楊秀芬，榮 俊，李國(guó)攀

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025；長(zhǎng)江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所，湖北荊州434025)

黃巧珍

(浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310000)

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豬繁殖與呼吸綜合征病毒M基因的原核表達(dá)

楊秀芬，榮 俊，李國(guó)攀

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025；長(zhǎng)江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所，湖北荊州434025)

黃巧珍

(浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310000)

[摘要]根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)M基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了PRRSV M基因的全長(zhǎng)片段和N-末端截短67個(gè)氨基酸序列的MNd67基因片段，分別將這些片段插入到表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)的多克隆位點(diǎn)上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，PCR、酶切及測(cè)序鑒定表明，成功構(gòu)建了2種重組表達(dá)質(zhì)粒(pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)后利用α-乳糖誘導(dǎo)其表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析表明，E.coli BL21(DE3)/ pET28a-PRRSV MNd67成功表達(dá)分子質(zhì)量為14ku的重組蛋白，而E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未見明顯的表達(dá)蛋白。試驗(yàn)結(jié)果表明已成功表達(dá)截短的PRRSV M蛋白，可為PRRSV診斷抗原和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]豬生殖與呼吸綜合征病毒；M蛋白；原核表達(dá)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，臨床表現(xiàn)主要以妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等繁殖障礙和仔豬呼吸困難為特征[1]。我國(guó)于1996年發(fā)現(xiàn)該病[2]，其后廣泛地流行于全國(guó)各地[3]，并成為我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)中主要疫病之一。2006年以來(lái)，我國(guó)出現(xiàn)和流行以Nsp2編碼區(qū)缺失30個(gè)氨基酸為分子特征的高致病性PRRSV，感染豬群出現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4,5]。

PRRSV是動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬、單股正鏈RNA病毒。其基因組全長(zhǎng)約15kb，含有9個(gè)開放閱讀框(ORFs)，ORF1a和ORF1b編碼蛋白聚合酶，ORF2～7 分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白[6]。其中M蛋白分子量為18～19ku，為III型跨膜蛋白，且是非糖基化蛋白，由1個(gè)3次連續(xù)的疏水性跨膜區(qū)、13～18個(gè)氨基酸的胞外區(qū)和81～87個(gè)氨基酸的胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成[7]。在PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中，M蛋白的氨基酸序列在歐洲型和美洲型毒株之間最為保守，氨基酸同源性為78%～81%[8]。豬在感染PRRSV約10d后，可檢測(cè)到針對(duì) M 蛋白的特異性抗體。感染細(xì)胞中的 M 蛋白與 GP5 在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成異源二聚體，這種結(jié)構(gòu)在病毒的組裝和釋放中起重要作用[9]。此外，M 蛋白內(nèi)部可以形成以二硫鍵結(jié)合的同型二聚體，這可能與病毒的感染力有關(guān)[10]。M 蛋白免疫原性較強(qiáng)，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，且是引起細(xì)胞免疫應(yīng)答最強(qiáng)的蛋白[11]。因此，M蛋白在PRRSV血清學(xué)診斷和疫苗開發(fā)領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)特異性PCR引物對(duì)M蛋白進(jìn)行全基因和截短表達(dá)的研究，使截短的M蛋白在大腸桿菌中獲得表達(dá)，以為PRRSV診斷和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1cDNA、質(zhì)粒和試劑

PRRSV cDNA、原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)由長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，pMD-18T 載體購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，E.coliDH5α、BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司，ExTaq DNA聚合酶、dNTPs、EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，Trans2K Plus DNA Marker 、ProteinRuler I購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司，小量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司，抗PRRSV陽(yáng)性血清由浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司質(zhì)量管理部提供，HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體購(gòu)自KPL公司，其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank收錄的PRRSV(AF046869)株M基因序列設(shè)計(jì)引物。引物序列見表1。其中5’-端下劃線部分是附加的酶切位點(diǎn)，上游引物為EcoRⅠ，下游引物為XhoⅠ。所有引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

表1　PRRSV M基因引物列表

1.2.2目的基因的PCR擴(kuò)增

以PRRSV cDNA為模板，使用上述引物PCR擴(kuò)增M全序列和MNd67片段。反應(yīng)條件均為：94℃5min；94℃45s，64℃45s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，并切膠回收并純化目的片段。

1.2.3重組表達(dá)載體的構(gòu)建

純化后的目的片段連接至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加有Amp的LB平板上培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，選取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒連同表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)分別用EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切，回收目的片段與載體片段，在T4DNA連接酶作用下16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加有Kan的平板上培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，選取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒并做雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送往上海生工公司測(cè)序，構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pET28a-PRRSV M及pET28a-PRRSV MNd67。

1.2.4目的基因的表達(dá)

將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)化菌分別命名為E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSV M和E.coliBL21(DE3)/ pET28a-PRRSV MNd67。挑取單個(gè)菌落接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～12h，進(jìn)行菌落PCR鑒定。將鑒定為陽(yáng)性的菌株按1%轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)D600nm值為0.8～1.0時(shí)，加入0.6mol/L α-乳糖至終濃度為30mmol/L，誘導(dǎo)5～6h, 離心收集菌體。

1.2.5表達(dá)蛋白的SDS-PAGE鑒定與Western blot分析

用0.02mol/L pH7.4 PBS重懸菌體并用超聲波破碎，分別收集破碎后的全菌液、上清液及沉淀。取破碎后的全菌液和上清液分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行Western blot分析，以1∶100稀釋的抗PRRSV陽(yáng)性血清為一抗，1∶8000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體為二抗，用DAB溶液顯色并觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1目的基因片段的擴(kuò)增

M：Trans2K Plus DNA Marker；1～2：PRRSVMNd67；3～4：PRRSV M全基因圖1　目的基因的擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)在525bp和324bp處有特異性DNA擴(kuò)增條帶(圖1)，與理論擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度相符。

2.2重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67分別經(jīng)EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，分別顯示2條帶且與載體和目的片段的大小相符(圖2)。DNA測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的序列一致，顯示基因序列無(wú)堿基的插入與缺失，表明已正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67。

2.3SDS-PAGE與Western blot分析結(jié)果

含有各重組表達(dá)載體的陽(yáng)性菌經(jīng)α-乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未見明顯的蛋白表達(dá)帶，E.coliBL21(DE3)/ pET28a-PRRSV MNd67在分子量大小為14ku處可見明顯表達(dá)帶，與預(yù)期大小相符，表達(dá)蛋白少量可溶(圖3)。表達(dá)產(chǎn)物Western blot檢測(cè)，未出現(xiàn)明顯雜交條帶。

M:Trans2KPlusDNAMarker;1:pET28a-PRRSVMNd67雙酶切質(zhì)粒;2:pET28a-PRRSVMNd67原始質(zhì)粒;3:pET28a-PRRSVM雙酶切質(zhì)粒;4:pET28a-PRRSVM原始質(zhì)粒圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果1:E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSVM全菌液;2:pET28a空白菌表達(dá)上清液;3:E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSVMNd67全菌液;4:E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSVMNd67上清液;M:ProteinRulerI圖3 PRRSVM蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析

3討論

膜蛋白的表達(dá)一直是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用的難點(diǎn)，許多膜蛋白由于疏水性氨基酸含量較高，表達(dá)出來(lái)的蛋白錨定在細(xì)胞膜上，從而對(duì)膜造成破壞導(dǎo)致細(xì)胞裂解，影響表達(dá)量。M蛋白為III型跨膜蛋白，是PRRSV囊膜基質(zhì)蛋白，其N端含有3個(gè)疏水性比較高的跨膜區(qū)域，給其原核表達(dá)帶來(lái)不便。從國(guó)內(nèi)外的報(bào)道來(lái)看，已有多種表達(dá)系統(tǒng)用于表達(dá)重組M蛋白，均未獲得理想結(jié)果。有報(bào)道稱對(duì)ORF6基因進(jìn)行改造，去除N端疏水區(qū)域后理論上對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的抗原性不會(huì)產(chǎn)生太大影響，并且有利于M蛋白的表達(dá)量的提高。已有的研究成果以及在線跨膜區(qū)預(yù)測(cè)軟件和抗原表位預(yù)測(cè)軟件顯示M蛋白N端的3個(gè)疏水性跨膜區(qū)位于氨基酸序列前100位，幾乎所有抗原表位都位于氨基酸序列后100位[12]。戚亭等[13]去除了M蛋白N端疏水性較強(qiáng)的區(qū)域，表達(dá)了長(zhǎng)約290bp PRRSV M融合蛋白，該蛋白仍然能夠與抗PRRSV豬陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。鄧靜等[14]去除全部的編碼疏水性跨膜區(qū)的核苷酸序列，對(duì)M蛋白從第104個(gè)氨基酸序列到C-端第4個(gè)氨基酸序列擴(kuò)增，截短后的M基因獲得了表達(dá)，且表達(dá)的M蛋白部分可溶、部分為包涵體，Western blot檢測(cè)有明顯雜交帶。

本研究同時(shí)表達(dá)PRRSVM全蛋白和N-端截短67個(gè)氨基酸的PRRSV M蛋白。結(jié)果表明，全長(zhǎng)的M蛋白誘導(dǎo)后未見明顯表達(dá)，N端截短67個(gè)氨基酸的M蛋白誘導(dǎo)后表達(dá)了分子質(zhì)量約為14ku的重組蛋白，且SDS-PAGE檢測(cè)顯示該重組M蛋白部分可溶，這與鄧靜等的[14]研究結(jié)果相符。但是截短表達(dá)的M蛋白Western blot檢測(cè)未見明顯雜交帶，可能解釋的原因一是Western blot使用的一抗血清為PRRSV 多克隆抗血清，未經(jīng)純化，效價(jià)較低；二是M蛋白主要引起機(jī)體的細(xì)胞免疫，而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體的量有限，Western blot不易檢出，這些都有待后續(xù)進(jìn)一步研究。綜上所述，本研究成功表達(dá)了截短的PRRSV M 蛋白，為PRRSV診斷抗原和疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2016-03-03

[作者簡(jiǎn)介]楊秀芬(1988-)，女，碩士生，研究方向?yàn)榛蚬こ桃呙?。通信作者：榮俊，496281344@qq.com。

[中圖分類號(hào)]Q786

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2016)09-0046-04

[引著格式]楊秀芬，榮俊，李國(guó)攀,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒M基因的原核表達(dá)[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2016，13(9)：46～49.