蓖麻種子油脂累積與可溶性糖變化的關(guān)系

張洋劉愛忠

（1. 中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶植物資源開放實驗室，勐臘 666303；2. 中國科學(xué)院昆明植物研究所，昆明 650201；3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

蓖麻種子油脂累積與可溶性糖變化的關(guān)系

張洋1，3劉愛忠2

（1. 中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶植物資源開放實驗室，勐臘 666303；2. 中國科學(xué)院昆明植物研究所，昆明 650201；3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

通過高效液相色譜、RNA-seq測序和放射性碳同位素示蹤等技術(shù)研究了蓖麻種子發(fā)育過程中可溶性糖代謝與油脂累積過程的關(guān)系。結(jié)果表明，蓖麻種子可溶性糖主要由葡萄糖、果糖和蔗糖構(gòu)成。隨著種子發(fā)育和油脂累積，可溶性糖含量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。其中蔗糖含量變化與油脂累積存在極顯著的負(fù)相關(guān)性（r=0.980）。在種子發(fā)育早期，己糖/蔗糖比值較高，糖代謝相關(guān)基因大量表達(dá)，其中蔗糖合成酶在蔗糖代謝過程中起關(guān)鍵性作用；而在發(fā)育中后期，隨著種子油脂快速累積，己糖/蔗糖比值和糖代謝水平下降，參與糖代謝的相關(guān)基因表達(dá)量下調(diào)，而脂肪酸合成與油脂累積相關(guān)基因表達(dá)量明顯升高。通過14C蔗糖同位素示蹤實驗證實：降低種子蔗糖攝入量可以顯著抑制糖類向油脂轉(zhuǎn)化，限制蓖麻種子油脂累積。因此，可溶性糖代謝（主要是蔗糖）在蓖麻種子油脂累積過程中具有重要作用。

蓖麻；可溶性糖；油脂；蔗糖合成酶；高效液相色譜

糖代謝在種子發(fā)育過程中具有重要作用。它不僅可以為種子生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量，與儲存物質(zhì)累積密切相關(guān)［1，2］，還可以作為關(guān)鍵的發(fā)育信號［3-5］，調(diào)控種子完成細(xì)胞分裂和擴增、營養(yǎng)物質(zhì)儲存以及種子干燥成熟等一系列生理過程［6，7］。通常，葉片（源器官）光合作用的產(chǎn)物主要以蔗糖的形式轉(zhuǎn)運至果實、種子和根（庫器官）中［8］，并通過一系列生理生化過程將蔗糖卸載并轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)、淀粉和油脂等營養(yǎng)物質(zhì)儲存在庫器官中［9-11］。參與植物糖代謝與轉(zhuǎn)運的酶主要分為3類：一是蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（Sucrose transporter，SUT），參與蔗糖轉(zhuǎn)運［1，12，13］；二是蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SS）和蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS），主要參與蔗糖合成［14-16］；三是蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase，INV），參與蔗糖分解［14，16］。在種子發(fā)育早期，細(xì)胞處于旺盛的分裂和分化階段，可溶性糖主要由葡萄糖和果糖組成，蔗糖含量低。此時，較高的己糖/蔗糖比值作為重要的糖信號，可以促進(jìn)蔗糖轉(zhuǎn)化酶高效表達(dá)，迅速將蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖，用以滿足發(fā)育早期較高的能量需求［17］。而在種子發(fā)育中后期，己糖/蔗糖比值下降，蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶高效表達(dá)；大部分葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)化為蔗糖（此階段的可溶性糖主要由蔗糖組成），并用于蛋白質(zhì)和油脂等儲存物質(zhì)合成［18］。

油脂累積不僅在油料種子發(fā)育和萌發(fā)過程中具有重要的生理意義，而且在糧食安全和生物能源開發(fā)領(lǐng)域也占據(jù)關(guān)鍵地位。所以，油料種子發(fā)育過程中脂肪酸合成與油脂累積的機理研究受到越來越多的關(guān)注。在油料種子發(fā)育過程中，可溶性糖代謝與油脂累積過程密切相關(guān)。通常，隨著種子發(fā)育和儲存物質(zhì)累積，可溶性糖逐漸轉(zhuǎn)化為脂肪酸和油脂儲存下來［19］。在油料種子發(fā)育過程中往往存在一個顯著的可溶性糖組分變化時期，它會直接或間接地影響后期種子油脂累積［20］。例如，在油菜種子油脂累積的前期，大量的可溶性糖轉(zhuǎn)化為淀粉，并暫時性儲存在胚中。隨著種子發(fā)育和油脂累積過程的持續(xù)，淀粉逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄蕴牵⒂糜谥舅岷铣珊陀椭鄯e。另外，在油脂累積過程中，糖代謝（糖酵解或磷酸戊糖途徑）的中間產(chǎn)物是脂肪酸合成與油脂累積的主要碳源［21］。在小桐子種子油脂累積時期，葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate）和磷酸三碳糖（Triose-phosphate）是脂肪酸合成的主要碳源［22］。已有研究表明，通過改變糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，可以顯著提高種子油脂累積［23］。為探討油料種子發(fā)育過程中可溶性糖代謝與油脂累積的關(guān)系，本研究利用高效液相色譜和RNA-seq測序技術(shù)調(diào)查不同發(fā)育時期蓖麻種子可溶性糖含量、組分及相關(guān)代謝基因的變化，并通過放射性同位素示蹤的方法揭示蓖麻種子可溶性糖代謝在油脂累積過程中的作用，以期為蓖麻品種改良和分子育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用蓖麻（Ricinus communis L.）品種為淄蓖306，種子由山東省淄博市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。通常，蓖麻果實發(fā)育和種子成熟需要60 d。本研究以授粉后第一天的雌花開始掛牌記錄果實發(fā)育天數(shù)（Days after pollination，DAP），分別選取授粉后第12、24、36、48和60天的種子和果皮作為實驗材料。

1.2 方法

1.2.1 蓖麻種子鮮重、干重及含水量測定 在實驗樣地內(nèi)分別采集DAP 12、24、36、48和60 d的果實20顆，迅速帶回實驗室。用解剖刀將發(fā)育種子從果實內(nèi)剝離，分別在分析天平上稱量種子和果皮重量，記為鮮重（fresh weight，F(xiàn)W）。然后分別將10個不同發(fā)育時期的種子和果皮用液氮速凍，于-80℃保存?zhèn)溆茫ǚN子可溶性糖和含油量檢測）。另外，分別將10個不同發(fā)育時期的種子和果皮用錫箔紙包裹，于65℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，記為種子干重（dry weight，DW）。根據(jù)以下公式計算種子含水量：

1.2.2 蓖麻種子油脂含量測定 采用正己烷-異丙醇法檢測種子油脂含量［22］。取100 mg烘干后的蓖麻種子于球磨機內(nèi)粉碎，加入2 mL提取液（正己烷∶異丙醇=3∶2，V/V），200 μL 0.1% NaCl溶液和5 μL BHT（butylated hydroxytoluene），充分振蕩混勻后，12 000 r/min 離心5 min。收集上清液并重復(fù)以上步驟2次，將合并的上清液放入真空干燥箱內(nèi)，于55℃，-0.6 MPa條件下?lián)]發(fā)有機試劑至恒重，記為總油脂重量。根據(jù)以下公式計算種子油脂含量：

1.2.3 可溶性糖含量測定 由于蓖麻種子油脂含量高，本研究中可溶性糖提取在Ribeiro等［24］方法的基礎(chǔ)上略有改進(jìn)。稱取0.5 g組織材料（種子或果皮），研磨后加人10 mL提取液（氯仿∶異丙醇∶水= 3∶2∶1，V/V）充分振蕩1 min，8 000 r/min離心10 min，收集上層清液，有機相用10 mL 純水重復(fù)提取2次。合并上清液，并用0.45 μm濾膜過濾，定容到25 mL供HPLC分析?？扇苄蕴墙M分測定參照王艷穎等［25］的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定（略有改進(jìn)）。儀器如下：高效液相色譜儀（Aglient 1100 Series型，美國Agilent公司），蒸發(fā)光散射檢測器（Varian 380-LC型，美國VARIAN公司）。色譜分離條件如下：色譜柱（Carbohydrate High Perfermance 4 μm 4.6×250 mm Cartridge，美國Waters公司），上樣量為5 μL，柱溫為30℃，流動相為乙腈∶水=75∶25（V/V），流速為1 mL/min，單樣品測量時間為28 min。蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）氣化溫度為80℃，霧化溫度為60℃，氮氣作載氣，流速1.7 L/min。

1.2.4 基于RNA-seq測序的糖代謝與油脂累積相關(guān)基因表達(dá)分析 分別選取發(fā)育早期（DAP20）和中后期（DAP40）蓖麻種子3粒。種子總RNA提取、文庫構(gòu)建和RNA-seq測序委托北京諾禾生物技術(shù)有限公司完成。使用RPKM 法（Reads Per Kb per Million reads）計算基因表達(dá)量［26］，計算公式為：

其中：RPKM，目的基因表達(dá)量；C，唯一比對到目的基因的reads數(shù)量；N，唯一比對到參考基因的總reads數(shù)量；L，目的基因的堿基數(shù)量。

1.2.514C放射性同位素示蹤與代謝通量分析 在實驗樣地內(nèi)選取10株長勢相近的植株，并隨機分為對照組和遮陰處理組。對照組不做任何處理；在遮陰處理組植株上方1.5 m處設(shè)置遮陽網(wǎng)（光照強度下降80%）。遮陰處理一周后，分別在兩組植株上選取5顆發(fā)育早期（DAP20）和中后期（DAP40）的果實，并在距離果實果柄1 cm處注射1 mL14C-蔗糖溶液，分別于0、4、8、12、16、20和24 h后采摘果實。置于液氮速凍后，按照方法1.2.2中介紹，將種子提取液分為正己烷相（含油脂）和水/異丙醇相（含可溶性糖）用于代謝通量分析。分別取1 mL以上溶液，并加入1 mL閃爍液后，使用液體閃爍儀（MicroBeta2Plate Counter，美國PerkinElmer公司）讀取樣品放射性強度。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育階段蓖麻種子和果皮可溶性糖含量及組分變化

蓖麻種子發(fā)育可以分為細(xì)胞分裂分化、儲存物質(zhì)累積和成熟干燥3個發(fā)育時期。在細(xì)胞分裂分化時期（DAP12-24）：種子鮮重迅速增加并達(dá)到最大值（0.49 g），干重增加相對緩慢，油脂含量較低；但種子含水量和可溶性糖含量高（表1）。在儲存物質(zhì)累積時期（DAP24-48）：種子鮮重略有下降，干重和油脂含量迅速增加，而種子含水量和可溶性糖含量逐漸下降。在成熟干燥時期（DAP48-60）：種子完成生理成熟，含水量和可溶性糖含量急劇下降；干重和油脂含量持續(xù)增加，并分別達(dá)到最大值（0.32 g和54.86%）。整體而言，可溶性糖含量與油脂含量表現(xiàn)出一定的負(fù)相關(guān)性，即可溶性糖含量隨著蓖麻種子發(fā)育逐漸下降，而油脂含量表現(xiàn)為逐漸上升的趨勢。相對于發(fā)育種子，蓖麻果皮含水量和可溶性糖含量相對穩(wěn)定，與種子油脂含量變化的相關(guān)性較?。ū?）。

為進(jìn)一步調(diào)查蓖麻種子和果皮可溶性糖組分的變化，利用高效液相色譜法檢測了不同發(fā)育時期種子和果皮的可溶性糖組分變化。實驗結(jié)果（圖1）表明，蓖麻種子可溶性糖主要由果糖、葡萄糖和蔗糖組成；而果皮可溶性糖主要由果糖和葡萄糖組成，其中葡萄糖含量約為果糖的2-4倍（表2）。隨著蓖麻種子發(fā)育，果糖、葡萄糖和蔗糖均表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢。另外，在發(fā)育早期（DAP12-24）己糖含量（果糖和葡萄糖）高于蔗糖含量，己糖/蔗糖比值約為1.10-1.86；而在發(fā)育中后期（DAP24-60）己糖含量急劇下降，明顯低于蔗糖含量，己糖/蔗糖比值約為0-0.24。相對于發(fā)育種子，果皮內(nèi)葡萄糖和果糖含量相對穩(wěn)定，隨著果實發(fā)育未表現(xiàn)出明顯的變化趨勢。所以，通過調(diào)查發(fā)育種子和果皮內(nèi)可溶性糖含量及組分的變化可以得出：蓖麻種子內(nèi)可溶性糖的變化與種子油脂累積具有一定的負(fù)相關(guān)性；而果皮內(nèi)可溶性糖變化對種子油脂的累積影響甚微。

表1 蓖麻果實發(fā)育過程中鮮重、干重、含水量、可溶性糖與油脂含量變化

圖1 對照品（A）與蓖麻樣品（B）HPLC色譜圖

表2 蓖麻果實發(fā)育過程中可溶性糖組分變化

2.2 蓖麻種子可溶性糖組分變化與含油量的關(guān)系由于蓖麻種子可溶性糖含量變化與油脂含量變化表現(xiàn)出一定的負(fù)相關(guān)現(xiàn)象，本研究通過批量檢測不同發(fā)育時期（以油脂含量為標(biāo)準(zhǔn)）蓖麻種子油脂含量及果糖、葡萄糖和蔗糖含量的變化得出：隨著蓖麻種子油脂含量增加，蔗糖含量呈逐漸緩慢下降趨勢；而果糖和葡萄糖含量在油脂含量較低范圍內(nèi)（0.02-0.20）迅速下降，在油脂含量較高的范圍內(nèi)（0.20-0.45）下降相對緩慢（圖2）。在低油脂含量范圍內(nèi)，種子處于細(xì)胞分裂分化階段，旺盛的能量代謝需要大量消耗果糖和葡萄糖，用于滿足發(fā)育早期種子快速生長和能量需求；而在高油脂含量范圍內(nèi)，果糖和葡萄糖的含量較低，種子發(fā)育的主要碳源為蔗糖，隨著油脂快速累積，蔗糖含量呈現(xiàn)明顯的直線下降趨勢。通過對蓖麻種子油脂含量與果糖、葡萄糖和蔗糖含量進(jìn)行皮爾遜相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：油脂含量與果糖、葡萄糖和蔗糖含量存在顯著的負(fù)相關(guān)性（表3）。其中，蔗糖含量變化與油脂含量表現(xiàn)出極顯著的負(fù)相關(guān)性（P<0.001），意味著蔗糖代謝在油脂累積過程中具有重要作用。另外，對蓖麻種子油脂含量與果皮內(nèi)果糖和葡萄糖進(jìn)行皮爾遜相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)（果皮內(nèi)未檢測到蔗糖）：葡萄糖含量變化與種子油脂含量表現(xiàn)出一定的負(fù)相關(guān)性（P<0.01），但相關(guān)系數(shù)（-0.839）明顯小于種子內(nèi)各種糖分（表3）。因此，果皮內(nèi)葡萄糖代謝在種子油脂累積過程中可能也具有一定作用。但整體而言，蓖麻種子內(nèi)可溶性糖代謝（尤其是蔗糖）在油脂累積過程具有更為重要的意義。

2.3 蓖麻種子發(fā)育過程中糖代謝與油脂累積相關(guān)基因表達(dá)變化

為進(jìn)一步了解蓖麻種子糖代謝與油脂累積過程在基因表達(dá)水平的關(guān)系，本研究對發(fā)育早期（DAP-20）和中后期（DAP40）蓖麻種子進(jìn)行RNA-seq測序，結(jié)果（圖3）顯示，蔗糖轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白均在蓖麻種子發(fā)育早期大量表達(dá)，這與蓖麻種子發(fā)育早期旺盛的糖代謝過程和較高的可溶性糖含量密切相關(guān)。蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白存在3個同工酶，其中29728.m000846在種子發(fā)育早期大量表達(dá)，可能在蓖麻種子發(fā)育早期蔗糖的吸收與卸載相關(guān)。蔗糖轉(zhuǎn)化酶存在6個同工酶，在種子發(fā)育早期29728.m000799、29889.m003349和30128.m008935表達(dá)量相對較高，與發(fā)育早期較高的己糖含量關(guān)系密切。在種子蔗糖合成代謝中，蔗糖磷酸合成酶表達(dá)量整體偏低（僅28543.m000384在種子發(fā)育早期表達(dá)量較高）；相反，蔗糖合成酶大量表達(dá)，其中29986.m001646、29739.m003693和29951.m000143在發(fā)育早期表達(dá)量高，而29726. m004086在種子發(fā)育后期大量表達(dá)。所以，在蓖麻種子蔗糖合成代謝過程中，蔗糖合成酶具有重要作用。

圖2 蓖麻種子可溶性糖組分變化與含油量關(guān)系

表3 蓖麻種子含油量、果糖、葡萄糖及蔗糖相關(guān)性分析

同樣，在早期種子（DAP20）中己糖代謝相關(guān)基因表達(dá)量明顯高于中后期（DAP40）。參與糖酵解過程的果糖-1，6-二磷酸醛縮酶、磷酸果糖激酶和葡糖糖-6-磷酸異構(gòu)酶表達(dá)量整體偏高，而已糖激酶表達(dá)量較低（圖4）。另外，催化果糖進(jìn)入糖酵解過程的果糖激酶（29569.m000151）表達(dá)量很高，這與蓖麻種子發(fā)育早期旺盛的糖代謝過程和較高的己糖含量密切相關(guān)。很顯然，早期發(fā)育種子細(xì)胞分裂分化與旺盛的能量代謝與糖酵解過程相關(guān)基因大量表達(dá)相吻合。但由于己糖代謝酶存在多個同工酶，可能存在表達(dá)的組織特異性。所以，在蓖麻種子及糖代謝過程中起主要作用的分別是：果糖-1，6-二磷酸醛縮酶（29092.m000460）、果糖激酶（29569.m000151）和葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（29908. m006236），其表達(dá)量顯著高于其它同工酶。

圖3 蓖麻種子中蔗糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)變化

圖4 蓖麻種子中己糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)變化

油脂累積相關(guān)基因的表達(dá)模式與糖代謝基因相反：在蓖麻種子發(fā)育早期基因表達(dá)水平整體偏低，而發(fā)育中后期表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖5）。尤其是與油體形成相關(guān)的油體蛋白（Oleosin 1和Oleosin 2）基因在發(fā)育中后期特異性高表達(dá)（RPKM值分別為3982.34和1063.53），這充分表明此時期油脂在種子內(nèi)快速合成并累積下來。另外，脂肪酸合成與三酰甘油組裝相關(guān)基因同樣在發(fā)育中后期上調(diào)表達(dá)，其中參與?；D(zhuǎn)運的?；d體蛋白（30128.m008670）和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（29682.m000581）表達(dá)量明顯升高；參與脂肪酸合成的β-酮脂酰-?；d體蛋白還原酶（29929.m004732）和乙酰輔酶A羧化酶的生物素羧化酶亞基（29630.m000809）表達(dá)量也顯著上調(diào)。在?；揎椷^程中，參與蓖麻油酸前體合成的硬脂酰?；d體蛋白去飽和酶（27985.m000877）和蓖麻油酸形成的12-油脂酰羥基化酶（28035. m000362）表達(dá)水平在發(fā)育中后期明顯上調(diào)。

綜上所述，糖代謝和油脂累積相關(guān)基因的表達(dá)趨勢與可溶性糖和油脂含量的變化趨勢相吻合。整體表現(xiàn)為發(fā)育早期糖代謝基因表達(dá)量較高，油脂累積相關(guān)基因表達(dá)量偏低；而在發(fā)育中后期糖代謝基因下調(diào)表達(dá)，油脂累積相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)。

圖5 蓖麻種子中糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)變化

2.4 遮陰處理對糖代謝與油脂累積過程的影響

14C蔗糖放射性示蹤實驗表明，遮陰處理（光照強度下降80%）使發(fā)育種子的蔗糖吸收能力顯著下降，發(fā)育早期（DAP20）和中后期（DAP40）蓖麻種子的蔗糖吸收明顯下降（圖6）。另外，隨著蔗糖吸收的減少，種子的代謝通量也發(fā)生明顯變化：在蓖麻種子發(fā)育早期（DAP20），種子吸收的蔗糖主要用于糖代謝過程，碳通量主要流向可溶性糖部分，而油脂部分的代謝通量相對較低；遮陰處理后油脂部分的代謝通量進(jìn)一步降低，意味著糖類向油脂轉(zhuǎn)化過程受到明顯抑制。在種子發(fā)育中后期（DAP40），大部分碳通量流向油脂部分，可溶性糖部分的代謝通量明顯下降。遮陰處理后油脂部分代謝通量下降而可溶性糖部分的代謝通量則略有增加，表明在油脂快速累積時期蔗糖吸收的減少同樣使可溶性糖代謝通量流向油脂部分的過程受到抑制。這充分說明可溶性糖代謝在蓖麻種子油脂累積過程中具有重要作用，降低種子可溶性糖含量能夠明顯抑制糖類向油脂轉(zhuǎn)化，進(jìn)而限制蓖麻種子油脂累積。

圖6 遮陰處理后蓖麻種子可溶性糖與油脂代謝通量變化

3 討論

通過分子改良和遺傳育種等手段修飾部分油脂代謝基因可以在一定程度上促進(jìn)油料種子內(nèi)油脂累積。但由于種子油脂累積是一個十分復(fù)雜的代謝過程，操作部分代謝酶的活性通常會受到整個油脂代謝網(wǎng)絡(luò)的反饋調(diào)節(jié)，并不能使種子油脂累積達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)［27］。而通過增強種子“庫強”的方式，增加光合代謝產(chǎn)物的供給（主要是蔗糖等可溶性糖）則可以顯著提高種子含油量［23］。很顯然，大量碳源的供給是脂肪酸合成與油脂累積的必要前提，改變種子可溶性糖供給和糖代謝水平對油脂累積過程中具有重要意義。

在油料種子中，可溶性糖代謝與油脂累積的關(guān)系較為復(fù)雜。前人對油菜果莢的研究認(rèn)為，果莢的糖代謝過程對油菜種子油脂含量具有決定性作用［28］。在蓖麻果實發(fā)育過程中，盡管果皮內(nèi)葡萄糖含量變化與種子油脂累積表現(xiàn)出一定的負(fù)相關(guān)性，但整體而言，果皮可溶性糖代謝對種子油脂累積影響相對較弱（表3）。而種子可溶性糖含量與油脂累積過程存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，隨著種子發(fā)育，可溶性糖含量逐漸降低而油脂含量逐漸升高（表1）。在油菜果實發(fā)育和油脂累積時期，葉片光合作用降低（大部分葉片已經(jīng)衰老），果莢光合作用產(chǎn)物（可溶性糖）是種子發(fā)育的主要碳源。果皮內(nèi)可溶性糖水平的變化直接影響種子內(nèi)儲存物質(zhì)累積（油脂）。相反，蓖麻果實光合作用的貢獻(xiàn)相對較小，種子發(fā)育的主要碳源由葉片光合作用提供。所以，果皮內(nèi)可溶性糖代謝對種子油脂累積的影響較弱；而種子內(nèi)可溶性糖（尤其是蔗糖）含量變化與油脂累積則呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性（表3），種子內(nèi)可溶性糖代謝在油脂累積過程中可能具有更為重要的作用。

蓖麻種子內(nèi)可溶性糖主要由蔗糖、葡萄糖和果糖構(gòu)成（表2）。其中，己糖/蔗糖比值通常被視為種子發(fā)育過程中重要的生理信號。整體而言，種子發(fā)育初期己糖/蔗糖比值較高，可溶性糖主要以代謝較活躍的果糖和葡萄糖形式存在。發(fā)育初期糖類為種子的快速生長提供大量能量，以完成鮮重的急劇增加和快速的細(xì)胞分裂分化進(jìn)程。而在發(fā)育中后期，種子代謝水平趨緩，可溶性糖主要以代謝較穩(wěn)定的蔗糖形式存在，隨種子發(fā)育和成熟儲存下來或轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)、淀粉和油脂等大分子高能量物質(zhì)儲存在種子中。所以，在蓖麻種子發(fā)育早期己糖/蔗糖比值較高（表2），參與糖酵解過程的相關(guān)基因具有較高表達(dá)量（圖4）。張凌云等［29］對油茶果實糖含量與油脂累積的研究認(rèn)為種子發(fā)育后期較高的蔗糖濃度可以促進(jìn)蔗糖向儲存物質(zhì)轉(zhuǎn)化，為油脂累積過程提供碳源。同樣，在蓖麻種子發(fā)育中后期（DAP36-60），己糖/蔗糖比值明顯小于發(fā)育早期，可溶性糖含量（主要是蔗糖）隨種子發(fā)育和油脂累積呈明顯的下降趨勢（表2）。通過皮爾遜相關(guān)分析得出，蓖麻種子蔗糖含量與種子油脂累積存在極顯著的負(fù)相關(guān)性（表3）。綜上所述，在蓖麻種子油脂累積時期，蔗糖代謝對脂肪酸合成和油脂累積過程具有重要作用。

蔗糖代謝主要由蔗糖轉(zhuǎn)化酶、磷酸蔗糖合成酶和蔗糖合成酶綜合調(diào)控。通常，蔗糖合成酶對儲存器官的“庫強”起決定性作用，在光合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運和分配過程中具有重要作用。在番茄果實發(fā)育過程中，降低蔗糖合成酶酶活性可以顯著降低果實“庫強”，儲存物質(zhì)（淀粉）累積顯著下降［30］。另外，于安民等［31］也報道蔗糖合成酶對陽春砂果實糖代謝具有關(guān)鍵作用。同樣，在蓖麻種子內(nèi)蔗糖合成酶整體表達(dá)水平遠(yuǎn)高于蔗糖轉(zhuǎn)化酶和磷酸蔗糖合成酶（圖3）。本研究認(rèn)為在蓖麻種子發(fā)育過程中，蔗糖合成酶對蔗糖代謝起關(guān)鍵性作用。然而，也有一些學(xué)者認(rèn)為蔗糖轉(zhuǎn)化酶能夠不可逆地將蔗糖分解為果糖和葡萄糖，是蔗糖分解過程中的關(guān)鍵酶。而在本研究中發(fā)現(xiàn)：蓖麻發(fā)育早期的蔗糖轉(zhuǎn)化酶表達(dá)量并不高；相反，蔗糖合成酶表達(dá)量卻非常高（圖3）。我們認(rèn)為蔗糖合成酶在分解方向上的活性應(yīng)該是蓖麻種子發(fā)育早期蔗糖分解的主要動力。因為蔗糖合成酶能夠可逆性催化蔗糖與尿苷二磷酸生成果糖和尿苷二磷酸葡萄糖，所以蔗糖合成酶同時具有合成方向與分解方向的酶活性。很顯然，蓖麻種子發(fā)育早期較高的己糖含量應(yīng)該是蔗糖合成酶分解方向的產(chǎn)物。對于蓖麻種子蔗糖合成過程而言，磷酸蔗糖合成酶和蔗糖合成酶共同參與蔗糖合成，其中蔗糖合成酶（29726.m004086）在種子發(fā)育中后期具有較高的表達(dá)量（圖3），可能對種子油脂累積具有一定的促進(jìn)作用。Moriguchi等［32］也發(fā)現(xiàn)在桃果實發(fā)育后期蔗糖積累中，蔗糖合成酶具有重要作用。而此時期蓖麻種子內(nèi)較高的蔗糖合成酶基因表達(dá)量可能預(yù)示著糖類向油脂轉(zhuǎn)化，高濃度的蔗糖被用作脂肪酸合成與油脂累積的主要碳源。

通過遮陰處理降低種子的“庫強”，可以使蓖麻種子的蔗糖吸收顯著下降（圖6）。而蔗糖吸收的下降對種子內(nèi)部的代謝通量具有顯著影響：可溶性糖向油脂代謝的碳通量受到限制，這進(jìn)一步證實可溶性糖代謝在油脂累積過程中具有重要作用。在擬南芥種子中過表達(dá)蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白可以顯著增加可溶性糖含量，使種子油脂含量得到顯著提高［23］。所以，通過改變種子“庫強”的方式調(diào)節(jié)種子的可溶性糖代謝，能夠有效地調(diào)控種子的油脂累積過程。鑒于可溶性糖代謝與油脂累積的密切聯(lián)系，可以綜合考慮糖信號感受、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、可溶性糖代謝和油脂累積的相互作用，通過代謝工程的方式促進(jìn)蓖麻種子內(nèi)糖類向油脂轉(zhuǎn)化，提高種子油脂含量。本研究認(rèn)為通過代謝工程的方式促進(jìn)糖類向油脂轉(zhuǎn)化，有望進(jìn)一步提高蓖麻種子油脂含量。

4 結(jié)論

蓖麻果實由果皮和種子兩部分組成。果皮可溶性糖含量較穩(wěn)定，對種子油脂累積的影響相對較弱。而種子可溶性糖含量與油脂累積過程呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性。隨著種子油脂不斷累積，可溶性糖含量呈逐漸下降趨勢。蓖麻種子的可溶性糖主要由葡萄糖、果糖和蔗糖構(gòu)成。其中，蔗糖含量與種子油脂含量存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。14C放射性同位素實驗證實：降低蓖麻種子蔗糖攝入量，可以顯著抑制糖類向油脂轉(zhuǎn)化。對糖代謝和油脂累積相關(guān)基因進(jìn)行RNA-seq測序分析得出：在蓖麻種子發(fā)育過程中，蔗糖合成酶在糖代謝過程中扮演重要角色，可能對油脂累積過程具有一定的促進(jìn)作用。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Correlation Between Soluble Carbohydrate Metabolism and Lipid Accumulation in Castor Seeds

ZHANG Yang1，3LIU Ai-zhong2
（1. Key Laboratory of Tropical Plant Resources and Sustainable Use，Xishuangbanna Tropical Botanical Garden，Chinese Academy of Sciences，Mengla 666303；2. Kunming Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Kunming 650201；3. University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049）

The relationship between soluble carbohydrates metabolism and lipid accumulation in the development of castor seeds was studied by HPLC，RNA-seq sequencing and radioactive carbon isotope tracing method. Soluble carbohydrates in developing castor seeds were mainly composed of glucose，fructose and sucrose，and decreased obviously with seed development and oil accumulation. The significant negative correlation between sucrose content and lipid accumulation（r=0.980）was observed. Hexose-to-sucrose ratio was much higher and the genes related to carbohydrates metabolism were highly expressed in the early stage of seed development. Especially，sucrose synthase played the key role in carbohydrates metabolism. Hexose-to-sucrose ratio was decreased and the genes involved in carbohydrates metabolism were down regulated with the rapid accumulation of seed oil during the middle and late developmental stages，while the expressions of genes related to fatty acid synthesis and lipid accumulation increased significantly. Confirmed by14C-sucrose isotope tracing experiments，the conversion of carbohydrates to oil was significantly inhibited by reducing the sucrose intake；consequently lipid accumulation was limited in developing castor seeds. Therefore，soluble carbohydrates metabolism（mainly sucrose）may play an important role in the process of lipid accumulation in castor seeds.

castor bean；soluble carbohydrates；oil；sucrose synthase；HPLC

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.017

2015-09-14

國家自然科學(xué)基金項目（31401421），國家科技支撐項目（2015BAD15B02）

張洋，男，博士研究生，研究方向：植物分子遺傳育種；E-mail：zhangyang@xtbg.ac.cn

劉愛忠，男，研究員，研究方向：植物分子遺傳育種；E-mail：Liuaizhong@mail.kib.ac.cn