賀容+張生珍+王超+刁正鵬+薛紅梅+徐立青+李增魁

摘要：為進一步研究外膜蛋白Omp25的結構和功能，以羊種布氏桿菌3型青海省海晏縣自然株為研究對象，通過基因的克隆測序，采用生物信息學方法對外膜蛋白Omp25基因及其編碼的氨基酸序列的理化性質(zhì)、分子結構、分子表面可能性、柔韌性、親水性、抗原指數(shù)、B細胞抗原表位進行了詳細分析。結果顯示：羊種布氏桿菌3型Omp25分子一級結構的氨基酸序列的各項參數(shù)存在5段共同區(qū)段，其中59～74、93～112、182～202位氨基酸的各項生物信息學參數(shù)尤為突出，是其B細胞表位優(yōu)勢區(qū)的可能性很大。

關鍵詞：羊種布氏桿菌3型；Omp25基因；序列測定；生物信息學分析

中圖分類號：S855.99

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0025-03

羊布氏桿菌病是由布氏桿菌（Brucella）引起的一種人畜共患傳染病，該病在全球范圍內(nèi)流行[1]，臨床特征為慢性疲勞、波浪熱、生殖系統(tǒng)損壞及全身性疾病[2]。青海省是人、畜見布氏桿菌病的高發(fā)區(qū)，1954年青海省首次分離出布氏桿菌，到2000年省內(nèi)布氏桿菌病得到有效控制，并且達到國家頒布的布氏桿菌病“控制區(qū)”標準[3]，但是2006年該病疫情呈回升狀態(tài)[4]。雖然目前針對該病的疫苗已經(jīng)存在，但是由于疫苗使用不當造成布氏桿菌感染家畜或人的事件時有發(fā)生[5]，可見其保護率、安全性均很低。

布氏桿菌外膜蛋白（outer membrane proteins）Omp25/Omp31家族免疫原性強，可誘導免疫動物產(chǎn)生高滴度特異性抗體，純化蛋白可用于布魯菌病的診斷[6]。由于布氏桿菌的外膜蛋白（OMPs）暴露于S菌的表面，不僅能與IgG抗體發(fā)生反應，而且還可以引起保護性免疫反應，一直被作為研究的重點[7]。本研究采用羊種布氏桿菌3型青海省海晏縣自然野毒株，對其外膜蛋白Omp25基因進行克隆，用生物信息學方法對Omp25基因及其蛋白結構進行了分析和預測，避免試驗的盲目性，為大量制備重組Omp25蛋白及其免疫原性及布氏桿菌多表位疫苗的設計奠定了基礎，還可通過試驗進一步對比驗證其生物學活性，也為布氏桿菌病的診斷、用藥及疫苗研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

羊種布氏桿菌3型23號[8]由青海省地方病預防控制所徐立青老師惠贈。

1.2 細菌的培養(yǎng)及基因組DNA的提取

將布氏桿菌23號劃線于肝浸液固體培養(yǎng)基，生長24 h。挑單個菌落置于肝浸液液體培養(yǎng)基，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，取3 mL菌液置于2個1.5 mL無菌離心管中，80 ℃ 水浴30 min，將滅活菌液按照細菌DNA提取試劑盒說明操作，分裝后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物合成

參考GenBank基因編碼區(qū)序列，結合克隆載體pMD19-T的閱讀框，應用Primer 5.0設計羊布氏桿菌Omp25基因PCR引物，預計其擴增目的片段長度為640 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體信息見表1。

1.4 Omp25基因的PCR擴增

PCR反應體系為25 μL，其中模板1 μL，濃度為 10 μmol/L 的上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，2×Taq PCR Master Mix（含染料） 12.5 μL。擴增條件：95 ℃預變性 5 min；94 ℃45 s，55 ℃ 50 s，72 ℃1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應完畢后，取10 μL反應液在1%瓊脂糖凝膠中電泳，檢查擴增結果。

1.5 Omp25基因克隆載體的構建

Omp25基因PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后與pMD19-T載體于16 ℃連接3 h，連接體系為：0.5 μL pMD19-T載體，2 μL Omp25基因PCR產(chǎn)物，2.5 μL SolutionⅠ。取5 μL連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化100 μL的DH5α感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于含異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、X-gal的LB氨芐青霉素（Amp，100 μg/mL）固體培養(yǎng)基上；次日挑白色菌落，接種于3 mL含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)14 h，按照質(zhì)粒小量提抽試劑盒說明提取質(zhì)粒；用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，挑取陽性克隆，送上海華大基因科技有限公司測序。陽性克隆命名為 pMD19-T-Omp25。

1.6 Omp25基因抗原表位預測

綜合利用DNAman、ProtParam、DANStar、SOPMA、SWISS-MODEL、BepiPred 生物學軟件系統(tǒng)對Omp25分子的立體結構、分子的親水性、表面可能性、柔韌性及免疫學特性進行分析。

2 結果與分析

2.1 Omp25基因擴增結果及克隆后雙酶切鑒定結果

Omp25基因擴增片段及克隆后雙酶切鑒定結果均與預計長度相符，詳見圖1。

2.2 Omp25基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白氨基酸序列

經(jīng)測序顯示，Omp25基因核苷酸序列長為640 bp，共編碼213個氨基酸，詳見圖2。

2.3 Omp25蛋白分子抗原表位預測結果

利用生物學軟件DNAstar、ExPASy服務器的ProtParam分析羊Ⅲ型布氏桿菌外膜蛋白Omp25分子的理化性質(zhì)，詳見表2。

通過NPS@IBCP服務器的SOPMA預測Omp25的二級結構，詳見圖3。可見其α-螺旋占24.88%，β-轉(zhuǎn)角占 13.15%，無規(guī)卷曲占37.07%，延伸鏈占24.88%，總體來看該蛋白的卷曲程度較高，因此成為B細胞表位可能性大。