的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05)；經(jīng)阿托伐他汀處理不同時(shí)間后NLRP1、caspase-1和ASC的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)較LPS組則明顯下降(P<0.05)，且作用時(shí)間越長(zhǎng)，下降越明顯，表明阿托伐他汀可呈時(shí)間依賴(lài)性抑制THP-1巨噬細(xì)胞NLRP1炎性體mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，見(jiàn)圖3、4。

Figure 1.The effect of different concentrations of atorvastatin on mRNA expression of NLRP1 inflammasome in THP-1 macrophages. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

圖1不同濃度阿托伐他汀對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞NLRP1炎性體mRNA表達(dá)的影響

3NLRP1 siRNA對(duì)阿托伐他汀抑制THP-1巨噬細(xì)胞IL-1β和IL-18分泌的影響

為了進(jìn)一步研究NLRP1炎性體在阿托伐他汀抑制THP-1巨噬細(xì)胞IL-1β和IL-18分泌中的作用，我們轉(zhuǎn)染NLRP1 siRNA以沉默細(xì)胞內(nèi)NLRP1的表達(dá)。然后觀察各組細(xì)胞IL-1β和IL-18水平的變化，結(jié)果顯示與單純LPS組比較，LPS+ATO組或LPS+NLRP1 siRNA組的IL-1β和IL-18分泌顯著減少(P<0.05)；而且，與LPS+ATO組或LPS+NLRP1 siRNA組比較，ATO+NLRP1 siRNA共處理細(xì)胞可使LPS誘導(dǎo)的IL-1β和IL-18分泌進(jìn)一步減少(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染NLRP1 siRNA下調(diào)NLRP1表達(dá)能夠促進(jìn)阿托伐他汀對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞IL-1β和IL-18分泌的抑制作用，見(jiàn)圖5。

Figure 2.The effect of different concentrations of atorvastatin on protein expression of NLRP1 inflammasome in THP-1 macrophages. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

圖2不同濃度阿托伐他汀對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞NLRP1炎性體蛋白表達(dá)的影響

討論

血脂代謝異常可通過(guò)啟動(dòng)免疫應(yīng)答和誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管內(nèi)壁斑塊形成，進(jìn)而加速As的發(fā)生發(fā)展[8]。降脂藥阿托伐他汀作為目前最有效的抗As藥物之一，已被證實(shí)具備明顯的抗炎效應(yīng)[9]，但其中的具體機(jī)制仍不清楚。NLRP1炎性體是一個(gè)由NLRP1、caspase-1和ASC構(gòu)成的多蛋白寡聚體，受體蛋白NLRP1是其活化和發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子，與相關(guān)配體結(jié)合后，NLRP1能啟動(dòng)炎性體的自我激活，促使IL-1β和IL-18前體分子轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓拇傺准?xì)胞因子[10-11]。本實(shí)驗(yàn)選用THP-1源性巨噬細(xì)胞作為模型，觀察了阿托伐他汀對(duì)NLRP1炎性體表達(dá)的影響，結(jié)果顯示阿托伐他汀可呈濃度、時(shí)間依賴(lài)性抑制NLRP1炎性體mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。此外，我們運(yùn)用siRNA對(duì)NLRP1進(jìn)行沉默，發(fā)現(xiàn)NLRP1表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)阿托伐他汀對(duì)IL-1β和IL-18分泌的抑制作用，提示NLRP1炎性體可能在阿托伐他汀的抗炎及抗As作用中扮演了關(guān)鍵角色。

Figure 3.The effect of atorvastatin on mRNA expression of NLRP1 inflammasome in THP-1 macrophages for different time. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

圖3阿托伐他汀作用不同時(shí)間對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞NLRP1炎性體mRNA表達(dá)的影響

Figure 4.The effect of atorvastatin on protein expression of NLRP1 inflammasome in THP-1 macrophages for different time. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

圖4阿托伐他汀作用不同時(shí)間對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞NLRP1炎性體蛋白表達(dá)的影響

Figure 5.The effect of NLRP1 siRNA on atorvastatin-induced reduction of IL-1β and IL-18 releases from THP-1 macrophages. Western blot was employed to examine the transfection efficiency of NLRP1 siRNA (A). ELISA was used to quantify the secretion of IL-1β (B) and IL-18 (C) in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsLPS;#P<0.05vsLPS+ATO;△P<0.05vsLPS+NLRP1 siRNA.

圖5NLRP1 siRNA對(duì)阿托伐他汀抑制THP-1巨噬細(xì)胞IL-1β和IL-18分泌的影響

NLRP1炎性體參與炎癥反應(yīng)及As的發(fā)生發(fā)展[12]。外周動(dòng)脈疾病(peripheral arterial disease，PAD)是一種由As導(dǎo)致，多因素共同參與的慢性疾病，Bleda等[13]發(fā)現(xiàn)NLRP1炎性體參與PAD患者內(nèi)皮功能紊亂與炎癥反應(yīng)過(guò)程，并與血管損傷和修復(fù)密切相關(guān)。阿司匹林是臨床上治療As性疾病的常用藥。Bleda等[14]又發(fā)現(xiàn)NLRP1炎性體表達(dá)的下調(diào)可能在阿司匹林的抗As過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，這間接驗(yàn)證了NLRP1炎性體與As的關(guān)系，并提示以NLRP1炎性體為靶點(diǎn)治療As存在可能性。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBP)可調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成，是As過(guò)程的重要參與者。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS能通過(guò)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞SREBP-1a表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)其下游NLRP1炎性體激活及促炎細(xì)胞因子釋放，表明NLRP1炎性體可能是SREBP參與As的途徑之一[15]。我們的研究結(jié)果顯示，THP-1巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS處理后，NLRP1炎性體mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加，這與在小鼠巨噬細(xì)胞上的發(fā)現(xiàn)一致。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，LPS對(duì)NLRP1炎性體的促進(jìn)作用能被阿托伐他汀有效抑制。

近年來(lái)，阿托伐他汀的抗炎效應(yīng)已成為As防治領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，但其所涉及的分子機(jī)制卻尚未明了。有學(xué)者指出NLRP3(NLR family，pyrin domain containing 3)炎性體參與As發(fā)病過(guò)程[16]，且阿托伐他汀可通過(guò)干預(yù)NLRP3炎性體延緩As進(jìn)展[17]。但是，亦有學(xué)者認(rèn)為炎癥反應(yīng)及As進(jìn)展并不依賴(lài)于NLRP3炎性體[13, 15, 18]。鑒于NLRP1炎性體在促炎細(xì)胞因子分泌中的重要作用及其與As的密切關(guān)聯(lián)性，我們觀察了阿托伐他汀對(duì)LPS誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞NLRP1炎性體表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可明顯下調(diào)NLRP1炎性體表達(dá)，且伴有IL-1β和IL-18分泌的減少；此外，當(dāng)NLRP1被siRNA沉默后，阿托伐他汀對(duì)IL-1β和IL-18分泌的抑制作用更加明顯。這些研究結(jié)果表明NLRP1炎性體是阿托伐他汀抗炎及抗As作用的重要靶點(diǎn)之一。

綜上所述，阿托伐他汀具備抗炎作用，可減少巨噬細(xì)胞IL-1β和IL-18的釋放，且其作用途徑與抑制NLRP1炎性體表達(dá)有關(guān)。這有助于深入認(rèn)識(shí)他汀類(lèi)藥物的非調(diào)脂作用，并為臨床聯(lián)合用藥治療As提供新依據(jù)。此外，不斷深化對(duì)炎性體的研究不僅有益于As的早期診斷，以炎性體為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)單克隆抗體、小分子拮抗物等或許能為As的治療開(kāi)辟新的途徑。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Atorvastatin inhibits IL-1β and IL-18 releases via lowering the expression of NLRP1 inflammasome

YU Si-yang1, WANG Yan2, ZENG Gao-feng1, LIU Yang1, XU Jian-qiang1, ZENG Meng-ya1, TANG Ye-hua3, ZENG Zhi-ying2, SHI Xiao-qiao2, CHEN Ying2, ZHAO Guo-jun4

(1DepartmentofCardiovascularMedicine,2DepartmentofAnesthesiology,TheSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,3TheCentralHospitalofHengyang,Hengyang421001,China;4DepartmentofHistologyandEmbryology,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China.E-mail:zzhcsu@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the role of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1 (NLRP1) inflammasome in atorvastatin-induced reduction of interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-18 (IL-18) releases from the THP-1 macrophages. METHODS: Lipopolysaccharide (LPS, 10 μg/L) was used to trigger the secretion of IL-1β and IL-18 in the THP-1 macrophages. The cells were incubated with different concentrations of atorvastatin (1, 10 and 20 μmol/L) for 24 h, or treated with 10 μmol/L atorvastatin for different time (12 h, 24 h and 48 h). NLRP1 siRNA was transfected into the THP-1 cells. The mRNA expression of NLRP1 inflammasome was detected by RT-PCR. The protein expression of NLRP1 inflammasome was determined by Western blot. The secretion of proinflammatory cytokines IL-1β and IL-18 was quantified by ELISA. RESULTS: Atorvastatin inhibited the mRNA and protein expression of NLRP1 inflammasome in the THP-1 macrophages in a dose- and time-dependent manner. Transfection of NLRP1 siRNA significantly decreased the protein expression of NLRP1 and promoted the suppressive effect of atorvastatin on IL-1β and IL-18 secretion in the THP-1 macrophages. CONCLUSION: Atorvastatin inhibits the production of IL-1β and IL-18 in the macrophages through decreasing NLRP1 inflammasome expression, possibly contributing to the anti-inflammatory effect of atorvastatin on atherosclerosis.

[KEY WORDS]Atorvastatin; Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1 inflammasome; Interleukin-1β; Interleukin-18; Atherosclerosis

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)05- 0863- 06

[收稿日期]2015- 12- 04[修回日期] 2016- 02- 04

*[基金項(xiàng)目]湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 14JJ5016)

通訊作者△Tel: 0773-3680365; E-mail: zzhcsu@163.com

[中圖分類(lèi)號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.016

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