盧敏白杰魏鳳仙王琳燚徐彬尹清強李紹鈺

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002；2. 河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002）

家蠅抗菌肽diptericin基因在大腸桿菌中的表達

盧敏1，2白杰1魏鳳仙1王琳燚1徐彬1尹清強2李紹鈺1

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002；2. 河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002）

為了實現(xiàn)原核表達的途徑高效獲取抗菌肽蛋白，以RT-PCR的方法反轉錄合成家蠅的抗菌肽diptericin基因，并克隆至pGEX-4T-1載體上，轉化至大腸桿菌BL21宿主菌進行表達。測序結果顯示，RT-PCR克隆到長345 bp的家蠅diptericin基因，重組菌經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導后，通過SDS-PAGE電泳和Western-blot檢測到目的蛋白的融合表達，結果表明帶有GST標簽的融合蛋白大小約為37 kD，并且通過GST純化柱純化得到了目的蛋白。

家蠅；抗菌肽；diptericin；原核表達

抗菌肽（Antibacterial peptide）是生物體內(nèi)具有免疫屏障作用的一類多肽，是天然免疫系統(tǒng)中不可缺少的重要組成部分［1］。自20世紀70年代末Boman等［2］首次在惜古天蠶（Hyalopbora cecropia）中發(fā)現(xiàn)抗菌肽天蠶素（Cecropin）以來，迄今已有1 000多種具有抗菌活性的多肽被分離鑒定，且來源于昆蟲的抗菌肽就有200多種。由于抗菌肽一般都具有抗細菌的活性，有的還具有抗病毒、抗原蟲及抑制和殺傷腫瘤細胞等活性，并且具有熱穩(wěn)定性好、對正常細胞沒有損害、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，已成為人們關注的熱點。

家蠅能夠在惡劣的環(huán)境中生存，在其長期抵御微生物的侵襲中形成了獨特的免疫系統(tǒng)，人們對于家蠅抗菌肽的研究越來越多，其中研究較詳細的有attacin、defensin、cecropin，而對雙翅肽diptericin的研究較少。從昆蟲體內(nèi)提取天然抗菌肽的得率少，生產(chǎn)成本高，因此，構建基因工程菌來實現(xiàn)抗菌肽的高效表達成為人們研究的熱點。本研究從家蠅幼蟲體內(nèi)克隆得到diptericin基因，與pGEX-4T-1載體連接后，在大腸桿菌BL21中進行表達，旨為后續(xù)篩選可以高效表達diptericin蛋白的基因工程菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 家蠅 Musca domestica 種蠅由河南省疾病預防控制中心惠贈，幼蟲由本實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度25℃，相對濕度50%-70%；大腸桿菌DH5α、BL21購自天根生物生化科技有限公司，克隆質(zhì)粒pMD19-T購自寶生物工程有限公司；大腸桿菌ATCC-25922和表達質(zhì)粒pGEX-4T-1由本實驗室保存。

1.1.2 試劑 GSTrap HP，1 mL購自GE Healthcare Life Sciences，RNAiso Plus、M-MLV反轉錄酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、蛋白質(zhì)分子量標準、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和DNA Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取和DNA純化回收試劑盒購自天根生物科技有限公司，其它試劑為國產(chǎn)和進口分析純。PCR引物合成及DNA序列測定由上海生物工程技術服務有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 家蠅幼蟲總RNA的提取 微生物刺激家蠅：培養(yǎng)大腸桿菌ATCC-25922至OD600=0.6-0.8，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌兩次后重懸，最終OD600=1.8-2.0。選取大小均一、活動能力強的家蠅3日齡幼蟲，用帶有大腸桿菌的針刺破家蠅幼蟲后1/3，飼養(yǎng)6 h后收集幼蟲于液氮保存。總RNA提取：將幼蟲于液氮研磨后，加入RNAiso Plus，提取總RNA（具體步驟按照RNAiso Plus試劑盒說明書），用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并測定RNA濃度及純度。

1.2.2 RT-PCR克隆家蠅抗菌肽diptericin基因 從GenBank中查到家蠅diptericin基因mRNA序列（GenBank ID：FJ795370.1），在其編碼區(qū)設計引物，上游引物引入EcoRⅠ酶切位點，下游引物引入XhoⅠ酶切位點（下劃線），并加入27個堿基的HA標簽序列（斜體）。

P1：5'-TTAGAATTCAACAAAATGAAATATCTC TGGGCCATTGTTC-3'；P2：5'-TATCTCGAGTCAAGCG TAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACCATCTGTAGGTAT AAC-3'。

以提取的總RNA為模板，用隨機引物進行反轉錄合成cDNA第一鏈，反轉錄過程嚴格參照M-MLV反轉錄酶1st-strand cDNA合成的操作方法。以cDNA為模板，P1、P2為引物，擴增家蠅diptericin基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，在T4 DNA連接酶作用下與pMD19-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，利用藍白斑篩選方法篩選陽性克隆，具體方法參照《分子克隆實驗指南》［3］第15章。挑選陽性克隆進行菌落PCR鑒定、EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，鑒定后的陽性克隆送至上海生工生物技術有限公司測序。

1.2.3 pGEX-4T-1-diptericin重組表達質(zhì)粒的構建 將重組克隆pMD19-T-diptericin質(zhì)粒和表達載體質(zhì)粒pGEX-4T-1同時進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，并純化回收diptericin基因和pGEX-4T-1質(zhì)粒，回收產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，轉化大腸桿菌BL21，利用轉化子的Amp抗性在LB平板上進行篩選，陽性克隆進行質(zhì)粒PCR鑒定及雙酶切鑒定，并進行測序，確定有正確的閱讀框，無堿基突變后進行下步實驗。

1.2.4 diptericin基因的融合表達 從平板上挑取pGEX-4T-1-diptericin-BL21的單克隆菌落，接種于3 mL含有Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，第2天按照1∶100接種于100 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導4 h。離心收集菌體，在冰上進行超聲破碎，條件：300 W，超聲4 s，間隔4 s，10 min。破碎之后離心收集上清液。將上清液與等體積的2×SDS上樣緩沖液混合，沸水浴3-5 min，取8 μL進行SDS-PAGE電泳檢測，以轉化有空質(zhì)粒pGEX-4T-1的大腸桿菌BL21為對照。SDS-PAGE蛋白電泳參照《分子克隆實驗指南》第5章，蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍R-250染色，使用的分離膠濃度為12%。

1.2.5 Western-blot檢測 目的蛋白中引入了HA標簽，用此標簽進行Western-blot檢測目的蛋白，一抗：小鼠源 Anti-HA antibody，二抗：熒光素標記羊抗鼠IgG。經(jīng)過SDS-PAGE電泳后，去除濃縮膠，按照分離膠尺寸剪好濾紙和硝酸纖維素膜（NC膜），并將其與電轉移裝置配套的海綿墊置于轉移緩沖液平衡10 min。安裝好電轉移裝置后，冰浴條件下3 W轉移110 min。將NC膜用封閉液封閉2 h，一抗在室溫下孵育1-2 h，二抗室溫孵育1 h，用Odessey熒光WB檢測系統(tǒng)掃描圖片。

1.2.6 diptericin-GST融合蛋白的純化 將重組pGEX-4T-1-diptericin-BL21大腸桿菌誘導表達后，離心取菌體沉淀進行超聲破碎，取上清液用0.45 μm的過濾器進行過濾。按照GSTrap HP 1 mL純化柱操作方法進行純化，并進行SDS-PAGE電泳檢測。

2 結果

2.1 家蠅幼蟲總RNA的提取與RT-PCR擴增diptericin基因

本實驗用RNAiso Plus試劑提取家蠅幼蟲總RNA，經(jīng)電泳檢測條帶清晰完整性好，OD260/OD280在1.8-2.0之間純度好，為后續(xù)實驗順利進行奠定了基礎。RT-PCR擴增diptericin基因，結果（圖1）顯示，擴增產(chǎn)物大小在350 bp左右，與預計的結果相符。

圖1 RT-PCR擴增diptericin基因

2.2 重組菌pGEX-4T-1-diptericin-BL21的鑒定

提取陽性克隆質(zhì)粒，進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，出現(xiàn)了大小約為4.9 kb和350 bp的兩條帶，表明重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin構建成功（圖2）。將通過鑒定的質(zhì)粒送至上海生物技術服務有限公司測序，分析測序結果，選取插入方向正確，具有正確的閱讀框，無堿基突變的重組菌。測序結果顯示，含有酶切位點及HA標簽序列的diptericin基因長為345 bp，diptericin基因與GenBank中已公布diptericin序列的同源性最高達到99.9%，對其編碼蛋白進行分析，diptericin基因編碼99個氨基酸，分子量約為10.796 kD。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin雙酶切鑒定

2.3 家蠅diptericin融合蛋白誘導表達及檢測

挑選重組pGEX-4T-1-diptericin-BL21的單菌落進行誘導表達，細胞破碎后提取上清，經(jīng)過SDSPAGE電泳，同時將大腸桿菌BL21和含有空質(zhì)粒的大腸桿菌pGEX-4T-1-BL21作為對照，結果（圖3）顯示，目的蛋白為帶有GST標簽的diptericin蛋白，約為37 kD，與理論大小相符，而對照組此位置均無條帶，pGEX-4T-1-BL21經(jīng)誘導后在大小約為26 kD處有明顯條帶，應為GST標簽蛋白條帶。

圖3 重組diptericin基因表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳

2.4 Western-blot檢測

通過HA抗體進行Western-blot檢測，結果（圖4）顯示，pGEX-4T-1-diptericin-BL21誘導后有單一條帶的目的蛋白，而對照組pGEX-4T-1-BL21無條帶，表明diptericin基因成功在大腸桿菌BL21中得到了表達。

圖4 重組diptericin蛋白Western-blot檢測

2.5 重組蛋白純化

收集pGEX-4T-1-diptericin-BL21誘導表達后的菌體超聲破碎上清，通過GSTrap HP 1 mL純化柱純化目的蛋白，將洗脫緩沖液洗脫后的樣品進行SDSPAGE電泳檢測，結果（圖5）顯示，通過GST純化柱純化到了目的蛋白，顯示為單一條帶，大小約為37 kD。

圖5 重組diptericin蛋白的純化

3 討論

已有許多學者對構建基因工程菌來生產(chǎn)抗菌肽進行了研究，包括原核表達和真核表達，如Liang等［4］利用將家蠅Cecropin基因克隆到pGEX-4T-1載體上，實現(xiàn)了其在大腸桿菌中的融合表達，切除GST標簽后的Cecropin蛋白對大腸桿菌具有一定的抑菌效果，李小波等［5］將家蠅抗菌肽attacin克隆至酵母表達載體pPIC9K中，實現(xiàn)其在畢赤酵母GS115中的表達。雙翅肽（diptericin）最早由Dimarcq等［6］從經(jīng)細菌誘導的新陸原伏蠅Phormia terranovae幼蟲的血淋巴中分離得到，并證實其參與昆蟲的體液免疫防御且發(fā)揮著十分重要作用。然而，對于家蠅diptericin基因的研究并不多。

抗菌肽對蛋白酶非常敏感，而且表達抗菌肽對宿主菌可能具有毒性或者表達的抗菌肽無活性［7］，以融合蛋白的形式表達抗菌肽目的基因，可以減少抗菌肽本身對宿主菌的毒害作用，同時還能保護抗菌肽蛋白避免蛋白酶的降解［8］。pGEX-4T-1是目前較多使用的表達載體，它利用谷胱甘肽S-轉移酶基因和目的基因連接，能夠在大腸桿菌中產(chǎn)生GST融合蛋白，并且可以用凝血酶進行切割GST蛋白而獲得目的基因產(chǎn)物。徐建華等［9］將家蠅Attacin基因分別克隆至原核表達載體pET30a（+）和pGEX-4T-1，轉化大腸埃希菌，從pET30a（+）/Attacin重組質(zhì)粒的表達宿主菌中未能獲得His-Attacin融合蛋白，而從pGEX-4T-1/Attacin重組質(zhì)粒轉化菌種獲得了GST-Attacin融合蛋白。舒梅等［10］將水生動物抗菌肽Y18和CEC1分別克隆到pGEX-4T-1載體上，構建了pGEX-Y18和pGEX-CEC1兩個融合蛋白表達載體，獲得了抗菌肽Y18和CEC1，并發(fā)現(xiàn)融合蛋白GST-Y18和GST-CEC1、抗菌肽Y18和CEC1都能有效地抑制E.coli DH5α、S. aureus、B. subtilis和S. cerevisiae的生長。

本研究將家蠅diptericin基因克隆至pGEX-4T-1載體中，對重組大腸桿菌進行IPTG誘導，SDSPAGE蛋白電泳檢測到大小約為37 kD的目的蛋白，Western-blot也檢測到單一蛋白條帶，說明diptericin基因在大腸桿菌中進行了融合表達。經(jīng)過純化，得到了含有GST標簽的diptericin融合蛋白，以融合蛋白形式表達的diptericin蛋白對宿主菌沒有明顯的抑制生長作用，后續(xù)實驗將通過切除GST標簽來檢測diptericin蛋白的生物活性，并通過研究不同誘導時間、溫度等條件來改善目的基因的表達，以期篩選到可以高效表達diptericin蛋白的重組基因工程菌。

抗菌肽有不同的種類，通過將不同的抗菌肽串聯(lián)進行表達有望得到活性更高的雜合抗菌肽，如陳玉海等［11］將非洲爪蟾皮膚分泌的兩種抗菌肽magaininⅡ和PGLa在畢赤酵母中進行雜合表達，構建了雜合抗菌肽magaininⅡ-PGLa的分泌型畢赤酵母表達載體，實現(xiàn)了雜合抗菌肽在畢赤酵母中的分泌表達。因此，今后可將不同的家蠅抗菌肽基因進行串聯(lián)表達，獲得抗菌譜更廣、活性更高的基因工程抗菌肽蛋白。

4 結論

本研究成功構建了家蠅diptericin基因原核表達載體pGEX-4T-1-diptericin-BL21，在大腸桿菌BL21中獲得了該蛋白的可溶性表達，經(jīng)過GST標簽純化柱純化得到了diptericin蛋白。

［1］Hoffmann JA, Kafatos FC, Janeway CA Jr, et al. Phylogenetic perspectives in innate immunity［J］. Science, 1999, 284（5418）：1313-1318.

［2］Bulet P, Stcklin R, Menin L. Anti-microbial peptides：from invertebrates to vertebrates［J］. Immunol Rev, 2004, 198（1）：169-184.

［3］薩姆布魯克 J, 拉塞爾 DW. 分子克隆實驗指南［M］. 第3版.黃培堂, 譯. 北京：科學出版社, 2008.

［4］Liang Y, Wang J, Zhao X, et al. Molecular cloning and characterization of cecropin from the housefly（Musca domestica）and its expression in E. coli［J］. Dev Comp Immunol, 2006, 30（3）：249-257.

［5］李小波, 王婷婷, 馬艷, 等. 家蠅抗菌肽Attacin在畢赤酵母中的異源表達［J］. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2010, 28（5）：332-336.

［6］Dimarcq JL, Keppi E, Dunbar B, et al. Purification and characterization of a family of novel inducible antibacterial proteins from immunized larvae of the dipteran Phormia terranovae and complete amino-acid sequence of the predominant member, diptericin A［J］. Eur J Biochem, 1988, 171（1-2）：17-22.

［7］楊小蓉, 金小寶, 丁彩屏, 等. 家蠅幼蟲抗菌肽diptericin-2基因的克隆及原核表達-鑒定［J］. 現(xiàn)代預防醫(yī)學, 2012, 39（11）：2791-2793.

［8］Chen H, Xu Z, Xu N, et al. Efficient production of a soluble fusion protein containing human beta-defensin-2 in E. coli cell-free system［J］. J Biotechnol, 2005, 115（3）：307-315.

［9］徐建華, 朱家勇, 金小寶, 等. 家蠅幼蟲抗菌肽Attacin基因的克隆表達及抑菌生物學活性［J］. 醫(yī)學分子生物學雜志, 2007, 4（1）：20-26.

［10］舒梅, 許楊, 徐熙, 等. 兩種水生動物抗菌肽的原核表達及活性分析［J］. 中國生物工程雜志, 2011, 31（2）：56-61.

［11］陳玉海, 陳慶煌, 陳科, 等. 抗菌肽magaininⅡ的密碼子優(yōu)化及在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達［J］. 生物工程學報, 2014, 30（4）：615-624.

（責任編輯 馬鑫）

Expression of diptericin Gene from Musca domestica in Escherichia coli

LU Min1，2BAI Jie1WEI Feng-xian1WANG Lin-yi1XU Bin1YIN Qing-qiang2LI Shao-yu1
（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002；2. College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002）

In order to efficiently acquire the antibacterial peptide by prokaryotic expression，diptericin gene for the antibacterial peptide in housefly was reversely synthesized by RT-PCR method. Then，diptericin gene was cloned to pGEX-4T-1 expression vector and transformed into Escherichia coli BL21 for protein expression. Sequencing result showed that housefly’s diptericin gene was 345 nucleotides in length. Recombinant pGEX-4T-1 was induced by IPTG，and the expression of diptericin fusion protein was detected by SDS-PAGE electrophoresis and Western blot. The result showed that diptericin fusion protein with GST-tag was about 37 kD，and the target protein was purified by GST purification column.

housefly；antibacterial peptide；diptericin；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.020

2015-09-02

河南省科技攻關項目（142102110069），國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系項目（CARS-42）

盧敏，女，博士研究生，研究方向：動物營養(yǎng)與飼料科學；E-mail：453808792@qq.com

李紹鈺，男，研究員，研究方向：動物營養(yǎng)調(diào)控與飼料高效利用；E-mail：lsy9617@aliyun.com