郄亞微

(廣安職業(yè)技術(shù)學(xué)院建筑與城市規(guī)劃系，四川 廣安 638000)

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南方紅豆杉組織培養(yǎng)體系優(yōu)化

郄亞微

(廣安職業(yè)技術(shù)學(xué)院建筑與城市規(guī)劃系，四川 廣安 638000)

[摘要]為建立南方紅豆杉(Taxus chinensis)愈傷組織的高效誘導(dǎo)體系，提高紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)率和成活率，分別對(duì)南方紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基、外植體接種方法、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、pH進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果得出：最適宜的培養(yǎng)基為B5改良型、最佳接種方法為無葉莖段正插入培養(yǎng)基、添加2.0mg/L2，4-D或1.0mg/LNAA、pH控制在6左右，可以分別有效地提高紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)率和成活率。

[關(guān)鍵詞]南方紅豆杉(Taxus chinensis)；組織培養(yǎng)；愈傷組織；優(yōu)化

紅豆杉(Taxuschinensis)是一種珍稀的裸子植物，具有非常重要的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其富含的紫杉醇是有效的癌癥治療藥物，近年來隨著對(duì)紫杉醇的需求增加，傳統(tǒng)的種植方式提供的紫杉醇已經(jīng)無法滿足目前藥用的需要。如何采用科學(xué)的方法對(duì)紅豆杉組織進(jìn)行快速培養(yǎng)和大量生產(chǎn)，以大量獲得紫杉醇，滿足藥用需求，成為了目前醫(yī)療藥材生產(chǎn)中急需解決的問題[1]。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是指在無菌的條件下，將植物組織置于培養(yǎng)基內(nèi)，并將培養(yǎng)基放置到適宜的環(huán)境中進(jìn)行連續(xù)的培養(yǎng)得到新的組織[2]，這種技術(shù)非常適合大批量的生產(chǎn)和培育特定的植物組織和幼苗，被廣泛地應(yīng)用于生物、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等科技領(lǐng)域的相關(guān)研究中。早在20世紀(jì)中期美國(guó)就采用組織培養(yǎng)技術(shù)成功地取代了傳統(tǒng)的種植繁殖培育出了芹菜幼苗[3]，并且在后續(xù)研究中成功地應(yīng)用到多種植物的幼苗和組織培養(yǎng)中，給農(nóng)業(yè)育種帶來了革命性的變化[4]。到20世紀(jì)末，德國(guó)和日本就已經(jīng)利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物，這一技術(shù)后來被廣泛應(yīng)用于各種稀有植物類藥物的生產(chǎn)，極大地降低了稀有藥物的價(jià)格，有效地促進(jìn)了醫(yī)藥生物技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步[5]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)被應(yīng)用到紫杉醇大批量生產(chǎn)中，可有效地解決紫杉醇的藥用需求問題[6]。但是從目前來看，在采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行紅豆杉組織培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的過程中，由于培養(yǎng)基的問題，使得實(shí)際生產(chǎn)過程中紅豆杉的組織的成活率和誘導(dǎo)率往往較低，給紫杉醇產(chǎn)量的提升帶來了嚴(yán)重的阻礙[7]。

為此，本研究在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基體系基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，以建立南方紅豆杉愈傷組織高效誘導(dǎo)體系，提高紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)率和成活率，這對(duì)提高紫杉醇產(chǎn)量和質(zhì)量具有非常重要意義。

1材料與方法

1.1材料

本研究中各試驗(yàn)使用的外植體材料類型如表1所示。

表1　各試驗(yàn)中使用的外植體類型

1.2方法1.2.1不同類型培養(yǎng)基的誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)

選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的新生南方紅豆杉新生枝條和葉片組織，首先用中性洗滌劑去除其表面的灰塵，并用無菌蒸餾水清洗4～5次，用濾紙將其表面的水分吸干后再用75%的酒精對(duì)其進(jìn)行殺菌消毒處理，消毒時(shí)長(zhǎng)為1min，然后用0.1%的HgCl2對(duì)其進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間12min，再用無菌蒸餾水對(duì)其進(jìn)行清洗5～6次，將組織切成2～5cm的莖段和1.5～2cm的切片，將外植體接種到B5改良型、B5、SH、MS、WPM、WHITE6種培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境溫度為25℃，每組培養(yǎng)基接種100個(gè)莖段或者切片，在培養(yǎng)過程中按文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行觀察記錄。

1.2.2不同組織的接種方法的誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)

選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的南方紅豆杉的新生枝條和葉片組織，采用前述試驗(yàn)中的消毒處理方法進(jìn)行處理后，將新生枝條和葉片組織處理成1～1.5cm的組織切面，接種于含有B5改良型培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)的環(huán)境溫度為25℃。其中6種不同的接種方法如圖1所示，每種接種方法接種100個(gè)，在培養(yǎng)過程中記錄愈傷組織的誘導(dǎo)數(shù)和可繼代愈傷組織數(shù)，并對(duì)紅豆杉組織細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。

圖1　不同接種方法示意圖

1.2.3調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖影響試驗(yàn)

選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的紅豆杉枝條組織，采用前述試驗(yàn)相同的消毒處理方法對(duì)其進(jìn)行處理，切段接種于含有0.002mg/L TDZ、0.5mg/L 2，4-D、1.0mg/L 2，4-D、2.0mg/L 2，4-D、0.5mg/L NAA、1.0mg/L NAA、0.5mg/L KT、1.0mg/L KT的B5改良型培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行暗培養(yǎng)，環(huán)境溫度為25℃，記錄1個(gè)繼代周期的組織細(xì)胞增重、褐化率，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。

因?yàn)镻BL教學(xué)模式一般都是以小組的形式開展，所以，將學(xué)生進(jìn)行合理地小組劃分是最為關(guān)鍵的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。小組劃分應(yīng)該以激發(fā)學(xué)生的參與積極性和主動(dòng)性為基礎(chǔ)，促使學(xué)生主動(dòng)完成規(guī)定任務(wù)。教師則應(yīng)對(duì)學(xué)生的英語口語水平進(jìn)行綜合評(píng)判，并根據(jù)水平差異進(jìn)行小組劃分，防止整體實(shí)力過強(qiáng)或者過弱。這樣一來，才可以進(jìn)一步避免在討論的時(shí)候，出現(xiàn)強(qiáng)勢(shì)或弱勢(shì)極端群體。同時(shí)，教師還應(yīng)在小組中，指定一名同學(xué)作為組長(zhǎng)，負(fù)責(zé)小組成員的具體任務(wù)劃分，并對(duì)小組成員的活動(dòng)與討論參與性進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)督。這就需要小組組長(zhǎng)既具備良好的英語口語水平，又要具有一定的組織與管理能力。

1.2.4pH對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響試驗(yàn)

選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的南方紅豆杉新生枝條，采用前述試驗(yàn)中相同的消毒方法，將其切片接種于pH為7.5、7、6.5、6、5.5的B5改良型培養(yǎng)中進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)的環(huán)境溫度為25℃，每組培養(yǎng)基接種100個(gè)切片，培養(yǎng)30d時(shí)，記錄愈傷組織的誘導(dǎo)數(shù)和可繼代數(shù)。

1.3紅豆杉組織細(xì)胞的生理評(píng)價(jià)

根據(jù)前期的預(yù)試驗(yàn)的觀察和數(shù)據(jù)分析，本研究將南方紅豆杉愈傷組織的顏色進(jìn)行分級(jí)，分為5個(gè)顏色度，如圖2所示。

1.白綠色，細(xì)胞透明、呈現(xiàn)玻璃狀；2.白黃色，細(xì)胞較為透明；3.黃色，細(xì)胞不透明；4.深黃色，小部分褐化現(xiàn)象；5.土黃色，大部分褐化現(xiàn)象圖2　紅豆杉細(xì)胞顏色等級(jí)

對(duì)組織的細(xì)胞質(zhì)地按照如圖3所示的觀測(cè)到的組織細(xì)胞分布來進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.細(xì)胞松散，有水質(zhì)細(xì)胞粘連；2.細(xì)胞松散，細(xì)胞含水量較高，細(xì)胞不粘連；3.細(xì)胞均勻，蓬松，細(xì)胞呈沙粒狀聚集；4.細(xì)胞緊密，水份較低；5.細(xì)胞結(jié)塊，缺水圖3　紅豆杉細(xì)胞質(zhì)地等級(jí)

分析過程中采用如下計(jì)算公式對(duì)組織的可繼代愈傷組織率、褐化率和細(xì)胞鮮重進(jìn)行度量和計(jì)算，進(jìn)而通過這3個(gè)指標(biāo)參數(shù)來判斷細(xì)胞的生理指標(biāo)：

可繼代愈傷組織率=(可繼代細(xì)胞的質(zhì)量/誘導(dǎo)愈傷組織質(zhì)量)×100%

細(xì)胞鮮重=單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞增加的質(zhì)量(g)

2結(jié)果與分析

2.1不同類型培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2可以看出，在不同類型培養(yǎng)基的愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)中，誘導(dǎo)率從大到小分別為B5改良型、B5、SH、MS、WPM、WHITE，可繼代細(xì)胞大小由大到小分別為B5改良型、B5、MS、SH、WPM、WHITE，B5改良型的培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)周期最短，細(xì)胞質(zhì)地均勻，可繼代細(xì)胞數(shù)目最多，B5改良型培養(yǎng)基顯著優(yōu)于其他類型培養(yǎng)基，更適合紅豆杉組織的培養(yǎng)。

表2　不同類型培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織的試驗(yàn)結(jié)果

2.2不同組織的接種方法對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的影響

由表3可以看出：在6種接種方法中，方法1、2和3的誘導(dǎo)率和可接種率都達(dá)到了100%；從時(shí)間上看，方法3的愈傷出現(xiàn)時(shí)間最長(zhǎng)為11d，方法1的時(shí)間最短為8d，顏色和質(zhì)地都一致；但從污染率上看，方法3具有明顯的優(yōu)勢(shì)，只有1%的污染率。綜合考慮，采用方法3無葉莖段進(jìn)行接種可以有效地提高紅豆杉組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)率和可接種率，且污染率低，是最適合南方紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)的接種方法。

表3　不同組織接種方法誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)結(jié)果

2.3調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響

調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖影響試驗(yàn)得出的結(jié)果如表4所示。由表4可以看出，2,4-D、NAA的影響最為明顯，2，4-D、NAA濃度越高愈傷組織的誘導(dǎo)率越高，細(xì)胞的質(zhì)地也越好，愈傷組織的細(xì)胞可繼代率越高，因此，在構(gòu)建紅豆杉組織培養(yǎng)體系中可通過添加2.0mg/L 2，4-D或1.0mg/LNAA進(jìn)行調(diào)節(jié)，可以有效地改善細(xì)胞的質(zhì)地、誘導(dǎo)率和可繼代率。

表4　調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響試驗(yàn)結(jié)果

2.4pH對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響

由表5可以看出，在pH為6時(shí)南方紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)率和可繼代率都較高。因此，在構(gòu)建紅豆杉培養(yǎng)體系中，pH應(yīng)當(dāng)控制在6左右。

表5　pH對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響試驗(yàn)結(jié)果

3結(jié)語

紅豆杉作為提取紫杉醇藥物的一種重要的植物，采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，是目前實(shí)現(xiàn)大批量的生產(chǎn)紫杉醇藥物的最佳途徑，是醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)ψ仙即夹枨蟮谋Ｕ?。本研究通過不同類型培養(yǎng)基的愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)、不同組織的接種方法的誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)、調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖影響試驗(yàn)和不同pH對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響試驗(yàn)，篩選出了適宜南方紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)、組織細(xì)胞增殖的培養(yǎng)條件，從培養(yǎng)基的組成成分、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、pH和接種方法4個(gè)方面建立了南方紅豆杉愈傷組織高效誘導(dǎo)體系，可以有效地提高紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)率和成活率，對(duì)提高紫杉醇生產(chǎn)效率具有非常重要的意義。

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[收稿日期]2015-11-09

[基金項(xiàng)目]四川省教育廳科研項(xiàng)目(14ZB0390)。

[作者簡(jiǎn)介]郄亞微(1981-)，女，碩士，講師，現(xiàn)主要從事園林植物生物技術(shù)研究，snowy5568@sina.com。

[中圖分類號(hào)]Q813.1+2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2016)09-0042-04

[引著格式]郄亞微.南方紅豆杉組織培養(yǎng)體系優(yōu)化[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2016，13(9)：42～45,49.