鄧志勇+曲芬霞+陳春嵐+陳兵兵+陳興田+吳桂容

摘要：分別通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken中心組合試驗(yàn)來優(yōu)化雞血藤懸浮細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件。響應(yīng)面法分析指出最佳工藝條件為蔗糖39.3 g/L，水解酪蛋白3.95 g/L，培養(yǎng)溫度22.7 ℃。在此優(yōu)選工藝下，雞血藤懸浮細(xì)胞干質(zhì)量和總異黃酮含量平均值分別為11.65 g/L和5.34 mg/L。總異黃酮含量與預(yù)測值5.41 mg/L相差比例僅為2.65%，說明該模型準(zhǔn)確有效。響應(yīng)面法優(yōu)化大幅度地提高了雞血藤懸浮細(xì)胞產(chǎn)異黃酮含量，為雞血藤異黃酮的深入開發(fā)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞血藤；懸浮細(xì)胞；異黃酮；Box-Behnken中心組合試驗(yàn)；響應(yīng)面

中圖分類號：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0050-03

雞血藤是豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）的干燥藤莖，主產(chǎn)廣西，廣東、云南也有分布。雞血藤是補(bǔ)血、活血的傳統(tǒng)大宗中藥材，具有促進(jìn)造血功能、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜催眠等藥理作用[1]。此外，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)雞血藤具有廣譜的抗腫瘤和抗病毒活性[2-3]。藥理學(xué)研究表明，雞血藤藥理作用的關(guān)鍵活性成分是異黃酮類化合物，主要包括大豆黃酮、染料木素、刺芒柄花素和美皂異黃酮這4種主要的異黃酮活性成分[1，4]。中藥材植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)可以生產(chǎn)異黃酮，如懷槐[5]、野葛[6]、大豆[7]等，但目前尚未有關(guān)于雞血藤懸浮細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的報(bào)道。近年來，雞血藤野生資源面臨枯竭，供需矛盾尖銳，因此開展懸浮細(xì)胞產(chǎn)雞血藤活性成分的研究具有重要意義。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化雞血藤懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基成分，提高異黃酮活性成分的產(chǎn)量，為對雞血藤藥效的深入開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為雞血藤愈傷組織，取自雞血藤嫩葉部位，通過添加1.0 mg/L 6-BA（6-芐基氨基嘌呤）、0.5 mg/L NAA（α-萘乙酸）、30 g/L蔗糖、0.1 g/L 維生素C以MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織[8]。愈傷組織在（25±1） ℃、暗環(huán)境下培養(yǎng)，每15 d繼代1次。愈傷組織經(jīng)過傳代篩選獲得淺黃色、疏松顆粒狀的愈傷組織培養(yǎng)系，準(zhǔn)備接種。

1.2 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件

將上述愈傷組織（約為5 g鮮質(zhì)量/瓶）接入液體MS培養(yǎng)基，其中添加0.5 mg/L NAA、1.0 mg/L 6-BA、30 g/L蔗糖、0.1 g/L、3 g/L水解酪蛋白。細(xì)胞置于含100 mL培養(yǎng)基的300 mL 三角燒瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，于（25±1） ℃暗環(huán)境下以 100 r/min 的速度搖瓶懸浮培養(yǎng)12 d，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，在初始培養(yǎng)基（碳源：蔗糖30 g/L；氮源：水解酪蛋白3 g/L；培養(yǎng)溫度 25 ℃）的基礎(chǔ)上分別對碳源種類和濃度、氮源濃度和培養(yǎng)溫度進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)依次進(jìn)行，后續(xù)試驗(yàn)均應(yīng)用前面試驗(yàn)得出的最優(yōu)結(jié)果。

碳源：使用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖及可溶性淀粉作為單獨(dú)碳源，維持起始濃度均為30 g/L，考察不同來源碳源對發(fā)酵后細(xì)胞干質(zhì)量及總異黃酮合成量的影響。在此基礎(chǔ)上采用蔗糖為基礎(chǔ)碳源，測試10、20、30、40、50、60 g/L起始條件下對發(fā)酵后干細(xì)胞總質(zhì)量與總異黃酮合成量的影響。

氮源：調(diào)節(jié)MS培養(yǎng)基中的水解酪蛋白濃度分別為0.5、1、2、3、4、5 g/L，經(jīng)過12 d封瓶批次發(fā)酵后測量總細(xì)胞干質(zhì)量以及總異黃酮的合成量。

培養(yǎng)溫度：分別采用10、15、20、25、30、35 ℃條件培養(yǎng)雞血藤懸浮細(xì)胞，考察最終發(fā)酵細(xì)胞總干質(zhì)量及總異黃酮的合成量變化。

1.3.2 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對蔗糖、水解酪蛋白、培養(yǎng)溫度進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.4 細(xì)胞生長和異黃酮含量測定

發(fā)酵12 d后，收集雞血藤細(xì)胞培養(yǎng)物，60 ℃下干燥至恒質(zhì)量，細(xì)胞生物量為1 L培養(yǎng)基收獲的細(xì)胞干質(zhì)量（g/L）。將細(xì)胞充分研磨后于95%乙醇冷浸24 h，超聲波處理 30 min，過濾。提取3次，合并濾液，40 ℃下減壓濃縮，100 mL乙酸乙酯 ∶水（體積比5 ∶1）混合溶液萃取3次。而細(xì)胞過濾發(fā)酵液經(jīng)低溫冷凍濃縮后直接通過乙酸乙酯萃取抽提。

合并乙酸乙酯抽提液，于40 ℃下減壓蒸餾。甲醇溶解定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后HPLC定量分析。色譜條件：Agilent1100高效液相色譜儀，色譜柱：Purospher Star C18柱（4.6 mm i.d.×250 mm，5 μm），流動相為甲醇 ∶水 ∶乙酸（體積比10 ∶10 ∶1）溶液，柱溫25 ℃，進(jìn)樣體積20 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長260 nm。以外標(biāo)法計(jì)算異黃酮含量，單體標(biāo)準(zhǔn)品分別是大豆黃酮、染料木素、刺芒柄花素和美皂異黃酮（購自Sigma公司，純度為98%）?？偖慄S酮含量為細(xì)胞內(nèi)及發(fā)酵液上清中異黃酮含量之和，以1 L培養(yǎng)液內(nèi)4種異黃酮的總量表示（mg/L）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示（n=3）。使用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析和多重比較分析（LSD），使用Design Expert 8.0.6 進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)溫度對雞血藤懸浮細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響見圖1。碳源和氮源是培養(yǎng)基的主要成分，也是產(chǎn)物產(chǎn)量最重要的限制因子[9]。在4種碳源（濃度均為30 g/L）中，蔗糖最有利于雞血藤懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞干質(zhì)量和總異黃酮含量均顯著高于其他碳源（P<0.05），優(yōu)選蔗糖作為碳源（圖1-A）。在蔗糖濃度的單因素試驗(yàn)中，隨著蔗糖濃度的增加，雞血藤懸浮細(xì)胞細(xì)胞干質(zhì)量和總異黃酮含量也隨之增加，在蔗糖濃度40 g/L時(shí)達(dá)到最高值，分別為（10.97±0.75） g/L和 （495±0.42） mg/L，繼續(xù)增加蔗糖濃度細(xì)胞干質(zhì)量和總異黃酮含量不再增加（圖1-B）。因此，選擇40 g/L 蔗糖作為雞血藤懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的碳源。

在氮源的單因素試驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)與蔗糖濃度類似的趨勢。水解酪蛋白（氮源）的濃度為4 g/L時(shí)，雞血藤懸浮細(xì)胞干質(zhì)量和總異黃酮含量均達(dá)到最大，分別為（9.75±0.68） g/L和 5.05±0.45 mg/L，因此選擇4 g/L水解酪蛋白作為雞血藤懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的氮源（圖1-C）。

此外，在植物細(xì)胞的培養(yǎng)中，培養(yǎng)溫度是重要的條件限定因子[10]。隨著培養(yǎng)溫度的升高，雞血藤懸浮細(xì)胞干質(zhì)量和總異黃酮含量增加（圖1-D）。當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)細(xì)胞干質(zhì)量最高（11.95±0.78） g/L，溫度為25 ℃時(shí)總異黃酮含量最高 （5.05±0.45） mg/L，而溫度繼續(xù)上升總異黃酮含量大幅下降。綜合考慮細(xì)胞干質(zhì)量與總異黃酮含量，選擇培養(yǎng)溫度為25 ℃以獲得最大的異黃酮產(chǎn)量。

2.2 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以總異黃酮含量（Y）為量化指標(biāo)，選取蔗糖（A）、水解酪蛋白（B）、培養(yǎng)溫度（C）進(jìn)行Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，中心組合因素水平見表1。Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果見表2。

對響應(yīng)值進(jìn)行多元二次回歸擬合分析，得到以下回歸預(yù)測模型：總異黃酮含量Y=5.09+0.08A+0.11B-0.19C+0.12AB+0.30AC+0.29BC-0.25A2-1.21B2+0.032C2。對回歸模型擬合度及其顯著性進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。其中回歸方程P<0.001，達(dá)到極顯著水平。模型的確定系數(shù)為 0.970 3，經(jīng)調(diào)整后為0.936 8，表明僅有7%的總異黃酮含量變異不能用該模型擬合，而擬合方程殘差圖基本為一條直線，說明此回歸模型能極好地對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合。

2.3 響應(yīng)面圖分析

響應(yīng)面圖分析可以直觀地顯示優(yōu)化區(qū)域以及各因素對產(chǎn)量的影響[10]，根據(jù)回歸方程得到的響應(yīng)面圖見圖2。比較3個(gè)響應(yīng)面圖可知，培養(yǎng)基碳源和氮源交互效應(yīng)對總異黃酮含量的影響較大，表現(xiàn)為交叉響應(yīng)面圖中曲面較陡峭；培養(yǎng)溫度和碳源交互效應(yīng)影響較小，表現(xiàn)為交叉響應(yīng)面圖中曲面較平滑；培養(yǎng)溫度和碳源的交互效應(yīng)居中。此結(jié)果與回歸方程得

到的結(jié)果是一致的，3個(gè)因素的F值大小依次為水解酪蛋白（B）>培養(yǎng)溫度（C）>蔗糖（A）?？梢姡囵B(yǎng)基中最主要限制因子的是氮源（酪蛋白）的含量，而培養(yǎng)溫度對雞血藤細(xì)胞干質(zhì)量和總異黃酮含量也有較大影響。

2.4 最佳工藝條件預(yù)測和試驗(yàn)驗(yàn)證

通過上述回歸模型求偏導(dǎo)，得出培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)溫度的最佳工藝條件為蔗糖39.3 g/L，水解酪蛋白3.95 g/L，培養(yǎng)溫度22.7 ℃。在此工藝條件下培養(yǎng)5批，雞血藤懸浮細(xì)胞干質(zhì)量和總異黃酮含量平均值分別為11.65 g/L和5.34 mg/L?？偖慄S酮含量與預(yù)測值5.41 mg/L相差比例僅為2.65%，說明該模型準(zhǔn)確有效，能反映試驗(yàn)實(shí)際情況。

3 結(jié)論與討論

分別通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken中心組合試驗(yàn)來優(yōu)化雞血藤懸浮細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件。單因素試驗(yàn)結(jié)果指出碳源優(yōu)選為蔗糖，培養(yǎng)基配方為蔗糖 40 g/L，水解酪蛋白4 g/L，培養(yǎng)溫度25 ℃。進(jìn)一步進(jìn)行 Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)，結(jié)果指出最佳工藝條件為蔗糖 39.3 g/L，水解酪蛋白3.95 g/L，培養(yǎng)溫度22.7 ℃。驗(yàn)證試驗(yàn)中，此優(yōu)選工藝下雞血藤懸浮細(xì)胞干質(zhì)量和總異黃酮含量平均值分別為11.65 g/L和5.34 mg/L?？偖慄S酮含量與預(yù)測值5.41 mg/L相差比例僅為2.65%，說明該模型準(zhǔn)確有效，能反映實(shí)際試驗(yàn)情況。響應(yīng)面法優(yōu)化后，雞血藤懸浮細(xì)胞產(chǎn)異黃酮比初始培養(yǎng)條件提高了12.31%。響應(yīng)面法優(yōu)化大幅度提高了雞血藤懸浮細(xì)胞產(chǎn)異黃酮含量，為雞血藤異黃酮的深入開發(fā)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]符 影，程 悅，陳建萍，等. 雞血藤化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2011，42（6）：1229-1234.

[2]程 悅，符 影，王志宇，等. 雞血藤提取物中縮合鞣質(zhì)的含量測定及其抗腫瘤活性初步研究[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，50（2）：75-80.

[3]曾凡力，程 悅，陳建萍，等. 雞血藤醇提物體外抗病毒活性研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2011，22（1）：16-20.

[4]丁 平，仰鐵錘，林振坤，等. 雞血藤化學(xué)成分的指紋圖譜研究[J]. 華西藥學(xué)雜志，2010，25（4）：461-463.

[5]羅建平，曹 磊，潘利華，等. 稀土元素對懷槐懸浮培養(yǎng)細(xì)胞異黃酮合成及氧化還原態(tài)的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2008，14

（3）：362-365.

[6]方從兵，李賀勤，宛曉春，等. 不同理化因子對野葛懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長及異黃酮合成的影響[J]. 中國中藥雜志，2006，31（19）：1580-1583.

[7]梁曉芳，朱學(xué)藝，李紅芳. 前體和誘導(dǎo)子對大豆懸浮細(xì)胞中異黃酮積累的影響[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，48（1）：113-118.

[8]吳桂容，陳春嵐，曲芬霞，等. 雞血藤嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基的篩選[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009，37（18）：93-94.

[9]張 堅(jiān)，高文遠(yuǎn)，王 娟. 杠柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中蔗糖濃度與氮源的考察[J]. 中國藥學(xué)雜志，2011，46（2）：98-101.

[10]Sugiyama M. Historical review of research on plant cell dedifferentiation[J]. Journal of Plant Research，2015，128（3）：349-359.

[11]張安寧，劉連成. 響應(yīng)面法優(yōu)化香菇液體發(fā)酵條件[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（3）：200-203.姜上川，梅 超，王小芳，等. PPR蛋白APPR6參與ABA調(diào)控?cái)M南芥種子萌發(fā)與幼苗生長[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：53-57.