李昊一,李冬敏,馬剛,商艷麗,孫英

( 河北大學化學與環(huán)境科學學院 藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室,河北保定　071002)

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牛血清白蛋白聚集體的分解動力學

李昊一,李冬敏,馬剛,商艷麗,孫英

( 河北大學化學與環(huán)境科學學院 藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室,河北保定071002)

摘要：以牛血清白蛋白(BSA)作為模型蛋白,通過濁度法研究BSA形成的無序蛋白聚集體的分解動力學并揭示其復雜結構細節(jié).實驗發(fā)現(xiàn),BSA無序聚集體在堿性條件下分解過程有4個動力學階段,包括1個快速的分解階段,2個相對較慢的分解階段和1個動力學惰性階段.由此推測BSA聚集體中至少含有4種不同的BSA單體形態(tài).

關鍵詞：蛋白聚集體；牛血清白蛋白；濁度法；動力學

蛋白質(zhì)聚集是所有蛋白的一種固有性質(zhì),在合適的條件下,可以說所有的蛋白都可以發(fā)生聚集.在生物制藥業(yè),這種聚集對蛋白藥物的生產(chǎn)提出巨大的挑戰(zhàn)[1-5].它幾乎影響到所有的生產(chǎn)步驟的質(zhì)量控制,如發(fā)酵階段[6]、搖動階段[7]、冷凍干燥階段[8]、成型階段[1]和儲藏階段[9-10].蛋白藥物的聚集會降低生產(chǎn)效率,縮短藥物保存期,使藥物的釋放變得復雜[2],更嚴重的是,這種聚集很可能會使病人產(chǎn)生免疫反應,成為生物制藥業(yè)最嚴重的安全隱患[11-13].此外,在生物體內(nèi),蛋白聚集還和40多種神經(jīng)退行性疾病、全身性疾病和非全身性疾病相關[14-15].這些淀粉樣疾病包括阿爾茨海默病[16]、帕金森癥[17]和Ⅱ型糖尿病[18],它們都和某種特定類型蛋白的聚集相關.

蛋白聚集是一個非常復雜的蛋白自我結合過程,包含多步動力學機制[19].這些步驟包括：1)蛋白單體的解折疊；2)可逆寡聚物的形成；3)成核過程；4)可溶的大分子量的中間態(tài)聚集體的形成；5)成熟纖維狀或無序聚集體的形成[19].蛋白聚集過程受很多因素影響,如溫度、pH、離子強度、震蕩和剪切力、凍融和凍干、干燥、有機溶劑、金屬離子、壓力、疏水表面以及濃度等.不同的外界條件和聚集方式可以誘導形成形貌各異的各種類型聚集體.

雖然蛋白聚集體的形貌各異、大小不同,仍可以大致把它們分為2類：有序蛋白聚集體和無序蛋白聚集體.有序蛋白聚集體主要是淀粉樣纖維聚集體,它與如前所述的許多影響人類健康的重大疾病相關[14].有序結構使得這些淀粉樣纖維相對而言容易進行結構表征,因此,到目前為止人們已經(jīng)對它們的結構細節(jié)有了很多了解.目前已知,在此類有序蛋白聚集體中,每條纖維都是由多個沿纖維軸縱向延展的β片層構成,β片層中的多肽鏈和纖維軸垂直,而組成纖維的片層則與纖維軸平行[20].這樣的超分子結構在X線衍射分析中約4.8 ×10-10m和 8×10-10～11×10-10m位置上會有特征的衍射峰,它們分別對應于肽鏈間距離和片層間距離[20-21].相對而言,對于在生物制藥過程中經(jīng)常出現(xiàn)的無序聚集體,人們對它們的結構細節(jié)了解甚少.實際上,即便采用先進的固態(tài)核磁技術,這種無序聚集體仍是難以表征.

本研究中,筆者擬應用濁度法對無序蛋白聚集體的結構細節(jié)進行研究.濁度法是蛋白藥物生產(chǎn)過程中為數(shù)不多的有效的質(zhì)量控制技術之一[13],易于表征蛋白聚集體的存在.但是,據(jù)筆者所知,濁度法尚沒有被用于蛋白聚集體復雜結構的研究.筆者采用濁度法研究牛血清白蛋白(BSA)無序聚集體的分解動力學,并通過動力學分析探討無序蛋白聚集體中的BSA分子是單一結構還是具有多種不同類型.對于無序聚集體,一般人們會認為在聚集體中所有的BSA分子混亂無序,共同形成一個整體.這種觀點看似合理,但是筆者的研究將給出不同的結果.

1材料與方法

1.1材料與儀器

質(zhì)量分數(shù)98%的牛血清蛋白(BSA)從瑞士羅氏公司購得；質(zhì)量分數(shù)99%的氯化鈉(NaCl)從美國Sigma-Aldrich公司購得；高純水通過美國密理博純水機制備；氫氧化鈉(NaOH)購自天津市光復科技發(fā)展有限公司,為分析純；鹽酸(HCl)購自北京化工廠,為優(yōu)級純；活性炭購自天津市進豐化工有限公司,為分析純,使用前活化.

德國Implen Nanophotometer紫外可見分光光度計；俄羅斯NT-MDT Solver P47掃描探針顯微鏡；美國Beckman Coulter DelsaTMNano C粒度分析儀.

1.2BSA的提純

市售BSA通常含有一定量的脂肪酸雜質(zhì),雖然含量各不相同,但是會阻礙BSA聚集,因此必須除去.筆者采取的方法如下[22]：稱量BSA 300 mg,加高純水15 mL,攪拌使其完全溶解后,用0.2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至1.5左右,加入活性炭300 mg吸收雜質(zhì),置于冰水浴中磁力攪拌1 h.然后用15 000 r/min速度離心3次,每次10 min.取上清液,確保沒有活性炭殘留,用0.2 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)pH 至8.9左右,最后過 0.22 μm的濾膜,得到澄清的且無活性炭的BSA 溶液.用紫外可見分光光度計測定此時的BSA 溶液的質(zhì)量濃度,約為15 mg/mL,BSA聚集實驗待用.

1.3BSA的聚集和聚集體預處理

取上述pH=8.9的BSA 溶液,加入NaCl 促進聚集,使NaCl的最終濃度約為240 mmol/L,62 ℃加熱BSA溶液24 h.在孵育過程中,澄清的BSA溶液會逐漸變得渾濁.在24 h聚集過程結束以后,15 000 r/min離心20 min,以去除較大的顆粒獲得含BSA納米級顆粒的膠體溶液體系.

1.4濁度法研究BSA聚集體的分解動力學

基于上述內(nèi)容，本文將引入Pareto分析法、Hamming距離測度、加權平均算子方法構建智能變電站裝配式建筑造價評價模型。

離心處理后的BSA膠體溶液用于BSA聚集體分解過程的研究.取一系列1.5 mL BSA 聚集體溶液,分別加入不同pH值的NaOH溶液0.5 mL.此外,另取1.5 mL BSA 聚集體溶液加0.5 mL高純水作為對照組.混合均勻后,用德國Implen紫外可見分光光度計測量各溶液在400 nm濁度(濁度用光密度OD表示).采用400 nm進行測量是為了避免蛋白中的色氨酸在280 nm處的吸收干擾.濁度隨時間的變化使用多指數(shù)函數(shù)衰減曲線進行擬合.動力學死時間為1 min,也就是說,在濁度測量之前,需要1 min將BSA聚集體溶液與NaOH混合.筆者報道的pH值為濁度研究的最終pH.整個實驗在室溫下進行.

1.5原子力顯微鏡(AFM)研究BSA聚集體形貌

AFM圖像通過俄羅斯的NT-MDT Solver P47掃描探針顯微鏡,采用輕敲模式測得.探針懸臂共振頻率為100 kHz,力常數(shù)為3 N/m.BSA聚集體樣品用高純水稀釋100倍,然后滴在嶄新的云母表面.靜置5 min后,用去離子水沖洗云母表面,自然風干后測樣.

1.6動態(tài)光散射(DLS)研究BSA聚集體粒度

BSA聚集體的粒徑分布采用美國Beckman Coulter 的DelsaTMNano C particle size analyzer測定.樣品放入一次性塑料樣品池,室溫測量.數(shù)據(jù)通過儀器內(nèi)置軟件處理.

2結果與討論

2.1濁度實驗概述

在研究BSA聚集體的結構細節(jié)時基于如下假設：在合適的環(huán)境微擾下,不同狀態(tài)的BSA分子在聚集體中的分解速率不同.在堿性條件下,監(jiān)測BSA聚集體分解過程的濁度變化,得到濁度衰減曲線,并對其進行擬合,以揭示不同動力學階段的存在.每個動力學階段都代表著不同的BSA分子存在狀態(tài),也就是說,BSA聚集體分解的濁度衰減曲線的多指數(shù)函數(shù)擬合結果,將說明BSA聚集體結構的復雜性.這個思路類似于廣泛應用在蛋白質(zhì)折疊研究里的動力學方法,即蛋白折疊動力學擬合曲線中的不同階段對應折疊過程中不同的動力學中間體[23-26].聚集體分解研究和蛋白質(zhì)折疊研究之間最主要的區(qū)別是前者筆者使用濁度方法監(jiān)測蛋白聚集體,后者人們利用光譜技術監(jiān)測蛋白單體.

2.2制備穩(wěn)定的BSA聚集體

2.3BSA聚集體的AFM和DLS表征

在動力學實驗前,首先需要使用AFM和DLS來表征BSA聚集體.如圖2的AFM圖像所示,BSA聚集體是形狀不同、大小不一的無序聚集體,大小從幾十納米到上百納米不等.因為AFM不易檢測溶液中的聚集體粒徑分布情況,通過DLS得到精確地BSA聚集體粒徑分布,見圖3,從中可以看出BSA聚集體的尺寸為20～100 nm.DLS更適合表征球形顆粒,通過AFM圖像可以看出BSA聚集體是不規(guī)則形狀的,所以在本實驗中DLS結果更適合作為BSA聚集體粒徑范圍的定性分析結果.

圖1　BSA聚集體系統(tǒng)濁度的穩(wěn)定性(OD) Fig.1　Turbidity stability of BSA aggregate system(OD).

圖2　BSA聚集體無序性質(zhì)的AFM表征Fig.2　AFM characterization of BSA aggregate showing its amorphous nature

2.4BSA聚集體堿性條件下分解的動力學分析

圖4展示了基于濁度法分析的不同pH條件下BSA聚集體分解的動力學曲線.從pH=11.6到pH=13.3,研究了7個不同的pH值.顯然,堿性條件下BSA聚集體容易分解,分解導致聚集體粒徑減小,所以濁度降低.衰減曲線采用多指數(shù)方程擬合,如圖4所示,各曲線擬合參數(shù)列于表1.從圖4和表1中可以看出,當pH=11.6,11.8,12.1時,衰減曲線用單指數(shù)方程擬合吻合性較好.這就是說,在這些pH條件下只有1種BSA聚集體分子分解.而pH=12.4,12.6,12.9,13.3時,衰減曲線更適合用雙指數(shù)方程擬合,即在這些pH條件下有2種BSA聚集體分子分解.然而,在上述全部pH條件下,濁度下降到一定程度后都不會再有進一步變化,不會完全消失,這說明BSA聚集體不能全部分解,仍然有一些BSA分子可以很好地抵抗堿性條件并且緊密的結合在一起.綜上所述,筆者認為至少有3種BSA分子存在于BSA無序聚集體中.

圖4　濁度法分析不同pH堿性條件下BSA聚集體的

表1　不同pH條件下BSA聚集體分解動力學擬合結果

單指數(shù)衰減方程:y=y0+A1exp(-k1t)；雙指數(shù)衰減方程:y=y0+A1exp(-k1t)+A2exp(-k2t),k1和k2為分解速率,t為時間,R2為擬合相關系數(shù).

2.5擬合唯一性的驗證

得到上述擬合結果后,需要對其唯一性進行驗證.由于任何數(shù)學擬合都受到主觀性的影響,對于同樣一條動力學衰減曲線,可能有幾套擬合參數(shù)都可以和它很好地吻合.為了避免這種現(xiàn)象的發(fā)生,進行了額外的擬合,結果見圖5.圖5中,使用雙指數(shù)函數(shù)對pH=11.6時的衰減曲線進行擬合,可以看出擬合結果非常好,但擬合參數(shù)中的k1和k2是相等的,說明此時曲線使用單指數(shù)擬合方式即可.在圖6中,用單指數(shù)函數(shù)對pH=12.6時衰減曲線的擬合唯一性進行驗證,擬合曲線明顯偏離了實驗數(shù)據(jù)點,所以在pH=12.6時采用雙指數(shù)函數(shù)進行擬合是合適的.

圖5pH=11.6時BSA聚集體的分解動力學曲線和其雙指數(shù)函數(shù)擬合

圖6pH=12.6時BSA聚集體的分解動力學曲線和其單指數(shù)函數(shù)擬合

Fig.5Dissociation kinetic curve of BSA aggregate at pH=11.6 and its double-exponential fit

Fig.6Dissociation kinetic curve of BSA aggregate at pH=12.6 and its single-exponential fit

2.6BSA聚集體分解的快速反應階段

通過詳細分析擬合結果,發(fā)現(xiàn)BSA聚集體分解過程存在一個快速反應階段.在蛋白質(zhì)折疊研究中,快速反應階段(burst phase)指的是在死時間內(nèi)(如在反應物快速混和過程中)發(fā)生的快速折疊過程[23].在本實驗中,快速反應階段是指在BSA聚集體和NaOH溶液的混合過程這個死時間內(nèi)發(fā)生的快速分解過程.它的大小等于零時刻的濁度真實值和擬合結果外推值之間的差值.在圖7中,通過pH=12.4時的分解動力學曲線來說明本實驗中快速反應階段的定義.零時刻真實的OD值實際上應該是用相同體積純水代替NaOH溶液加入BSA聚集體溶液的對照組中BSA聚集體的OD值,而計算的OD值是通過擬合曲線外推得到的.在圖7中,計算得到的OD值為0.266,真實的OD值為0.388.這2個OD值的差值0.122即為快速反應階段的量值.這說明快速反應階段就是,在NaOH加入BSA聚集體溶液所需的1 min死時間內(nèi),一些BSA分子快速從BSA聚集體中分解的階段.假設這些快速分解的BSA分子屬于第4種BSA分子,位于BSA聚集體的最外層.表2中,列出了在所有pH條件下真實的OD值、推測的OD值和快速反應階段的量值,從中可以看出在所有pH條件下都能觀察到快速反應階段的存在.

圖7　濁度法研究中快速反應階段的定義Fig.7　Illustration of the definition of burst phase in the turbidity assay

表2　BSA聚集體不同pH條件下零時刻真實的OD值、推測的OD值和快速反應階段的量值

2.7BSA聚集體中4種不同分子

筆者認為觀察到的4個動力學階段,包括1個快速分解階段,2個相對較慢的階段和1個動力學惰性階段,它們分別對應BSA無序聚集體中的4種分子.由此可能有人對本文的結論有以下幾個疑問：第1個疑問是,在蛋白聚集過程中,蛋白質(zhì)在聚集體表面和內(nèi)層本質(zhì)上是不同的.因此,可能會認為,在BSA的分解動力學中,表面和內(nèi)層的蛋白質(zhì)應該不同,從而導致至少2個動力學階段.筆者認為這種假設無法解釋觀察到的現(xiàn)象.首先,1個分子層的分解不能提供可以產(chǎn)生明顯濁度改變的聚集體總體積上的變化.濁度分析無法檢測BSA聚集體第1層和第2層分解速率之間的區(qū)別.其次,第1個分子層的分解會讓之前的第2層成為新的第1層.原則上,這2層分子仍有相同的分解速率.因此,筆者觀察到的多重動力學階段表明BSA聚集體結構的復雜性.第2個疑問是,觀察到不同的動力學速率是否對應于不同類型的BSA聚集體的分解,而不是不同類型的BSA分子.筆者的DLS研究可以排除這種可能性.在圖8、圖9中展示了BSA聚集體在pH=12.1和pH=12.9條件下分解過程的DLS表征.如圖所見,分解過程并沒有導致BSA聚集體在一個特定的尺寸范圍消失或減少,BSA聚集體的粒徑分布是整體移動的.

圖8　pH=12.1時BSA聚集體分解的DLS表征 圖9　pH=12.9時BSA聚集體分解的DLS表征Fig.8　DLS characterization of the dissociation of BSA Fig.9　DLS characterization of the dissociation of BSAaggregate system at pH=12.1 aggregate system at pH=12.9

圖10　動力學速率(k1)和pH之間的線性相關分析 Fig.10　Linear correlation analysis between kinetic dissociation rate (k1) and pH

2.8與胰島素纖維聚集體分解的比較

此前,Shammas等人進行過胰島素有序纖維聚集體在堿性條件下的分解動力學研究[27].筆者要在此討論一下這2種不同的聚集體在堿性條件下分解特性的不同：第一，在胰島素有序纖維聚集體系統(tǒng)只有2個動力學階段,沒有觀察到快速反應階段和動力學惰性階段,在強堿性條件下,胰島素纖維全部分解.不同的是,筆者發(fā)現(xiàn)對于BSA無序聚集體系統(tǒng)來說,分解過程存在4個動力學階段,包括1個快速反應階段,而且在強堿性條件下,BSA聚集體不會全部分解,即存在動力學惰性階段.第二,對于胰島素纖維,分解速率的對數(shù)和pH值之間存在完美的線性關系.這是因為胰島素纖維中有一個獨特的酸性氨基酸對其穩(wěn)定性產(chǎn)生了決定性的作用.筆者也對BSA聚集體的分解速率和pH值之間的關系進行了研究,結果如圖10所示.在圖10中,展示了不同pH條件下進行的80次濁度實驗的結果.采用動力學速率k1進行線性相關分析,從中可以看出只有一個粗略的線性相關性,并沒有一個很好的線性關系,說明有一系列酸性氨基酸都幫助維持BSA聚集體的穩(wěn)定性.這一現(xiàn)象可以歸因于BSA聚集體的無序特性.

3結論

在本文中,用濁度法研究了BSA無序聚集體的分解動力學,發(fā)現(xiàn)BSA聚集體在堿性條件下的分解過程有4個動力學階段,包括1個快速分解階段,2個相對較慢的分解階段,和1個動力學惰性階段.由此推斷BSA無序聚集體中至少包含4種不同的單體結構.

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(責任編輯：梁俊紅)

Structural insights into bovine serum albumin aggregates by a dissociation kinetic investigation

LI Haoyi,LI Dongmin,MA Gang,SHANG Yanli,SUN Ying

(Key Laboratory of Medicinal Chemistry and Molecular Diagnosis of Ministry of Education,College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China)

Abstract:Protein aggregation is not only a common problem in biopharmaceutical industry involving protein drugs,but also a devastating phenomenon closely linked to numerous human diseases.Understanding structural details of protein aggregates is fundamentally important in the prediction and prevention of protein aggregation behavior.In this study,we explore to use a turbidity-based dissociation kinetic assay to tackle the complex nature of protein amorphous aggregates by a model protein,bovine serum albumin(BSA).We observe that the dissociation of BSA aggregates under basic condition consists of four distinct kinetic phases,including a burst phase,two relatively slow phases,and one kinetically inert phase.Such kinetic observation allows us to hypothesize that BSA aggregates consist of at least four different types of BSA monomeric structures at the molecular level.To the best of our knowledge,this is the first turbidity-based investigation with the aim to elucidate the structural heterogeneity of protein amorphous aggregates.

Key words:protein aggregation;bovine serum albumin;turbidity;kinetics

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2016.01.007

收稿日期：2015-09-14

基金項目：國家自然科學基金資助項目(21075027)；教育部科學技術研究重點項目(211014)；高等學校博士學科點專項科研基金聯(lián)合資助課題(20121301110003)；河北省自然科學基金資助項目(B2011201082)

通信作者：馬剛(1971—),男,北京人,河北大學教授,主要從事與蛋白質(zhì)和納米材料相關物理化學研究.

中圖分類號：O643

文獻標志碼：A

文章編號：1000-1565(2016)01-0035-08

第一作者：李昊一(1991—),女,河北廊坊人,河北大學在讀碩士研究生.E-mail：haoyi19910324@sina.com.

E-mail：gangma@hbu.edu.cn