PCR儀溫度校準的研究

曾穎

【摘 要】本文針對用于DNA擴增的PCR儀其試樣環(huán)境溫度的測量裝置及測溫位置進行研究，提出使用薄膜鉑電阻對PCR儀進行快速準確測溫，并在實驗數(shù)據(jù)的對比分析后證明將測溫敏感點放置在試管的液體中的位置最滿足DNA實驗需要。

【關(guān)鍵詞】PCR儀；溫度；測溫位置；薄膜鉑電阻

0 引言

PCR技術(shù)是一項在短時間內(nèi)體外大量擴增特定的DNA片段的分子生物學技術(shù)[1]，PCR儀的工作原理在于為DNA實驗制造不同的溫度環(huán)境，使DNA變性、退火、引物鏈延伸，其實質(zhì)為一臺精密溫度控制儀。其溫度的準確性和穩(wěn)定性、波動性直接影響DNA反應3個階段過程中基因片段的擴增質(zhì)量。但是目前國內(nèi)PCR儀器的校準規(guī)程里并未對溫度校準裝置的響應速度及溫度測量位置進行詳細闡述，為此本文針對PCR儀試樣環(huán)境溫度的測量裝置及測溫位置進行探討。

1 PCR儀簡介

1.1 PCR儀簡介

目前市面上PCR儀的主流方向為半導體式PCR，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示：在快速導熱金屬質(zhì)地的基座上設有多個試管孔，并由下方的半導體片進行加熱制冷控溫。

圖1 半導體式PCR儀內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 PCR儀校準用溫度傳感器

PCR儀使用的基座按孔數(shù)分有48孔、60孔、96孔，按孔的大小也分為0.2ml、0.5ml等。根據(jù)PCR儀的特殊結(jié)構(gòu)，若采用一般鉑電阻的形狀及大小無法與基座完全接觸，且粗大的鉑電阻數(shù)據(jù)線使得在校準過程中帶閉蓋結(jié)構(gòu)的PCR儀頂蓋無法閉合，加強了空氣對流，破壞了基座溫度場分布，影響校準結(jié)果。

目前市面上主流的國外PCR溫度檢測裝置其測量傳感器使用固定測點間距及探頭大小的檢測系統(tǒng)，其普適性低，不適用于檢測對象具有多樣性的計量檢測機構(gòu)。此外，以DRIFTCON的PCR實時檢測系統(tǒng)為例，其溫度探頭（如圖2所示）雖能和基座試管孔完美貼合，但尺寸較大直接影響其熱容值，導致熱響應速度減慢，不能滿足快速檢測的需求，在校準PCR儀升降溫速率時偏差較大。

（1） （2）

圖2 BIOplastics的溫度傳感器圖

2 溫度測量

2.1 標準器裝置

1）溫度采集

利用本院自主研發(fā)的Vtest-1101溫濕度試驗設備自動檢定系統(tǒng)的18CH溫度數(shù)據(jù)采集器（如圖3所示），對溫度數(shù)據(jù)進行自動快速采集。

圖3 溫度數(shù)據(jù)采集器圖

2）薄膜鉑電阻

為了滿足溫度測量快速響應且準確可靠的測量需求，本文采用厚1mm、熱觸點面積1mm2的薄膜鉑電阻Pt100，其具有熱容小、熱反應時間短、在（-40～200）℃范圍內(nèi)線性準確測溫的特點，并能較好伸入PCR儀試管孔中，而不影響其基座的溫度場。為了防止薄膜鉑電阻遇水靜電等一系列干擾，將其表面及引線涂上有較高的機械強度且防水耐油的漆包線漆，進而提高和穩(wěn)定鉑電阻引線的性能，其實物圖如圖4所示。

圖4 薄膜鉑電阻實物圖

2.2 溫度測量方法

1）溫度測量方法1

為了讓薄膜鉑電阻更好的與試管孔壁面貼合，在試管孔內(nèi)壁涂上一層具有高導熱率的導熱硅脂，并將薄膜鉑電阻深入試管與基座之間，利用試管往下的力使薄膜鉑電阻熱觸點面貼緊孔壁，最后連接采集器及上位機進行孔壁溫度的測量。薄膜鉑電阻測點放置位置如圖5所示。

圖5 方法1鉑電阻測溫位置示意圖

2）溫度測量方法2

為了防止液體在試驗溫度內(nèi)沸騰時產(chǎn)生氣泡，并附著溫度傳感器進而帶來測量誤差。在試管內(nèi)加入2/3試管容積高傳熱效率、高沸點的導熱油，然后將薄膜鉑電阻伸入1/2液體深度，最后將其連接采集器及上位機進行試管中液體溫度的測量。薄膜鉑電阻測點放置位置如圖6所示。

圖6 方法2鉑電阻測溫位置示意圖

PCR儀的溫度偏差、均勻度、波動度分別表征試管孔的實際溫度的差值、各試管實驗結(jié)果的一致性及實驗成功率。為了對比兩種測量方法，分別對Applied Biosysterms 9700型號的一臺PCR儀進行試驗測試，設定儀器溫度95.0℃恒溫。并取圖7中5個位置的試管孔進行測溫，待溫度示值穩(wěn)定后進行溫度數(shù)值采樣，并對其溫度偏差、均勻度、波動度進行分析，兩種測量方法試驗數(shù)據(jù)如下：

圖7 96試管孔測溫點

a）溫度測量方法1（表1）：（℃）

表1

從以上數(shù)據(jù)分析可以看出基板整個空間自左而右側(cè)溫度呈現(xiàn)由高到低的梯度，溫度偏差△Td：+0.20℃，溫度均勻度△Tu：0.47℃，溫度波動度△Tv：±0.15℃。

b）溫度測量方法2（表2）：（℃）

表2

同樣從以上數(shù)據(jù)分析可以看出，溫度偏差△Td：-0.76℃，溫度均勻度△Tu：0.54℃，溫度波動度△Tv：±0.02℃。

對比兩種PCR儀測溫的方法，兩種方法所測結(jié)果中方法2的溫度偏差較小，并略小于顯示溫度；方法2的波動度也小于方法1，均勻性兩種方法相差不多。方法1實測溫度實質(zhì)為儀器基板孔壁溫度，而方法2實測溫度為試管內(nèi)DNA實驗時的液體環(huán)境溫度。在進行PCR試驗時，基座溫度通過試管壁傳遞到其試管內(nèi)液體，在穩(wěn)定散熱情況下自基座底部到試管形成一定梯度的溫度場，因此方法1所測溫度略高于方法2所測溫度，且方法2的所測位置的溫度波動更小，其所測位置實際溫度的測量也更滿足DNA實驗需要。

3 總結(jié)

根據(jù)PCR溫度計量檢測準確性和升溫速率檢測快速響應的需要，本文提出使用薄膜鉑電阻對PCR進行溫度檢測；并通過提出兩種測溫傳感器放置的位置進行溫度檢測試驗，通過試驗數(shù)據(jù)分析比較其溫度偏差、波動度、均勻度說明將測溫敏感點放置在試管的液體中的位置最滿足DNA實驗需要。

【參考文獻】

[1]莫曉山，陳憲.PCR分析儀器關(guān)鍵技術(shù)及其相關(guān)標準制定初探[J].中國計量， 2009：74-76.

[2]張麗萍.基因擴增儀PCR儀溫度校準裝置的研究[D].天津：天津大學，2012.

[責任編輯：楊玉潔]