重組融合蛋白Trx-IFN-CSP復(fù)性工藝研究

黃演婷盧雪梅楊小蓉金小寶朱家勇

（1. 廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院，廣州 510006；2. 廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院藥用生物活性物質(zhì)研究所，廣州 510006；3. 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣州 510006）

重組融合蛋白Trx-IFN-CSP復(fù)性工藝研究

黃演婷1，2，3盧雪梅2，3楊小蓉1金小寶2，3朱家勇2，3

（1. 廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院，廣州 510006；2. 廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院藥用生物活性物質(zhì)研究所，廣州 510006；3. 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣州 510006）

旨在建立并優(yōu)化融合蛋白Trx-IFN-CSP的復(fù)性工藝。對重組融合Trx-IFN-CSP進行體外復(fù)性研究，考查pH、溫度、蛋白濃度、氧化還原體系及輔助復(fù)性小分子等復(fù)性條件對融合蛋白重折疊的影響。結(jié)果顯示，適合Trx-IFN-CSP復(fù)性的方法為，反復(fù)凍融聯(lián)合超聲破菌獲得包涵體；用含有1% TritonX-100、2 mol/L尿素、2% DOC洗滌液初步純化包涵體；再用6 mol/L鹽酸胍溶解液變性包涵體；脈沖加樣稀釋變性液后4℃條件下梯度透析復(fù)性，使用L-Arg輔助復(fù)性。經(jīng)腸激酶切去Trx標(biāo)簽后，每升發(fā)酵液最終獲得110-130 mg肝靶向干擾素，每批蛋白純度都在95%以上，比活性在1.9-2.4×108U/mg之間，制備工藝穩(wěn)定。

融合蛋白；肝靶向干擾素；包涵體；脈沖稀釋；梯度透析

近年來，重組DNA技術(shù)的快速發(fā)展和蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)的多樣性為利用微生物大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物開辟了廣闊的空間。但是，重組蛋白的高表達常常導(dǎo)致其在胞內(nèi)發(fā)生錯誤折疊和聚集，形成包涵體（Inclusoin bdoy）。目前，包涵體的形成機制仍不清楚，但一般認(rèn)為包涵體是由部分折疊的中間態(tài)之間疏水性相互作用形成的，是蛋白質(zhì)過量表達的結(jié)果，而與其相對分子質(zhì)量、疏水性以及折疊途徑等內(nèi)在性質(zhì)沒有必然的聯(lián)系［1］。即對于任何蛋白質(zhì)和任何表達系統(tǒng)來說，在過量表達的情況下都可能形成包涵體。包涵體表達量高且一級結(jié)構(gòu)正確，經(jīng)過變復(fù)性即可恢復(fù)蛋白生物活性，因此許多蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)依賴于蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)的提高。

1961年，Anfinsen［2］在研究RNaseA中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)多肽鏈的折疊是一個自發(fā)的過程，主要決定于它的氨基酸序列，這也被稱為生物體內(nèi)的第二套遺傳密碼。目前，雖然仍無法明確解釋蛋白質(zhì)如何從伸展態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩砘钚缘奶烊粦B(tài)。但普遍認(rèn)為，分子間疏水作用是導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集、變性蛋白復(fù)性收率降低的主要原因。隨著對蛋白質(zhì)折疊機理的深入研究發(fā)現(xiàn)，暴露在變性蛋白表面的疏水基團既有通過分子內(nèi)疏水作用逐步折疊為天然態(tài)蛋白質(zhì)的趨勢，也有通過分子間相互作用形成二聚體、三聚體等無活性沉淀的趨勢。蛋白質(zhì)的分子間疏水基團各不相同，所以沒有任何一種復(fù)性方法能復(fù)性所有的蛋白。對于某一特定蛋白的復(fù)性最佳方案，需要經(jīng)過具體實驗研究確定。探討各種復(fù)性方法及相關(guān)因素，有助于尋找到最適宜的復(fù)性方案，對蛋白藥物的開發(fā)生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。

Trx-IFN-CSP是本實驗室通過基因工程方法構(gòu)建的重組融合蛋白，初步研究證實具備了CSP I-plus高效而特異的肝細(xì)胞靶向性與IFN的抗HBV作用。本研究在前期基礎(chǔ)上旨在篩選出一套適合Trx-IFNCSP復(fù)性的方法，采用反復(fù)凍融聯(lián)合超聲破菌收集包涵體，經(jīng)過洗滌后選用鹽酸胍溶解變性；考查pH、溫度、蛋白濃度、氧化還原體系及輔助復(fù)性小分子等復(fù)性條件對融合蛋白重折疊的影響，并驗證優(yōu)化得出的制備工藝的穩(wěn)定性，旨在為獲得一套穩(wěn)定的肝靶向干擾素制備工藝和足夠肝靶向干擾素開展后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 含Trx-IFN-CSP基因的重組菌株E.coli

BL21/pET32a-IFN-CSP，系本課題組構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑 蛋白預(yù)染Marker購自Fermentas生物公司；DTT、GSSG、GSH、DOC購自Sigma公司；其余常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要溶液 （1）細(xì)菌裂解液：30%蔗糖、1 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。（2）IBs洗滌液：10 mmol/L EDTA、1% Triton X-100、2 mmol/L尿 素、2% DOC、50 mmol/LTris-HCl。（3）IBs溶解液：6 mol/L鹽酸胍、5 mmol/L EDTA、2.5 mmol/L DTT、50 mmol/L Tris-HCl。（4）IBs稀釋液：2 mol/L鹽酸胍、0.1 mol/L精氨酸、2 mmol/L GSH、0.2 mmol/L GSSG、5%甘 油、50 mmol/L Tris-HCl。（5）透析外液A：1.5 mol/L鹽酸胍、0.1 mol/L精氨酸、2 mmol/L GSH、0.2 mmol/L GSSG、5%甘油、50 mmol/L Tris-HCl。（6）透析外液B：1.0 mol/L鹽酸胍、0.05 mol/L精氨酸、2 mmol/L GSH、0.2 mmol/LGSSG、3%甘油、50 mmol/L Tris-HCl。（7）透析外液C：0.5 mol/L鹽酸胍、1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG、3%甘油、50 mmol/L Tris-HCl。（8）透析外液D：1%甘油、50 mmol/L Tris-HCl。

1.2 方法

1.2.1 包涵體的釋放 發(fā)酵液經(jīng)6 000 r/min 離心10 min 后，棄上清收集菌沉，用0.1倍體積的4℃預(yù)冷的細(xì)菌裂解液重懸菌沉，-20℃結(jié)凍過夜后，37℃水浴凍融細(xì)胞，冰浴條件下使用超聲細(xì)胞破碎儀破碎30 min（功率450 W，工作2 s，停頓2 s）。破碎后于4℃，12 000 r/min 離心30 min，棄去上清，即得Trx-IFN-CSP包涵體粗品。

1.2.2 包涵體的洗滌與溶解 用IBs洗滌液重懸包涵體，漩渦混勻后室溫靜置15 min后，10 000 r/min，4℃離心10 min。分別于洗滌前后各取40 μL樣品，加入10 μL 5×SDS上樣緩沖液，混勻后沸水煮5 min，冷卻后10 000 r/min 離心10 min，吸上清，進行15% SDS-PAGE檢定，利用Gel DOCTM凝膠成像系統(tǒng)分析包涵體洗滌前后重組蛋白的比例。

將洗滌后的包涵體重懸于IBs溶解液，漩渦混勻，室溫放置至包涵體全部溶解。分別于溶解前后各取50 μL樣品，加入9倍體積的無水乙醇-20℃放置2 h，4℃，10 000 r/min離心15 min 收集沉淀，進行15% SDS-PAGE檢定，利用Gel DOCTM凝膠成像系統(tǒng)分析包涵體溶解前后重組蛋白的比例。

1.2.3 Trx-IFN-CSP的復(fù)性研究

1.2.3.1 pH對復(fù)性的影響 冰浴條件下，將包涵體變性液脈沖加樣逐滴加入不同pH值（pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5 和pH 9.0）的IBs稀釋液中，低溫放置2 h后，將稀釋后的變性液裝進透析袋中開始梯度透析，從透析外液A依次到透析外液D，每次透析至少8 h。測定上清液中的蛋白濃度及經(jīng)腸激酶切去Trx標(biāo)簽后，肝靶向干擾素的抗病毒活性以評價pH對復(fù)性的影響。

1.2.3.2 溫度對復(fù)性的影響 其他實驗條件不變，分別在0℃、4℃、11℃、25℃和37℃開始梯度透析。

1.2.3.3 蛋白濃度對復(fù)性的影響 其他實驗條件不變，調(diào)整IBs稀釋液的量使變性蛋白終濃度分別為100、200、300、400 和500 μg/mL，開始梯度透析。

1.2.3.4 氧化還原體系對復(fù)性的影響 其他實驗條件不變，將包涵體變性液脈沖加樣逐滴加入分別含有 Cysteine/Cystine、DTT/GSSG、β-ME/GSSG、GSH/ GSSG的氧化還原體系的IBs稀釋液中開始梯度透析。

1.2.3.5 小分子添加劑對復(fù)性的影響 其他實驗條件不變，將包涵體變性液脈沖加樣逐滴加入分別含有 Glycero、Tween-20、Glycine、Arginine、β-CD、CTAB、Sucrose輔助復(fù)性小分子的IBs 稀釋液中開始梯度透析。

2 結(jié)果

2.1 包涵體釋放

將收集的細(xì)胞重懸于30%高滲蔗糖緩沖液中，在-20℃結(jié)凍，滲透壓和低溫使細(xì)胞內(nèi)的水分變成了冰晶，造成細(xì)胞明顯脫水，另外冰晶能對細(xì)胞膜造成物理損傷，在37℃水浴解凍時，細(xì)胞吸水溶脹將導(dǎo)致細(xì)胞壁部分破碎，經(jīng)過反復(fù)凍融處理可進一步提高細(xì)菌破碎率。由于超聲破碎過程中有大量熱量釋放，所以使用冰浴及間歇破碎的方式，對于達到較好的破碎效果以及避免Trx-IFN-CSP包涵體的熱變性有重要作用。細(xì)胞破碎后，8 000 r/min 離心30 min，棄去上清，即獲得包涵體粗品。1 L發(fā)酵液可得到1.17 g Trx-IFN-CSP包涵體。

2.2 包涵體的洗滌及溶解

超聲破菌后高速離心獲得的包涵體沉淀除了融合蛋白外，還含有膜蛋白及脂質(zhì)體等其他成分，而這些成分會影響包涵體蛋白的變復(fù)性。所以溶解變性前應(yīng)先洗滌包涵體，以去除雜質(zhì)。對包涵體的洗滌時發(fā)現(xiàn)，洗滌液的成分不同對包涵體的洗滌效果有較大的影響。首先實驗發(fā)現(xiàn)鹽酸胍洗滌包涵體會造成融合蛋白的大量損失，而低濃度的尿素的洗滌效果更好。再者實驗結(jié)果證明1% TrionX-100和2% DOC對宿主菌蛋白有很好的增溶作用，但是TrionX-100 洗滌時間不宜過長，否則也會導(dǎo)致目的蛋白的降解。利用2 mol/L尿素、1% TrionX-100和2%DOC聯(lián)合洗滌的方法，有很好的純化效果，15%SDS-PAGE 顯示（圖1-A，條帶3）其純度為62.3% 左右，而且包涵體的可溶性大大提高。

在洗滌過后，包涵體的純度及可溶性都有所提高，在此基礎(chǔ)上分別選用過8 mol/L尿素和6 mol/L鹽酸胍變性包涵體，實驗結(jié)果表明Trx-IFN-CSP包涵體在8 mol/L尿素中溶解相當(dāng)困難，超聲助溶及37℃震蕩助溶效果都不理想，而使用6 mol/L鹽酸胍變性，室溫放置30 min則可有效地將包涵體溶解。為了徹底的將包涵體中的二硫鍵打開，提高包涵體溶解度，降低重組蛋白的損失率，在IBs溶解液中加入5 mmol/L EDTA 和2.5 mmol/L DTT，15% SDSPAGE 顯示（圖1-B，條帶3）其純度為64.7%。

2.3 Trx-IFN-CSP的復(fù)性研究

2.3.1 pH對復(fù)性的影響 不同pH對復(fù)性的影響結(jié)果示于圖2-A?？芍趐H7.0-8.0 時復(fù)性的融合蛋白活性高于其他pH復(fù)性的樣品，干擾素對于發(fā)揮其生物活性作用時的pH有嚴(yán)格的范圍，若超出范圍其活性受限。所以當(dāng)pH偏酸或偏堿時，包涵體雖然可以發(fā)生折疊，但折疊后的融合蛋白處于不利于保持其活性的環(huán)境中，活性易喪失。當(dāng)復(fù)性液pH為7.0和7.5時，其蛋白收率明顯低于pH8.0。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點時蛋白質(zhì)的凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于結(jié)聚形成沉淀，所以復(fù)性pH應(yīng)避開蛋白質(zhì)等電點。由此可見，Trx-IFN-CSP復(fù)性宜在pH8.0左右進行。

圖1 融合蛋白洗滌、變性溶解結(jié)果

2.3.2 溫度對復(fù)性的影響 溫度對復(fù)性的影響結(jié)果如圖2-B。由圖可知，在4℃復(fù)性的融合蛋白的活性和收率都高于在25℃和37℃復(fù)性的樣品。包涵體變性蛋白在折疊過程中，分子內(nèi)的疏水氨基酸殘基暴露在外，使多肽鏈的疏水基團之間相互發(fā)生碰撞，形成錯誤折疊導(dǎo)致蛋白聚沉。而隨著復(fù)性溫度的升高，疏水作用力增強，使聚集體更容于形成，造成活性及收率的降低。由此可見，Trx-IFN-CSP復(fù)性宜在低溫條件（4℃）下進行。

2.3.3 蛋白濃度對復(fù)性的影響 不同蛋白濃度對復(fù)性的影響結(jié)果示于圖2-C。傳統(tǒng)的稀釋復(fù)性時，復(fù)性液的蛋白濃度需在10-100 μg/mL 才會有較理想的復(fù)性效率，但這無疑會加大對活性蛋白回收的難度，不利于大規(guī)模操作。所以本研究選用脈沖加樣的方式稀釋變性液。當(dāng)復(fù)性體系中蛋白濃度為200 μg/mL、300 μg/mL 時，復(fù)性后融合蛋白的活性與100 μg/mL 時復(fù)性的相當(dāng)。而復(fù)性體系中各蛋白濃度對蛋白收率的影響不大。脈沖稀釋時，保證了有足夠的時間間隔使蛋白折疊通過易聚集的早期中間體階段，Trx-IFN-CSP包涵體變性蛋白的終濃度越低，越有利于變性蛋白的重折疊。在復(fù)性時，蛋白中間態(tài)含有大量的疏水基團，溶液中蛋白濃度越高，分子間作用力越大，蛋白質(zhì)分子間聚合趨向性就越大，蛋白質(zhì)相互結(jié)合形成寡聚體或多聚體，這些聚合體再進一步聚合則形成沉淀，導(dǎo)致復(fù)性失敗。蛋白濃度一般在200-300 μg/mL為宜。

2.3.4 氧化還原體系對復(fù)性的影響 不同氧化還原體系對復(fù)性的影響結(jié)果示于圖2-D。4對氧化還原體系實驗組中，GSH/GSSG復(fù)性組的融合蛋白復(fù)性后比活性高于其他實驗組，而各組氧化還原體系對Trx-IFN-CSP復(fù)性的蛋白收率影響不大。Trx-IFN-CSP含有兩對半胱氨酸，在重折疊過程中通過添加氧化還原體系來提供合適的氧化還原電位，GSSG負(fù)責(zé)促進二硫鍵的形成，而GSH則催化錯誤配對的二硫鍵進行重排，可促進其二硫鍵的正確配對。DTT/GSSG和β-ME/GSSG復(fù)性組的比活性低的原因可能是由于GSSG與DTT和β-ME的比例超出了合適范圍，以致于復(fù)性液還原性太強，二硫鍵將難以形成。

2.3.5 小分子添加劑對復(fù)性的影響 不同輔佐復(fù)性小分子對復(fù)性的影響結(jié)果示于圖3。添加了輔助復(fù)性小分子的各復(fù)性組的比活性和蛋白收率與對照組相比都有大大的提高。這些輔助添加劑一般情況下都是通過增強分子間相互作用來穩(wěn)定蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)，或是通過減弱分子內(nèi)的疏水作用來抑制聚集體形成，從而輔助蛋白折疊。其中L-Arg的輔助效率最高，表明L-Arg可選擇性與錯誤折疊結(jié)構(gòu)結(jié)合，使錯誤折疊的分子不穩(wěn)定從而促進分子形成正確構(gòu)象，其輔助復(fù)性有一定的通用性，因為其結(jié)合錯誤折疊分子時不具有蛋白質(zhì)種類特異性。

2.4 Trx-IFN-CSP復(fù)性工藝的穩(wěn)定性

綜合上述實驗的結(jié)果，得出一套適合Trx-IFNCSP復(fù)性的方法：將包涵體變性液脈沖加樣緩慢逐滴加預(yù)冷的IBs稀釋液中，將變性液蛋白濃度調(diào)至300 μg/mL 左右，低溫放置2 h后，開始梯度透析復(fù)性，溫度4℃，從透析外液A依次到透析外液D，每次透析至少8 h。對復(fù)性前后的蛋白進行15% SDS-PAGE 檢定，上樣量10 μg，利用Gel DOCTM凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果（圖4）顯示融合蛋白復(fù)性后純度達95.0%。

連續(xù)3次進行Trx-IFN-CSP的制備，確認(rèn)該工藝的合理性與穩(wěn)定性，同時大量獲得Trx-IFN-CSP。結(jié)果如表1所示，經(jīng)腸激酶切去Trx標(biāo)簽后，每升發(fā)酵液最終獲得的肝靶向干擾素約110-130 mg之間，每批蛋白純度在95%以上，比活性在1.9-2.4×108U/mg之間，制備條件穩(wěn)定。

圖2 Trx-IFN-CSP的復(fù)性條件研究

圖3 添加劑對Trx-IFN-CSP包涵體復(fù)性的影響

3 討論

Trx-IFN-CSP是本實驗室通過基因工程方法構(gòu)建的重組融合蛋白，是將IFN-α2b與瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP I-plus進行融合，連接到pET32a載體上表達而獲得的。Trx-IFN-CSP經(jīng)腸激酶切去Trx標(biāo)簽后即獲得肝靶向干擾素（IFN-CSP），旨在利用CSP I-plus高效特異的肝細(xì)胞靶向性可將IFN-α2b導(dǎo)向肝臟，使其在肝臟富集，有從而提高干擾素治療乙型肝炎病毒慢性感染的特異性，減少全身用量，降低毒副反應(yīng)，提高量效比。初步研究證實，肝靶向干擾素具備了CSP I-plus高效而特異的肝細(xì)胞靶向性與IFN的抗HBV作用，有重大的開發(fā)應(yīng)用潛力。本研究正是為了獲得一套穩(wěn)定的肝靶向干擾素制備工藝，為開展后續(xù)新藥研究工作奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

Anfinsen［2］經(jīng)典的RNaseA折疊研究中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能的全部信息都來源于其氨基酸組成和排列；多肽鏈的折疊是一個自發(fā)的過程，主要決定于它的氨基酸序列。這一規(guī)律也被稱為生物體內(nèi)的第二套遺傳密碼。不同的蛋白質(zhì)需要的復(fù)性條件不同，相同的因素對不同蛋白質(zhì)的復(fù)性的影響也不同。本研究結(jié)合稀釋復(fù)性及透析復(fù)性方法復(fù)性，一方面無需過大地增加溶液體積，便于后續(xù)回收；另一方面提高復(fù)性率。

圖4 Trx-IFN-CSP包涵體復(fù)性

表1 肝靶向干擾素連續(xù)三批制備結(jié)果

稀釋和透析都是傳統(tǒng)的復(fù)性法，其方法簡單，易于實驗室操作［3］。但在單純的稀釋復(fù)性時，為了減少聚集提高復(fù)性收率，通常需要在很低的蛋白濃度（10-100 μg/mL）下進行［4］。這對于于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)來說，效率太低，后續(xù)工作過多而顯得不大實際。Katoh等［5］將流加操作引入復(fù)性過程，即脈沖稀釋，以流加的方式向復(fù)性緩沖液中注入變性蛋白質(zhì)。這種復(fù)性方法已在變性溶菌酶復(fù)性中得到了驗證。所以本研究采用了復(fù)性，以求在提高蛋白質(zhì)復(fù)性收率的同時設(shè)法增大蛋白質(zhì)濃度，使復(fù)性過程中維持較低的變性蛋白濃度而復(fù)性終蛋白濃度較高，其關(guān)鍵在于掌握變性蛋白加入的時間間隔，在后一部分加入之前，前一部分有一段時間可以折疊，相當(dāng)于降低了稀釋時復(fù)性體系中變性蛋白的濃度，從而降低了變性蛋白發(fā)生分子間作用而聚集沉淀的幾率。脈沖稀釋復(fù)性在每次蛋白加入之間，保證有足夠的時間間隔使蛋白折疊通過易聚集的早期中間體階段，提高單位體積復(fù)性液的復(fù)性蛋白量，是實現(xiàn)高復(fù)性濃度下的稀釋復(fù)性的一條途徑。

在優(yōu)化復(fù)性方式的基礎(chǔ)上，本實驗對影響復(fù)性的因素如pH、溫度、變性蛋白質(zhì)的濃度以及氧化還原體系進行考察，以經(jīng)腸激酶去除Trx標(biāo)簽后肝靶向干擾素的比活性與融合蛋白收率為雙指標(biāo)，摸索出較優(yōu)的復(fù)性條件。（1）體外折疊復(fù)性的緩沖液pH值常控制在7.0-9.0之間，這是因為堿性環(huán)境能夠防止變性蛋白質(zhì)中還原的自由巰基因為硫醇質(zhì)子化作用而影響二硫鍵的正確形成［6］。在不同pH值下，蛋白質(zhì)所帶電荷量不同，在溶液pH值等于其pI時，蛋白質(zhì)所帶凈電荷數(shù)最少，而蛋白質(zhì)帶電荷的情況直接影響其在溶液中的穩(wěn)定性，進而影響其在復(fù)性中的行為［7］。所以復(fù)性液pH在偏堿性的同時還需盡量遠離蛋白的pI值，以減少蛋白質(zhì)的聚集。（2）折疊復(fù)性的溫度范圍為0-40℃［8］，在這個溫度范圍內(nèi)，折疊復(fù)性的速度和復(fù)性率隨溫度的增高而增高，但聚集的速度也隨之增高。低溫時復(fù)性雖慢但成功率高。（3）復(fù)性過程中蛋白的折疊為一級反應(yīng)，而蛋白質(zhì)的聚集是二級以上的反應(yīng)［9］，其速度受濃度影響大，低蛋白濃度有利于獲得較高的復(fù)性收率。在復(fù)性時，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度過大會產(chǎn)生不穩(wěn)定的中間物，使疏水基暴露在中間物表面，在疏水基團相互作用下，產(chǎn)生聚集沉淀物。如此不但產(chǎn)物收率降低，還增加了不溶性無活性蛋白質(zhì)聚積物。（4）氧化還原體系，是由小分子氧化型和還原型的巰基化合物混合組成。蛋白質(zhì)折疊的機制顯示，具有二硫鍵蛋白質(zhì)的復(fù)性成功與否與二硫鍵的形成與重排緊密相關(guān)。由于體外折疊沒有二硫鍵異構(gòu)酶的存在，蛋白質(zhì)折疊時巰基氧化容易產(chǎn)生錯誤配對的二硫鍵。所以需要氧化還原體系幫助蛋白質(zhì)通過分子內(nèi)重排成天然配對，二硫鍵的重排過程可能是這類蛋白質(zhì)折疊的限速步驟。

在復(fù)性過程中產(chǎn)生聚集體的主要原因是蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水相互作用［1］，因此抑制肽鏈間的疏水相互作用是提高復(fù)性收率的關(guān)鍵。為此，本研究比較了多種折疊促進劑和聚集抑制劑（Glycero、Tween-20、Glycine、Arginine、β-CD、CTAB、Sucrose）輔助Trx-IFN-CSP復(fù)性的效果。助折疊劑穩(wěn)定蛋白質(zhì)的原理在于它們能被蛋白質(zhì)優(yōu)先排斥，結(jié)果使蛋白質(zhì)優(yōu)先水化，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性［10］。聚集抑制劑是通過減弱分子內(nèi)的疏水作用，從而穩(wěn)定天然構(gòu)象來抑制聚集發(fā)生［11］。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的提高表明從變性態(tài)到復(fù)性態(tài)的過程是熱力學(xué)有利的過程，也就是說滲透質(zhì)的加入可以促進蛋白質(zhì)的折疊。實驗結(jié)果顯示，L-精氨酸對Trx-IFN-CSP復(fù)性的輔助效率最高。早在Fischer［12］和Buchner［13］的復(fù)性研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)L-精氨酸可以大大提高變性蛋白的復(fù)性成功率，分別是80%和100%。雖然，對L-精氨酸輔助蛋白復(fù)性的機制尚不完全清楚，但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)與低濃度的鹽酸胍及脲相比，L-精氨酸對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響微弱，因此推測可能是其增加了折疊中間體的溶解度才促進了復(fù)性。

4 結(jié)論

通過反復(fù)凍融聯(lián)合超聲破菌能高效獲得包涵體蛋白，尿素洗滌后再用鹽酸胍變性、脈沖加樣稀釋后梯度透析復(fù)性，建立了較為穩(wěn)定的制備工藝。經(jīng)腸激酶切去Trx標(biāo)簽后，每升發(fā)酵液可制備純度95%以上、比活性在（1.9-2.4）×108U/mg之間的肝靶向干擾素110-130 mg。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Renaturation Technology of Recombinant Fusion Protein Trx-IFN-CSP

HUANG Yan-ting1，2，3LU Xue-mei2，3YANG Xiao-rong1JIN Xiao-bao2，3ZHU Jia-yong2，3
（1. The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006；2. Institution of Pharmaceutical Bioactive
Substances，School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006；3.Guangdong Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances，Guangzhou 510006）

This work is to establish and optimize the method of refolding fusion protein Trx-IFN-CSP. The refolding of recombinant protein in vitro was studied，i.e.，investigating the effects of pH，temperature，protein concentration，redox systems and auxiliary refolding molecules on the refolding process of fusion protein. The results were as below. The proper measure to refold the Trx-IFN-CSP was to obtain the inclusion bodies by repeated combined freeze-thaw with ultrasonic to crack bacteria. The inclusion bodies were preliminarily purified using scrub solution of 1% TritonX-100，2 mol/L urea，and 2% DOC，and then denatured in 6 mol/L guanidine hydrochloride. After the pulse dilution，the renaturation was conducted under 4℃ by gradient dialysis with the assistance of L-Arg. After the Trx-tag was removed by recombinant enterokinase digestion，approximately 110-130 mg of the pure recombinant liver-targeted interferon was obtained from 1 L Escherichia coli culture. Each batch of protein had a purity of over 95% and antibacterial activities were about 1.9-2.4×108U/mg，thus the technology of preparation was stable.

fusion protein；liver-targeted interferon；inclusion body；pulse dilution；gradient dialysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.032

2015-08-02

國家科技部新藥創(chuàng)制重大專項項目（2013ZX09103003-003）

黃演婷，女，碩士,研究方向：藥用生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用；E-mail：olive1987@aliyun.com

朱家勇，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥用生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用；E-mail：zhujy@gdpu.edu.cn