王　芳，康　超，李永霞，賈　強(qiáng)，聶　飛

(貴州省生物研究所，貴州　貴陽(yáng)　550009)

?

藍(lán)莓籽不同組分抗氧化作用的比較

王芳，康超，李永霞，賈強(qiáng)，聶飛

(貴州省生物研究所，貴州貴陽(yáng)550009)

摘要：目的：為了加強(qiáng)藍(lán)莓籽的綜合利用開(kāi)發(fā)，研究藍(lán)莓籽不同組分的抗氧化能力。方法：對(duì)藍(lán)莓籽的醇提取物、藍(lán)莓籽多酚、藍(lán)莓籽蛋白、藍(lán)莓籽多糖進(jìn)行提取分離，采用AAPH法、DPPH法對(duì)各組分進(jìn)行抗氧化能力測(cè)定。結(jié)果：AAPH法測(cè)定的抗氧化能力由高到低的順序?yàn)椋核{(lán)莓籽多糖﹥藍(lán)莓籽蛋白≈α—VC﹥醇提取物﹥藍(lán)莓籽多酚；DPPH法測(cè)定的清除自由基能力由高到低順序?yàn)椋核{(lán)莓籽多酚﹥醇提取物≈α—VC﹥藍(lán)莓籽蛋白﹥藍(lán)莓籽多糖。結(jié)論：藍(lán)莓籽不同組分均顯示出一定的抗氧化能力，其中以藍(lán)莓籽多糖、藍(lán)莓籽蛋白的抗氧化能力最強(qiáng)，藍(lán)莓籽多酚的清除自由基能力最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓籽；藍(lán)莓籽多酚；藍(lán)莓籽多糖；藍(lán)莓籽蛋白；抗氧化

藍(lán)莓(blueberry)又稱越橘，屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬 (Vaccinium.spp ) ，其果實(shí)除含有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類、碳水化合物、維生素以及微量元素等營(yíng)養(yǎng)素，還富含花青素、鞣花酸和紫檀芪等生物活性物質(zhì)，具有改善視力、預(yù)防心腦血管疾病、降血壓、 降血脂、消炎、預(yù)防和治療癌癥、改善大腦活力、強(qiáng)抗氧化性和自由基清除能力等作用，被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是抗氧化性最強(qiáng)的水果之一[1-3]。近幾年，隨著公眾對(duì)藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)保健功能的關(guān)注，藍(lán)莓產(chǎn)品的需求越來(lái)越大。

本文以現(xiàn)代生物活性物質(zhì)分離技術(shù)，提取、分離和制備藍(lán)莓籽醇提取物、多酚、多糖、粗蛋白等不同組分，并對(duì)不同組分進(jìn)行抗氧化活性比較，為藍(lán)莓籽的綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

藍(lán)莓籽：新鮮藍(lán)莓采自貴州省麻江縣藍(lán)莓果園，經(jīng)發(fā)酵釀酒后取果糟渣干燥粉碎，初篩后得到藍(lán)莓籽，再將藍(lán)莓籽粉碎過(guò)100目篩，于-20 ℃凍藏備用；DPPH、AAPH(日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，分析純)，亞油酸(SigmaAldrich公司，分析純)，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

HH—6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；HR2839攪拌機(jī)，珠海飛利浦家庭電器有限公司；WGT型數(shù)控超聲波清洗器，深圳市威固特超聲儀器有限公司；AF—610A原子熒光光譜儀，北京瑞利分析儀器有限公司；小分子透析袋，分裝，進(jìn)口。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1藍(lán)莓籽醇提取物、藍(lán)莓籽多酚、藍(lán)莓籽多糖的制備

稱取藍(lán)莓籽粉100 g，加入9倍體積60 %乙醇水浴浸提3 h，重復(fù)兩次；將醇溶性成分真空濃縮，其中一半干燥后得到藍(lán)莓籽醇提物；另一半用等體積乙酸乙酯提取，乙酸乙酯層濃縮后干燥得藍(lán)莓籽多酚，水層經(jīng)三氯乙酸脫蛋白，加入3倍體積95 %乙醇沉淀，沉淀溶解后透析，干燥得到藍(lán)莓籽多糖。

1.3.2藍(lán)莓籽蛋白的制備

稱取藍(lán)莓籽粉100 g，加入40 %乙醇浸提半小時(shí)，重復(fù)三次，過(guò)濾；殘?jiān)尤?.05M Tris—HCI緩沖液，常溫磁力攪拌16 h；過(guò)濾后溶液用HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5，然后加硫酸銨至50 %飽和度沉淀蛋白，再用0.05 M Tris—HCI緩沖液溶解沉淀，透析后得到藍(lán)莓籽粗蛋白。

1.3.3藍(lán)莓籽多酚、多糖、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

藍(lán)莓籽多酚含量用酒石酸鐵比色法(GB8313—87)測(cè)定。藍(lán)莓籽提取物中的多糖含量測(cè)定按照硫酸-苯酚法測(cè)定[4]，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)。藍(lán)莓籽提取物中的蛋白質(zhì)含量按照Lowry—Folin法測(cè)定[5]。

1.3.4藍(lán)莓籽不同組分抗氧化活性的測(cè)定

1.3.4.1AAPH法

參考文獻(xiàn)[6]，分別將提取的藍(lán)莓籽多酚、藍(lán)莓籽多糖、藍(lán)莓籽蛋白和醇提取物制成濃度為25 μg / ml的溶液。取1 ml待測(cè)樣品溶液于10 ml的具塞試管中，加入2 ml 2.51 %(W / V)的亞油酸無(wú)水乙醇溶液，4 ml 0.05 mol / L pH7.0的磷酸鹽緩沖液，2 ml蒸餾水，超聲波混勻。加入0.417 ml的0.1M AAPH，密閉后放在暗處并于37 ℃恒溫水浴鍋中保持200 min。按照硫氰酸鐵法(FTC法)測(cè)定氧化程度；取0.1 ml該混合溶液，加入9.7 ml 75 %乙醇和0.1 ml 30 %硫氰酸銨，再加入0.1 ml 0.02 mol / L溶解于3.5 %鹽酸中的氯化亞鐵，混勻。反應(yīng) 5 min后，在500 nm測(cè)定吸光度，再在 50 min、100 min 、200 min時(shí)各測(cè)定一次?？瞻撞患涌寡趸瘎?，相同濃度的α—VC(25 μg / ml)作為陽(yáng)性對(duì)照。所有結(jié)果均為試驗(yàn)三次的平均值。

1.3.4.2DPPH法

參考文獻(xiàn)[7]，DPPH用無(wú)水乙醇配成2×10-4M的溶液，置于4 ℃避光保存。藍(lán)莓籽醇提取物、藍(lán)莓籽多酚、藍(lán)莓籽多糖、藍(lán)莓籽蛋白和陽(yáng)性對(duì)照品均用無(wú)水乙醇配成1 mg / ml的原液。吸取供試原液各100 μL，并分別加入了2×10-4M DPPH的溶液100 μL，然后放入96孔板的各孔中，同時(shí)以不加DPPH(以100 μL無(wú)水乙醇代替DPPH)的供試品溶液濃度作為對(duì)照以消除供試品本身顏色對(duì)測(cè)試結(jié)果的干擾，并設(shè)DPPH陰性對(duì)照(以100 μL無(wú)水乙醇代替供試品)，每組平行設(shè)4個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入酶標(biāo)儀中，震蕩1 min，并于此條件下保存(室溫、避光)，30 min后測(cè)定其在517 nm處的吸光度OD值，按如下公式計(jì)算供試品的自由基清除率。以樣品濃度對(duì)清除率作圖，求出清除率50 %時(shí)所需樣品濃度，即為半清除濃度EC50。

自由基清除率=[ODDPPH· control—(ODsamp—le—ODsample control)]/ ODDPPH· control×100 %

其中：ODDPPH· control為DPPH陰性對(duì)照組OD值的平均值；

ODsample為樣品組OD值的平均值；

ODsample control為樣品乙醇對(duì)照組OD值的平均值。

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，平均值之間的差異顯著性采用SPSS 8.0的LSD檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，若P﹤0.05，則認(rèn)為差異顯著；圖表采用Excel2007制作。

2結(jié)果與分析

2.1藍(lán)莓籽醇提取物、藍(lán)莓籽多酚、藍(lán)莓籽多糖和藍(lán)莓籽蛋白含量測(cè)定結(jié)果

如表1所示，藍(lán)莓籽醇提取物中藍(lán)莓籽多酚、多糖、蛋白的含量分別為382.6±3.8 g / kg、187.1±26.5 g / kg、347.2±9.6 g / kg；按方法1.3.1提取藍(lán)莓籽多酚其多酚類物質(zhì)含量為843.6±9.8 g / kg，多糖、蛋白類物質(zhì)未檢出；按方法1.3.1提取的藍(lán)莓籽多糖其糖類物質(zhì)含量為403.3±6.1 g / kg，蛋白類物質(zhì)的含量為32.9±3.7 g / kg，蛋白類比重低于10 %，可忽略不計(jì)，多酚類物質(zhì)未檢出；按方法1.3.2提取的藍(lán)莓籽蛋白其蛋白類物質(zhì)含量為521.6±16.9 g / kg，多酚類、糖類物質(zhì)未檢出。

表1　藍(lán)莓籽醇提取物、藍(lán)莓籽多酚、藍(lán)莓籽

注： ND表示未檢測(cè)出。

2.2藍(lán)莓籽不同組分抗氧化活性

2.2.1AAPH法測(cè)定藍(lán)莓籽醇提取物、藍(lán)莓籽多酚、藍(lán)莓籽多糖、藍(lán)莓籽蛋白的抗氧化活性

AAPH法測(cè)定了藍(lán)莓籽醇提取物、藍(lán)莓籽多酚、藍(lán)莓籽多糖、藍(lán)莓籽蛋白對(duì)亞油酸過(guò)氧化反應(yīng)的抗氧化能力。如圖1所示，藍(lán)莓籽不同組分均有一定的抗氧化作用，在200 min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)各組分的抗氧化能力呈下降趨勢(shì)，其中藍(lán)莓籽多糖顯示出最高的抗氧化能力?？寡趸芰τ筛叩降偷捻樞?yàn)椋核{(lán)莓籽多糖﹥藍(lán)莓籽蛋白≈α—VC﹥醇提取物﹥藍(lán)莓籽多酚。

圖1　藍(lán)莓籽提取物AAPH法抗氧化能力曲線圖

2.2.2DPPH法測(cè)定藍(lán)莓籽醇提取物、藍(lán)莓籽多酚、藍(lán)莓籽多糖、藍(lán)莓籽蛋白的抗氧化活性

1)DPPH自由基廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)活性物質(zhì)清除自由基活性的試驗(yàn)中。藍(lán)莓籽藍(lán)莓籽醇提取物、藍(lán)莓籽多酚、藍(lán)莓籽多糖、藍(lán)莓籽蛋白都對(duì)DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)出劑量依賴性，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著活性物質(zhì)濃度的增加，清除率也相應(yīng)增加。

DPPH法測(cè)定了藍(lán)莓籽醇提取物、藍(lán)莓籽多酚、藍(lán)莓籽多糖、藍(lán)莓籽蛋白清除自由基活性。如圖2所示，顯示藍(lán)莓籽不同組分清除DPPH自由基的動(dòng)態(tài)變化曲線以及清除效果，表示藍(lán)莓籽不同組分均有一定的抗氧化能力。其清除自由基能力由高到低順序?yàn)椋核{(lán)莓籽多酚﹥醇提取物≈α—VC﹥藍(lán)莓籽蛋白﹥藍(lán)莓籽多糖。前5 min之內(nèi)，各組分清除能力最強(qiáng)，吸光值急劇下降，特別是藍(lán)莓籽多酚表現(xiàn)出比陽(yáng)性對(duì)照α—VC還要強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力。

圖2　藍(lán)莓籽提取物DPPH法抗氧化能力曲線圖

2)根據(jù)2.2.2測(cè)定結(jié)果，進(jìn)一步設(shè)計(jì)并配制五個(gè)不同濃度的樣品溶液，同時(shí)以天然抗氧化劑α—VC為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)濃度—效應(yīng)關(guān)系計(jì)算EC50值，如表2所示。

表2　藍(lán)莓籽提取物EC50值

3結(jié)論與討論

藍(lán)莓籽的構(gòu)成成分主要有藍(lán)莓籽多酚(主要是兒藍(lán)莓籽素類、黃酮類)、藍(lán)莓籽蛋白、藍(lán)莓籽多糖等。采用兩種方法對(duì)藍(lán)莓籽醇提取物、藍(lán)莓籽多酚、藍(lán)莓籽蛋白、藍(lán)莓籽多糖進(jìn)行抗氧化能力測(cè)定，其中AAPH法測(cè)定的抗氧化能力由高到低的順序?yàn)椋核{(lán)莓籽多糖﹥藍(lán)莓籽蛋白≈α—VC﹥醇提取物﹥藍(lán)莓籽多酚；DPPH法測(cè)定的清除自由基能力由高到低順序?yàn)椋核{(lán)莓籽多酚﹥醇提取物≈α—VC﹥藍(lán)莓籽蛋白﹥藍(lán)莓籽多糖。從測(cè)定結(jié)果可見(jiàn)，藍(lán)莓籽不同組分均有一定的抗氧化能力，其中藍(lán)莓籽多糖的抗氧化能力與對(duì)照相比有顯著性差異，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。同時(shí)，藍(lán)莓籽多酚清除自由基能力有顯著性差異，清除自由基能力較強(qiáng)。

屈小媛等[8]對(duì)藍(lán)莓籽油揮發(fā)性成分的GC—MS分析結(jié)果表明，其優(yōu)勢(shì)成分主要有姜黃烯、α—長(zhǎng)葉蒎烯、異石竹烯、異戊酸L—薄荷酯、亞麻醇、植物類谷甾醇、苯乙醇、L—抗壞血酸—2，6—二棕櫚酸酯、亞油酸乙酯、角鯊烯等活性成分，具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗衰老、降低膽固醇和血脂等作用。

本文通過(guò)抗氧化試驗(yàn)表明藍(lán)莓籽多糖和藍(lán)莓籽蛋白具有較強(qiáng)的抗氧化能力，藍(lán)莓籽多酚清除自由基能力顯著，藍(lán)莓籽具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值和前景。

參考文獻(xiàn)【REFERENCES】

[1]韓鵬祥，張蓓，馮敘橋，等.藍(lán)莓的營(yíng)養(yǎng)保健功能及其開(kāi)發(fā)利用[J].食品工業(yè)科技，2015，36(6)：370—379.

HAN P X，ZHANG B，F(xiàn)ENG X Q， et al.Nutritional and health functions of blueberry and its development and utilization[J].ScienceandTechnologyofFoodIndustry，2015， 36(6)：370—379.

[2]陳美珺，梁統(tǒng)，周克元.原花青素的抗炎作用及其作用機(jī)制探討[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，29(12)：1080—1082.

CHEN M J，LIANG T，ZHOU K Y.Study on the anti—inflammatory effect of proanthocyanidins and its mechanism[J].IntLabMed，2008，29(12)：1080—1087.

[3]Fernandes I，Marques F，F(xiàn)reitas V D，et al.Antioxidant and antiproliferative properties of methylated metabolites of anthocyanins[J].Food Chemistry，2013，141(3)：2923—2933.

[4]宋李桃，劉貴先，林洲，等.不同產(chǎn)地太子參多糖含量測(cè)定和對(duì)小鼠抗應(yīng)激作用研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014(3)25—27.

SONG L T，LIU G X，LIN Z，et al.Experimental study on anti—stress function and content determinationof radix pseudostellariae from different habitats[J].JournalofLiaoninguniversityofTCM，2014(3)25—27.

[5]Lowry O H，Rosebrough N J，F(xiàn)arr A L，Randall R J，et al.福林酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)[J].陳祥娥 編譯.食品與藥品，2011，13(3)：147—151.

Lowry O H，Rosebrouhg N J，F(xiàn)arr A L，Randall R J，et al.Protein measurement with folin’s phenol reagent.J.Bio.Chem.1951，193，265-275.

[6]Hu C，Kitts D D.Evaluation of antioxidant activity of epigallocatechin gallate in biphasic model systems in vitro[J].MolecularandCellularBiochemistry，2001，218(1)：147—155.

[7]Lin M Y，Chang F J.Antioxidative effect of intestinal bacteria bifidobacterium Longum ATCC 15708 and Lactobacillus Acidophilus ATCC 4356[J].DigestiveDiseasesandSciences，2000，45(8)：1617—1622.

[8]屈小媛，楊毓銀，謝小林，聶飛，吳世根，李永霞，賈強(qiáng).藍(lán)莓籽油揮發(fā)性成分的GC—MS分析[J].中國(guó)調(diào)味品，2014，39(6)：124—127.

QU X Y，YANG Y Y，XIE X L et al.Analysis of volatile constituents in blueberry seed oils by GC—MS[J].ChinaCondiment，39(6)：124—127.

投稿日期：2016-01-17；修回日期：2016-01-20

Comparison of antioxidant activities of different components in blueberry seeds

WANG Fang，KANG Chao，LI Yongxia，JIA Qiang，NIE Fei

(GuizhouInstituteofBiology，Guiyang550009，China)

Abstract：Objective：In order to strengthen the comprehensive utilization of blueberry seeds，the antioxidant capacities of different components in blueberry seeds were studied.The methods are：extract and separate alcohol extraction，polyphenols，protein and polysaccharide from blueberry seeds.And then，the antioxidant capacities of different components above were determined by AAPH and DPPH.The results are that the antioxidant capacities determined by AAPH from high to low order are：blueberry seed polysaccharide﹥blueberry seed protein≈α—VC﹥alcohol extraction﹥blueberry seed polyphenols.The antioxidant capacities determined by DPPH from high to low order were：blueberry seed polyphenols﹥alcohol extraction≈α—VC﹥blueberry seed protein﹥blueberry seed polysaccharide.The results show that different components in blueberry seeds occur in certain antioxidant capacities，blueberry seed polysaccharide and blueberry seed protein which has strongest antioxidant activities，and strongest activities in scavenging free radicals.

Keywords：blueberry seeds；blueberry seed polyphenols；blueberry seed polysaccharide；blueberry seed protein；antioxidant

中圖分類號(hào)：TS 207.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1003—6563(2016)02—0015—04

*基金項(xiàng)目：貴州省重大專項(xiàng)“山地藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用”(黔科合重大專項(xiàng)字[2015]6013號(hào))；貴州科學(xué)院2013年基金項(xiàng)目“藍(lán)莓貯藏期灰霉病拮抗菌株的篩選和生物學(xué)特性研究”。

作者簡(jiǎn)介：王芳(1983-)，女，碩士，助理研究員。研究方向：生物資源開(kāi)發(fā)利用。

通訊作者：▲聶飛(1965-)，男，碩士，研究員。研究方向：藍(lán)莓繁育與栽培技術(shù)研究。