結(jié)球甘藍(lán)ARC1與Exo70A1編碼區(qū)cDNA的克隆及進(jìn)化分析

楊丹 廉小平 周燕 張賀翠 杜丹 高啟國 任雪松 朱利泉

（西南大學(xué) 農(nóng)學(xué)部植物生理生化實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

結(jié)球甘藍(lán)ARC1與Exo70A1編碼區(qū)cDNA的克隆及進(jìn)化分析

楊丹 廉小平 周燕 張賀翠 杜丹 高啟國 任雪松 朱利泉

（西南大學(xué) 農(nóng)學(xué)部植物生理生化實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

在甘藍(lán)自交不親和信號(hào)傳導(dǎo)過程中，ARC1與Exo70A1的相互作用起著承上啟下的關(guān)鍵作用。為了研究10種自交不親和結(jié)球甘藍(lán)材料ARC1和Exo70A1的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)其編碼區(qū)cDNA進(jìn)行了克隆和測(cè)序；在此基礎(chǔ)上采用生物信息學(xué)方法，對(duì)這10種材料和前人已發(fā)表的83條ARC1和73條Exo70A1的相關(guān)序列的ARC1-Exo70A1的互作區(qū)和非互作區(qū)編碼序列進(jìn)行了變異和進(jìn)化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）所選育的10種結(jié)球甘藍(lán)材料的ARC1與Exo70A1的編碼區(qū)核酸序列存在平行進(jìn)化關(guān)系，且均聚類于蕓薹屬分支下；（2）ARC1比Exo70A1編碼區(qū)序列進(jìn)化速率快；（3）ARC1和Exo70A1互作編碼區(qū)核酸序列存在明顯的協(xié)同進(jìn)化，而ARC1和Exo70A1非互作編碼區(qū)核酸序列則在進(jìn)化上呈現(xiàn)明顯分異；（4）ARC1和Exo70A1互作編碼區(qū)cDNA的進(jìn)化均快于非互作編碼區(qū)。

ARC1；Exo70A1；自交不親和；進(jìn)化關(guān)系；協(xié)同進(jìn)化

蕓薹屬植物自交不親和反應(yīng)（self-incompatibility，SI）是沿著SCR（S cysteine-rich，S-富含半胱氨酸蛋白［1］）→SRK（S receptor kinase，S-受體激酶［2］） → ARC1（armadillo-repeat containing protein1）→Exo70A1→MOD［3］的途徑進(jìn)行的。SRK作為柱頭S基因，由胞外S結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)構(gòu)成，其同SCR識(shí)別的胞外S結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)變異性較大［4-6］，而SRK蛋白完整的胞外域包括B-Lection結(jié)構(gòu)域，SLG結(jié)構(gòu)域，PAN-APPLE結(jié)構(gòu)域。在SI反應(yīng)途徑中，ARC1與Exo70A1的相互作用起著承上啟下的關(guān)鍵作用。研究表明，ARC1的C端含有一個(gè)由6-7個(gè)臂重復(fù)區(qū)組成的ARM功能域，N端含有一個(gè)UND功能域，中間有一個(gè)U-box功能域［7］。ARC1的C端結(jié)構(gòu)域是與SRK激酶域發(fā)生相互作用的區(qū)域［7］，而U-box保守結(jié)構(gòu)域是70多個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的UFD2（泛素融合蛋白質(zhì)），其主要作為泛素連接酶-E3起作用，在泛素化系統(tǒng)中特異性識(shí)別底物蛋白質(zhì)［8］。Exo70A1是SI信號(hào)傳導(dǎo)途徑中ARC1的下游底物，是Samuel等［9］運(yùn)用酵母雙雜交文庫篩選技術(shù)從甘藍(lán)型油菜的柱頭細(xì)胞中分離出的一種新型SI信號(hào)傳導(dǎo)元件。Exo70A1蛋白的C端含有一個(gè)典型的Exo70結(jié)構(gòu)域［10］。油菜的Exo70A1基因含有12個(gè)外顯子及11個(gè)內(nèi)含子，研究表明Exo70Al可能是促進(jìn)花粉水合、萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)的親和因子，在SI反應(yīng)途徑中被ARC1參與的泛素/26S蛋白酶體途徑降解，從而導(dǎo)致柱頭對(duì)自花花粉的拒絕［11］。

Stone等的研究表明［7］，在ARC1和Exo70A1發(fā)生互作時(shí)，ARC1蛋白質(zhì)N端的U-box是不可缺少的結(jié)構(gòu)域；而楊佳等［11］的研究進(jìn)一步表明羽衣甘藍(lán)ARC1與Exo70A1相互作用區(qū)段是ARC1的N端（UND區(qū)段）和Exo70A1的N端（此蛋白質(zhì)的1-270個(gè)氨基酸）。而目前根據(jù)S位點(diǎn)基因序列構(gòu)建基因樹做進(jìn)化分析的文章也日益增多［12-14］。在這些研究的基礎(chǔ)上，本研究以高度自交不親和的結(jié)球甘藍(lán)為研究對(duì)象，并利用其編碼區(qū)序列分別對(duì)ARC1-Exo70A1互作區(qū)和非互作區(qū)編碼DNA進(jìn)行進(jìn)化分析，以期為選育的甘藍(lán)自交不親和材料在整個(gè)植物中初步建立起進(jìn)化位置和進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

近年來選育的高度自交不親和結(jié)球甘藍(lán)（表1），由西南大學(xué)園藝園林學(xué)院蔬菜實(shí)驗(yàn)室提供；大腸桿菌感受態(tài)DH5α、EasyPfu Taq DNA polymerase、膠回收試劑盒和TranScript First-strand cDNA Synthesis SuperMix、Mark III（ 目 錄 號(hào)：MD103） 購 自 北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA 連接酶、pMDTM19-T Vector、Sac I與Sma I購自TaKaRa大連公司；RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit（目錄號(hào)：DP432）購自天根生化科技（北京）有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純；引物合成與序列測(cè)定由北京華大基因公司完成。

表1 甘藍(lán)材料及其親和指數(shù)

1.2 方法

1.2.1 結(jié) 球 甘 藍(lán) ARC1與 Exo70A1 CDS（Coding sequence，編碼區(qū)序列）的克隆及測(cè)序 運(yùn)用Primer Premier 6.0軟件，依照Genbank中ARC1和Exo70A1已有的序列分別設(shè)計(jì)結(jié)球甘藍(lán)ARC1引物和Exo-70A1引物。所選擇的ARC1上游引物是（F-primer）5'-CCGGAATTCCCGATGGCCACTGATTCAGCAATGT TCGCAT-3'，下游引物是（L-primer）5'-ACGCGTCG ACGTTATCTCTGTGTTTTCTGGTCGCAC-3'；Exo70A1上游引物是（F-primer）5'-GGGAACATATGTACATG GCCGTCGATAGCGGAAT-3'，下游引物是（L-primer）5'-ACGCGTCGACCTTTACCGTCGTGGTTCATTCATAG ACT-3'。

收集開花前1 d結(jié)球甘藍(lán)花蕾的雌蕊，提取總RNA。以TranScript First-strand cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄合成進(jìn)cDNA第一鏈；再選用引物對(duì)，以所得cDNA為模板，對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增ARC1和Exo70A1基因。擴(kuò)增體系均為50 μL：模板4 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，上下游引物各2 μL，10×Easypruf Buffer 5 μL，ddH2O 31 μL，TransTaq酶 1 μL。PCR擴(kuò)增程序參數(shù)為：94℃預(yù)變性2 min；94℃預(yù)變性30 s，退火30 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；于72℃反應(yīng)5 min后再4℃ 5 min，反應(yīng)終止（T：ARC1為60℃，Exo70A1為62℃），反應(yīng)結(jié)束后，置于4℃冰箱。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀拍照，切膠，試劑盒回收純化產(chǎn)物。膠回收產(chǎn)物（ARC1、Exo70A1）分別進(jìn)行TA克隆，連接到pMDTM19-T載體；重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，藍(lán)白斑篩選陽性克隆子，挑取陽性克隆并經(jīng)PCR鑒定后，分別抽提質(zhì)粒pMDTM19-T-ARC1、pMDTM19-T-Exo70A1，抽提質(zhì)粒送北京華大科技公司測(cè)序。將測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行拼接獲取結(jié)球甘藍(lán)材料的序列。

1.2.2 ARC1-Exo70A1互作區(qū)與非互作區(qū)編碼DNA的確定 不包括U-box區(qū)域的N端編碼序列（UND結(jié)構(gòu)域）是ARC1-Exo70A1的互作編碼區(qū)段［8，10，11］。結(jié)合NCBI在線網(wǎng)站查詢序列的結(jié)構(gòu)域，利用MEGA5.05軟件對(duì)ARC1序列和Exo70A1序列進(jìn)行剪切，分別保留所需的互作編碼區(qū)和非互作編碼區(qū)于本地文件夾中。

1.2.3 結(jié)球甘藍(lán)ARC1和Exo70A1序列生物信息學(xué)分析 利用CLUATAL-W，Vector NTI Advance 10 進(jìn)行多重序列比對(duì)分析；dnasp5軟件進(jìn)行序列多態(tài)性分析。采用MEGA5.05構(gòu)建N-J模型進(jìn)化樹，僅在構(gòu)建進(jìn)化樹時(shí)將the bootstrap probabilities此項(xiàng)參數(shù)修改為1 000，其他步驟均采用默認(rèn)設(shè)置。

1.2.4 ARC1和Exo70A1相似序列的獲取 NCBI及Brassica Database（http://brassicadb.org/）等網(wǎng)站分別獲取與結(jié)球甘藍(lán)ARC1和Exo70A1核酸或氨基酸序列相似性（Similarity）大于70%的ARC1（表2），Exo70A1核酸序列（表3）。結(jié)球甘藍(lán)所得材料序列命名為序列名稱加基因名，如E1-ARC1，E1-Exo70A1。對(duì)于同一種屬的不同序列在名稱后加上大寫字母A，B，C等加以區(qū)分，如序列1命名1Arabidopsis thaliana A，簡(jiǎn)稱為1At-A。根據(jù)聚類情況來反映樹的可信度。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)球甘藍(lán)ARC1與Exo70A1編碼區(qū)DNA的克隆、測(cè)序及序列分析

提取RNA后，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得10種材料的cDNA。以cDNA為模板，分別擴(kuò)增獲得相應(yīng)10種材料的ARC1和Exo70A1的CDS（圖1）；分別連接到pMDTM19-T載體進(jìn)行測(cè)序，拼接后獲得所需序列數(shù)據(jù)，經(jīng)過Vector NTI分析可知，ARC1均為1 992 bp和 Exo70A1均為1 918 bp，與圖1中電泳結(jié)果條帶約在2 000 bp處相符。

圖1 ARC1和Exo70A1基因PCR電泳圖

10種材料的ARC1核酸序列相似度均高達(dá)97%以上，存在84個(gè)差異位點(diǎn)，氨基酸差異位點(diǎn)37個(gè)，且多為同義突變；10種材料的Exo70A1核酸序列相似度則均高于98%，有62個(gè)差異位點(diǎn)，氨基酸差異位點(diǎn)為23，也多為同義突變。圖2為ARC1與Exo70A1編碼區(qū)核酸序列與氨基酸序列局部比對(duì)圖（此部分為該序列差異位點(diǎn)最多的100 bp堿基區(qū)段），可以看出ARC1的核酸序列變異位點(diǎn)更多。綜上說明在自交不親和的結(jié)球甘藍(lán)中ARC1和Exo70A1序列高度相似，且Exo70A1比ARC1更為保守。

在線網(wǎng)站共收集獲得現(xiàn)有的83條ARC1和73

條Exo70A1本身及類似序列（表2，表3）。ARC1序列來自21個(gè)不同種屬，如蕓薹屬，擬南芥等；而Exo70A1則來自24個(gè)不同種屬。兩種基因的序列均可分為3大類：?jiǎn)巫尤~（水稻、小麥和玉米等），雙子葉植物（甘藍(lán)、白菜、擬南芥和大豆等）和低等植物（小立碗蘚和江南卷柏），但是未收集到江南卷柏的Exo701序列。序列比對(duì)結(jié)果表明：83條ARC1核酸序列相似度在41%-100%之間，存在677個(gè)差異位點(diǎn)；73條Exo70A1核酸序列相似度在43%-100%之間且大部分高于ARC1的相似度，有529個(gè)差異位點(diǎn)。

表2 ARC1序列GI號(hào)

表3 Exo70A1序列ACCESSION號(hào)

圖2 局部序列比對(duì)圖

2.2 ARC1-Exo70A1互作、非互作編碼區(qū)DNA的確定

在所獲得的73條Exo70A1的CDS序列中，其C-端均含有一個(gè)保守的Exo70結(jié)構(gòu)域。由文獻(xiàn)［11］可知：用ARC1 N端的UND功能域與Exo70A1的1-85氨基酸或1-270氨基酸互作均可激活報(bào)告基因，但與1-270氨基酸互作時(shí)其相互作用強(qiáng)度更大。據(jù)此認(rèn)為所獲得的Exo70A1序列CDS的前840 bp為 Exo70A1蛋白與ARC1蛋白的主要互作編碼區(qū)。此外根據(jù)楊紅等［5］研究結(jié)果可知：RING-finger type結(jié)構(gòu)與U-box蛋白質(zhì)相似，所以認(rèn)為其RING-finger結(jié)構(gòu)域功能類似于U-box結(jié)構(gòu)域；在NCBI網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)球甘藍(lán)ARC1結(jié)構(gòu)域，可知其存在U-box結(jié)構(gòu)域，且位于844-1 041 bp。

綜上可知ARC1-Exo70A1的互作區(qū)段（圖3），對(duì)序列進(jìn)行剪切。ARC1以U-box保守域的第一個(gè)上游核苷酸為剪切點(diǎn)，對(duì)于無U-box的序列以RING-finger結(jié)構(gòu)域（表2中編號(hào)為43、45、47、48、52、53、58和61）的第一個(gè)上游核苷酸為剪切點(diǎn)，獲得93條互作區(qū)和非互作區(qū)ARC1序列；Exo70A1以序列840 bp處為剪切點(diǎn)，得到83條互作區(qū)和81條非互作區(qū)Exo70A1序列（其中編號(hào)為42和65的序列，因其非互作區(qū)不完整未使用）。

2.3 蕓薹屬與擬南芥屬序列的相對(duì)進(jìn)化速率分析

10種材料結(jié)球甘藍(lán)序列相似性極高，利用其共有序列（命名為ARC1-C、Exo70A-C）進(jìn)行相關(guān)分析。蕓薹屬及擬南芥屬序列進(jìn)行多態(tài)性分析的結(jié)果，如表4和5所示。

非同義突變率（Ka）與同義突變率（Ks）的比值是選擇效應(yīng)和選擇方向的代表［16］。Ka/Ks大于1則說明基因受到正向選擇影響，為快速進(jìn)化基因；Ka/Ks等于1則說明同義突變與非同義突變頻率相同，未受到選擇的影響；Ka/Ks小于1則說明基因受負(fù)向選擇影響，為相對(duì)保守基因。蕓薹屬與擬南芥屬的ARC1和Exo70A1序列的Ka與Ks及其比值均小于1（表4和表5），說明在蕓薹屬與擬南芥屬中，ARC1與Exo70A1這兩個(gè)基因都受負(fù)向選擇影響，是相對(duì)保守的基因。

表4 ARC1多態(tài)性分析

表5 Exo7A1多態(tài)性分析

比較不同物種同源或同類大分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)可以得出其相對(duì)進(jìn)化速率［17］，其公式為：

其中，K代表相對(duì)進(jìn)化速率，2t代表進(jìn)化時(shí)間，d代表替換的大分子數(shù)，N代表總的大分子數(shù)。

運(yùn)用同義替換率估算分歧時(shí)間。序列間的同義突變（Ks）率如表4和5所示，且已知蕓薹屬與擬南芥的分歧發(fā)生在200萬年前（million years ago，MYA）［18］，根據(jù)上述公式可以得出K值：ARC1中Bo與At的同義突變率為1.478 7，得出KARC1為0.037 0［12］，同理可知KExo70A1為0.008 8，說明ARC1的相對(duì)進(jìn)化速率比Exo70A1快，其保守性要低。而根據(jù)編碼區(qū)內(nèi)的互作區(qū)與非互作區(qū)不同區(qū)段序列的同義突變率可知，KARC1互作為0.043 1、KARC1非互作為0.031 1、KExo70A1互作為0.011 4、KExo70A1非互作為0.000 7；說明在ARC1-Exo70A1互作中，核酸序列互作區(qū)的進(jìn)化速率比非互作區(qū)要快。

圖4 互作區(qū)ARC1的進(jìn)化樹

2.4 10種材料的ARC1與Exo70A1的平行進(jìn)化關(guān)系進(jìn)化樹圖4-圖7中大部分同一種屬的序列位置均較近，說明此進(jìn)化樹具有一定的可靠性。但個(gè)別同一種屬的序列分布在不同位置，，這可能是因?yàn)榛蚍只扔诹宋锓N分化。

2.4.1 ARC1-Exo70A1互作編碼區(qū)DNA的進(jìn)化分析 互作編碼區(qū)ARC1進(jìn)化樹（圖4-A）中單子葉植物與雙子葉植物均分為不同分支，而小立碗蘚和江南卷柏這兩個(gè)低等植物序列則在雙子葉部分獨(dú)立于一個(gè)分支下，說明ARC1的N端在進(jìn)化過程中在雙子葉植物與單子葉植物中已經(jīng)發(fā)生了分化。結(jié)球甘藍(lán)序列與羽衣甘藍(lán)序列3聚類于同一樹枝下，說明其親緣關(guān)系很近。

Exo70A1互作區(qū)進(jìn)化樹（圖5-A）的分支較短、大部分聚類到一處，說明Exo70A1保守性較高。該進(jìn)化樹可大體分為3大部分：上部的雙子葉分支，中間的單子葉分支，下部的雙子葉分支。結(jié)球甘藍(lán)序列與甘藍(lán)型油菜序列9聚類到蕓薹屬的這一樹枝下，與實(shí)際情況植物分類相符合。從進(jìn)化樹的分支情況可以看到蕓薹屬分支與擬南芥屬分支位置臨近，說明蕓薹屬與擬南芥屬的Exo70A1的N端在進(jìn)化中是很保守的，具有很近的親緣關(guān)系。序列66即小立碗蘚這一低等植物聚類于雙子葉富集區(qū)?？傮w上來說Exo70A1在蕓薹屬植物的種間及屬間高度保守。

圖5 互作區(qū)Exo70A1的進(jìn)化樹

根據(jù)ARC1互作區(qū)蕓薹屬部分放大圖（圖4-B）可知：蕓薹屬序列均聚類到同一樹枝下，說明蕓薹屬中ARC1的N-端保守性較好；擬南芥靠近，說明與擬南芥屬的親緣關(guān)系較為接近；蕓薹屬序列分為3部分，其中結(jié)球甘藍(lán)測(cè)序序列也分為3部分，但未發(fā)現(xiàn)其分支情況與親和指數(shù)之間的相關(guān)性。而觀察Exo70A1互作區(qū)的蕓薹屬部分（圖5-B）可發(fā)現(xiàn)：序列9甘藍(lán)型油菜與其他結(jié)球甘藍(lán)序列聚類在一起，這與ARC1互作區(qū)的分支情況存在差異；材料278，E1與序列7羽衣甘藍(lán)的親緣關(guān)系更近，并與其他結(jié)球甘藍(lán)材料聚類于不同分支下。

比較ARC1與Exo70A1互作編碼區(qū)DNA的進(jìn)化樹，可發(fā)現(xiàn)3個(gè)主要的共同點(diǎn)：第一，單子葉植物與雙子葉植物的序列均分別聚類于不同分支之下，說明ARC1與Exo70A1的互作編碼區(qū)DNA均在單子葉植物與雙子葉植物之間已經(jīng)發(fā)生了分化；第二，蕓薹屬與擬南芥屬的序列位置都十分靠近，說明ARC1與Exo70A1的互作編碼區(qū)DNA在進(jìn)化過程中至今仍然有著很近的親緣關(guān)系；第三，蕓薹屬序列分支情況類似；第四，低等植物序列均聚類于雙子葉富集區(qū)。綜上說明ARC1與Exo70A1的互作區(qū)存在協(xié)同進(jìn)化。

2.4.2 ARC1-Exo70A1非互作編碼區(qū)DNA的進(jìn)化分析 在ARC1與Exo70A1非互作編碼區(qū)進(jìn)化樹（圖6、圖7）中，不論ARC1還是Exo70A1，蕓薹屬的非互作編碼區(qū)序列都在同一分支下；非互作區(qū)進(jìn)化樹中雙子葉植物與單子葉植物也分別聚類于不同分支下，這與互作區(qū)進(jìn)化樹情況相同。

ARC1非互作編碼區(qū)構(gòu)建的進(jìn)化樹中（圖6）：與蕓薹屬親緣關(guān)系最近的是擬南芥（Arabidopsis），而大部分同一亞種的序列均聚類在同一分支下，表現(xiàn)出相同的亞種間同源性更高的情況；其蕓薹屬序列的分支情況與互作區(qū)部分相一致，而低等植物的序列則獨(dú)立于一個(gè)分支下，說明ARC1非互作區(qū)序列差異性更大；分支長(zhǎng)度短于互作區(qū)，即進(jìn)化速率慢。Exo70A1非互作編碼區(qū)構(gòu)建的進(jìn)化樹中（圖7）：整體分支情況類似于互作區(qū)；分支長(zhǎng)度也短于互作區(qū)；蕓薹屬序列未出現(xiàn)亞枝，說明其保守性非常好。

非互作區(qū)進(jìn)化樹表明：蕓薹屬序列分支情況存在一定的差異性；其進(jìn)化速率均低于互作區(qū)，與2.3中結(jié)果一致；低等植物的分支存在差異性。以上分析說明ARC1-Exo70A1互作中非互作區(qū)的DNA編碼序列比互作區(qū)比較而言更為保守。

圖6 ARC1非互作區(qū)進(jìn)化樹

3 討論

本研究以自交不親和結(jié)球甘藍(lán)為研究材料，結(jié)合生物信息分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)球甘藍(lán)ARC1與其他蕓薹屬ARC1序列相似性極高；結(jié)球甘藍(lán)Exo70A1與蕓薹屬Exo70A1序列也存在很高相似性及類似的結(jié)構(gòu)域，由此可知結(jié)球甘藍(lán)存在ARC1和Exo70A1的同源序列。

圖7 Exo70A1非互作區(qū)進(jìn)化樹

所選用的10種結(jié)球甘藍(lán)的親和指數(shù)在0-1.28之間，其ARC1和Exo70A1的核酸序列無明顯差異存在，親緣關(guān)系很近。說明在高度自交不親和系的材料中ARC1和Exo70A1序列的保守性較好，具有保守的功能來維持自交不親和信號(hào)通路。因此，在實(shí)際SI系選育過程中，對(duì)于親和指數(shù)略高于1的品系不應(yīng)立即舍棄，可多觀察幾代自交不親和情況后再?zèng)Q定是否保留該品系。與蕓薹屬親緣關(guān)系較近的擬南芥屬中，擬南芥A. thaliana生態(tài)型均為自交親和型，而琴葉擬南芥A. lyrata卻有天然的自交不親和型［20］；但是在本文進(jìn)化分析中發(fā)現(xiàn)ARC1和Exo70A1在蕓薹屬和擬南芥屬中卻具有很近的親緣關(guān)系和較高的相似度，但與禾本科等單子葉植物則進(jìn)化差異較大，考慮到自交不親和機(jī)制出現(xiàn)在20 MYA之后，故可以推則ARC1在不同生態(tài)型擬南芥中對(duì)SI的貢獻(xiàn)不同，ARC1在擬南芥A. thaliana中較完整，在擬南芥A. lyrata中則變異加大。在禾本科等單子葉植物中則變異更大，可能承擔(dān)著其他功能。因此，所選育甘藍(lán)品系的親和指數(shù)高低可能反映著ARC1參與SI反應(yīng)的強(qiáng)弱程度，而Exo70A1似乎沒有這些差異。

本研究所用材料是經(jīng)過多代人工選育所得，10個(gè)品種的不結(jié)球甘藍(lán)因受人為因素控制，導(dǎo)致其變異趨同，如體現(xiàn)在10種材料的ARC1和Exo70A1的基因編碼序列具有極高的相似度，說明在同一選擇壓下基因的變異及進(jìn)化會(huì)向著類似的方向進(jìn)行。在Vekemans等［14］文獻(xiàn)中曾提到在環(huán)境條件的限制下，人工選育SI系，可能導(dǎo)致其自交親和性的加強(qiáng)。如干旱等不利條件或有利于其向SC系過渡，而順境中SI雜種優(yōu)勢(shì)可大大抵消其向SC系的轉(zhuǎn)變。在逆境條件下，人工選育的SI系其S位點(diǎn)多態(tài)性偏少，這可能是材料更為集中，基因差異較低的原因之一。因此人工選育SI系過程中應(yīng)該盡量保持良好環(huán)境，在獲得SI系純種的基礎(chǔ)上盡量減少自交次數(shù)。本研究所用材料雖是不同來源的親本，但其選擇范圍、選育條件等都可能在所測(cè)定的序列中起到了選擇作用，從而被固定為某種變異序列，導(dǎo)致10種自交不親和結(jié)球甘藍(lán)其ARC1和Exo70A1序列相似度高，存在平行進(jìn)化關(guān)系，均聚類于蕓薹屬分支下。這說明短時(shí)期的逆境選育并未造成ARC1和Exo70A1編碼區(qū)DNA序列的改變，因此這種轉(zhuǎn)向是生理性的。但是選育自交不親和系最好在順境條件下進(jìn)行，因?yàn)橹挥性陧樉硹l件下，SI所表現(xiàn)的異交優(yōu)勢(shì)，才不會(huì)被逆境掩蓋，自交不親和性也才能得以延續(xù)下去，也才具有選育SI系的遺傳和生理基礎(chǔ)。

ARC1和Exo70A1互作編碼區(qū)存在協(xié)同進(jìn)化與其功能相適應(yīng)。本研究認(rèn)為ARC1與Exo70A1蛋白質(zhì)的相互作用可能促成了ARC1-Exo70A1互作編碼區(qū)DNA的協(xié)同進(jìn)化，即二者在進(jìn)化過程中相互影響，從而具有相類似的進(jìn)化方向。說明由于蛋白質(zhì)之間的相互作用需要不變的構(gòu)象，這可能在一定程度上約束了序列的變異程度，也就是說，當(dāng)一方發(fā)生改變時(shí)，另一方也相應(yīng)會(huì)發(fā)生改變，這樣才能保持蛋白質(zhì)之間仍舊存在互作所需的構(gòu)象，最終形成協(xié)同進(jìn)化這一趨勢(shì)。這與Goh等［21，22］提出的互作蛋白質(zhì)通常有相似的進(jìn)化關(guān)系且表現(xiàn)為互作區(qū)域有相似的進(jìn)化樹這一觀點(diǎn)相切合。此外，根據(jù)相對(duì)進(jìn)化速率分析得知ARC1比Exo701的進(jìn)化速度快，這與進(jìn)化樹分析結(jié)果相一致，說明ARC1基因的變化性更大，其在植物中可能具有多樣性的功能。

ARC1-Exo70A1互作編碼區(qū)的變異速率比非互作編碼區(qū)更快。首先，在上游的SCR-SRK互作中，SRK的胞外域（S domain）起了主要作用［4-6］，然而S domain卻具有多態(tài)性，其氨基酸序列表現(xiàn)出一定的差異［12］。根據(jù)Kitashiba的文章［23］，可知不同胞外結(jié)構(gòu)域的SRK屬于不同S單倍型，且S單倍型的分化先于物種分化，那么SRK胞外結(jié)構(gòu)域與SCR的進(jìn)化都應(yīng)受到單倍型約束，其分化也應(yīng)該先于物種分化；對(duì)于上游的蛋白質(zhì)而言，其可變性雖然較大，但還存在其他機(jī)制來保證反應(yīng)的進(jìn)行，如SLG（S-glycoprotein，S-糖蛋白［24］）與同一單倍型SRK的S domain存在90%的氨基酸相似性［23］，它與SRK之間可能存在一個(gè)機(jī)制以保證SI反應(yīng)的發(fā)生。其次，在SRK-ARC1互作中ARC1的臂重復(fù)（ARM）區(qū)域（與Exo70A1的非互作區(qū)）是互作區(qū)，由本研究結(jié)果可知這個(gè)區(qū)段進(jìn)化較慢，說明在SI途徑中SRKARC1互作占了比較重要的位置，需要較為保守的結(jié)構(gòu)域來維持反應(yīng)的進(jìn)行。最后，在下游互作蛋白ARC1-Exo70A1中互作區(qū)段序列也具有很大的可變性，說明其可能只是SI下游反應(yīng)的一個(gè)分支，或存在其他機(jī)制來保障SI反應(yīng)的順利進(jìn)行，而在楊佳等［10］的文章中提到破壞ARC1-Exo70A1途徑并不能完全打破SI，認(rèn)為SI信號(hào)網(wǎng)絡(luò)可能存在其他的分支。此外，Exo70A1的Exo結(jié)構(gòu)域（與ARCI的非互作區(qū)）其進(jìn)化慢，可能是與其他蛋白質(zhì)互作的區(qū)段，猜測(cè)其應(yīng)具有極其重要的作用；而目前已經(jīng)明確在酵母中Exo70結(jié)構(gòu)域能夠通過與Rho3 GTPase發(fā)生相互作用，來介導(dǎo)細(xì)胞的極性運(yùn)輸［25］。Vekemans等［14］認(rèn)為SI向SC的過渡是由許多獨(dú)立事件造成的，那么這些變異可能是分布于SI途經(jīng)中SCR、SRK、ARC1等相關(guān)蛋白的。短期內(nèi)，這些變異應(yīng)該是體現(xiàn)為隨機(jī)的序列變異，結(jié)合本研究，可知這些變異可能更加顯著地積累于重要蛋白的互作區(qū)核酸序列。

本研究分析了SI信號(hào)傳導(dǎo)途徑中蛋白質(zhì)ARC1和Exo-70A1，如果加入其他相關(guān)的互作蛋白進(jìn)行分析，或許能發(fā)現(xiàn)SI途徑相關(guān)蛋白質(zhì)編碼DNA的進(jìn)化規(guī)律，以期為其功能研究及SI信號(hào)傳導(dǎo)途徑研究提供參考。而目前已經(jīng)有許多軟件可以通過分子測(cè)年的方法來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的時(shí)序圖，那么下一步通過構(gòu)建時(shí)序圖便可獲得節(jié)點(diǎn)分歧時(shí)間，進(jìn)而得到序列在各種物種中的相對(duì)進(jìn)化速率，從而定量的分析不同大分子（核酸，蛋白質(zhì)等）的進(jìn)化速率［19］，來說明SI途徑相關(guān)大分子在不同選擇壓力下的進(jìn)化快慢，為SI的相關(guān)進(jìn)化研究提供新的內(nèi)容。

4 結(jié)論

10種結(jié)球甘藍(lán)自交不親和材料之間存在平行進(jìn)化關(guān)系；ARC1和Exo70A1在蕓薹屬和擬南芥屬中是相對(duì)較保守基因；在整個(gè)植物中ARC1和Exo70A1互作編碼區(qū)存在協(xié)同進(jìn)化，但變異速率卻比非互作編碼區(qū)快。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Phylogenetic Analysis of cDNA Sequences Coding for ARC1 and Exo70A1 in Brassica oleraces var. capitata L.

YANG Dan LIAN Xiao-ping ZHOU Yan ZHANG He-cui DU Dan GAO Qi-guo REN Xue-song ZHU Li-quan
（ Laboratory of Physiology and Biochemistry，Southwest University，Chongqing 400715）

Interaction between ARC1 and Exo70A1 in Brassica is a key point of self-incompatibility（SI）signal transduction. In order to study the evolutionary relationship of ARC1 and Exo70A1 from 10 cultivars of SI head cabbages developed in recent years，we successfully cloned and sequenced cDNAs of ARC1 and Exo70A1. Furthermore，by bioinformatics，we had mutation and evolutionary analysis of those coding region sequences，including interaction region and non-interaction regions of ARC1-Exo70A1 from the 10 cabbages and prior published 83 ARC1 and 73 Exo70A1 sequences. The results revealed that：1）The coding nucleic acid sequences of ARC1 and Exo70A1 from the 10 cabbage materials presented parallel evolutionary relationships，and belonged to the Brassica branch. 2）The evolution rate of coding sequence of ARC1 was faster than Exo70A1. 3）The interaction coding region of ARC1-Exo70A1 was obviously in the progress of co-evolution，while the non-interaction coding area of ARC1-Exo70A1 showed significant differentiation rate in evolution. 4）The evolutionary rate of interaction coding area was faster than non-interaction coding region.

ARC1；Exo70A1；self-incompatibility；evolutionary relationship；co-evolution

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.012

2015-10-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31572127），重慶市自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc2012jjB80010）

楊丹，女，碩士研究生，研究方向：分子作物育種；E-mail：yangdan042561@163.com

朱利泉，教授，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：zhuliquan@swu.edu.cn