外源Ca2+對金線蘭抗氧化酶活性及其同工酶的影響

薛興華+司慶永+龔寧

摘要：以金線蘭組培苗為材料，采用分光光度法和同工酶電泳技術(shù)研究了外源Ca2+對金線蘭抗氧化酶活性及其同工酶的影響。結(jié)果表明：不同濃度的Ca2+處理能夠使金線蘭SOD、CAT、POD、APX活性呈現(xiàn)一定的升降變化，其中SOD酶活呈“M”形的變化趨勢，CAT酶活呈先升后降的趨勢，APX酶活在較高濃度的Ca2+處理下較其他酶慢，POD變化范圍較大；同工酶分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度的Ca2+處理，在一定時(shí)間范圍內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生新的POD和APX酶帶表達(dá)，而不誘導(dǎo)新的SOD和CAT酶帶的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：金線蘭；Ca2+；抗氧化酶；同工酶

中圖分類號： S682.310.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0229-04

金線蘭（Anoectochilus roxburghii （Wall.）Lindl），蘭科開唇蘭屬的一種多年生草本植物，具有極高的藥用價(jià)值，且株型小巧，葉型優(yōu)美，葉脈金黃色，呈網(wǎng)狀排列，是一種觀賞價(jià)值極高珍品，具有廣闊的開發(fā)利用前景。但由于金線蘭的自身抗性較差，對環(huán)境要求極高，以至于其資源的開發(fā)利用受到限制。Ca2+不僅是植物必需的營養(yǎng)元素，同時(shí)也是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要的第二信使，與植物的抗氧化酶系統(tǒng)密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)相關(guān)抗氧化酶活性提高植物對逆境的適應(yīng)能力[1-2]。關(guān)于金線蘭的報(bào)道多集中在組培和脅迫相關(guān)的生理響應(yīng)機(jī)制研究[3-7]，而作為重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，Ca2+對金線蘭抗氧化酶活性及同工酶影響的研究未見報(bào)道。因此本試驗(yàn)對金線蘭組培苗進(jìn)行不同濃度的Ca2+處理，測定SOD、POD、APX、CAT的活性，同時(shí)對同工酶進(jìn)行研究，探討信號物質(zhì)Ca2+對抗氧化酶的活性及同工酶的影響，為Ca2+與抗氧化酶系統(tǒng)關(guān)系研究提供一定基礎(chǔ)，為金線蘭抗逆機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料的培養(yǎng)

試驗(yàn)材料金線蘭組培苗由貴州師范大學(xué)金線蘭課題組提供。將處于增殖期且生長時(shí)間一致的金線蘭組培苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60 d后，選取長勢一致的生根組培苗，備用。培養(yǎng)條件：光照12 h/d，光照度2 000 lx，溫度（21±2） ℃。

1.2 材料的處理

取已經(jīng)生根的金線蘭組培苗，分別在添加0.5、1.5、2.5 mmol/L CaCl2的MS培養(yǎng)液中處理6、12、24、48、72 h，對照（CK）為MS培養(yǎng)液處理。

1.3 測定方法

1.3.1 粗酶液的制備 參照王愛國等的方法[8]制備粗酶液：金線蘭成熟鮮葉去掉主脈，準(zhǔn)確稱取1 g，加入5 mL預(yù)冷的酶提取緩沖液，冰浴充分研磨，于低溫離心機(jī)12 000 r/min 離心20 min，上清液即粗酶液，冷藏備用。

1.3.2 酶活測定 SOD活性測定：參考王愛國等的方法[8]稍作修改，先加入150 μL粗酶液，然后依次加入2.7 mL 14.5 mmol/L 的L-甲硫氨酸，0.1 mL 3 mmol/L EDTA，0.1 mL 2.25 mmol/L NBT和0.1 mL 60 μmol/L 核黃素?；靹蚝蟮谷氡壬?，在3 000 lx下光照10 min，反應(yīng)后立即避光，將反應(yīng)液顛倒幾次混勻后立即測D560 nm值，以不加粗酶液而加酶提取液為最大光還原管，以PBS液代替NBT作為空白，以能抑制NBT光化還原50%為1個(gè)酶活力單位U，酶活力按下式計(jì)算，單位為：U/g。

計(jì)算公式：

反應(yīng)抑制率 =（對照D560 nm-對照空白D560 nm）-（樣品D560 nm-樣品空白D560 nm）（對照D560 nm-對照空白D560 nm）×100%；

酶活力（U/g）=反應(yīng)抑制率50%×3 mL反應(yīng)混合液中加入的樣量。

POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[9]。3 mL反應(yīng)混合液（500 mL 50 mmol/L PBS pH值7.8+0.28 mL愈創(chuàng)木酚+0.19 mL 30%H2O2）中加入50 μL酶液，迅速搖勻立即測D470 nm，每30 s讀數(shù)1次，以1 min D470 nm升高0.1的D值為1個(gè)酶活力單位U，單位為U/（min·g）。

APX活性測定參照Dalton等的方法[10]，略作改進(jìn)。3 mL反應(yīng)混合液（50 mmol/L PBS pH值7.0+0.1 mmol/L EDTA-Na2+0.5 mmol/LAsA，10 mmol/L H2O2）加入100 μL粗酶液啟動反應(yīng)，連續(xù)記錄D290 nm，10 s 讀數(shù)1次，以1 min D290 nm降低0.1的D值為1個(gè)酶活力單位U，單位為U/（min·g）。

CAT活性測定參照程魯京等的鉬酸銨顯色法[11]，略作改進(jìn)。所有藥品在室溫下恒溫，然后在空白管（B2）加 1 mL 65 μmol/L H2O2基質(zhì)液，空白管（B3）中加入1 mL 60 mmol/L PBS緩沖液（pH值為7.4），空白管（B1）中加1 mL 65 μmol/L H2O2 基質(zhì)液，樣品管（U）中加0.2 mL粗酶液和 1 mL 65 μmol/L H2O2基質(zhì)液，37 ℃水浴保溫1 min后加入 1 mL 32.4 mmol/L 鉬酸銨溶液，混勻后在B2管和B3管分別加入0.2 mL 60 mmol/L 鈉-鉀磷酸鹽緩沖液（pH值7.4）；在B1管加入0.2 mL粗酶液。5 min后于405 nm處以蒸餾水調(diào)零比色，記錄吸光度（D）。酶活力以清除H2O2 的mg數(shù)表示，按下式計(jì)算，單位為mg/（min·g）。

酶活力[mg/（min·g）]=DB1-DUDB2-DB3×65×1×340.2×0.2×1 000。

1.3.3 同工酶分析 分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為 2.5%，pH值為8.3的Tris-Gly電極緩沖液。上樣量為40 μL。電泳開始時(shí)，電流設(shè)為10 mA，當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，調(diào)電流至15 mA。電泳時(shí)間視酶分子量而定，一般至指示劑距凝膠前沿1 cm為停止時(shí)間。

1.3.3.1 加樣 濃縮膠聚合完成后，緩慢拔出樣品梳，注入預(yù)冷已稀釋10倍的電極緩沖液。用微量進(jìn)樣器吸取40 μL處理后的酶液（10 μL酶液、20 μL 40%的蔗糖溶液、10 μL 2%的溴酚藍(lán)指示劑），依次加入加樣槽中。

1.3.3.2 酶活性染色 SOD活性染色：參照文獻(xiàn)[12]的方法，略作改進(jìn)。電泳結(jié)束后，將膠浸泡于染色液 2.45 mmol/L NBT中，避光浸泡20 min，并不時(shí)搖動，蒸餾水漂洗，再放入0.036 mol/L（pH值 7.8）磷酸緩沖液（含0.028 mol/L TMEDA，28 μmol/L 核黃素），避光浸泡15 min，并不時(shí)搖動，蒸餾水漂洗，放入0.05 mol/L PBS（含0.1 mmol/L Na2-EDTA）（pH值7.8），4 × 8 W日光燈下照光20～30 min，直至出現(xiàn)無色譜帶，蒸餾水漂洗2～3次，拍照。

POD活性染色：參照Rahnamal等的方法[13]，稍作改動。染色液：0.1 g聯(lián)苯胺、5 mL無水乙醇、10 mL 1.5 mol/L 乙酸鈉、10 mL 1.5 mmol/L乙酸、75 mL的蒸餾水溶解并過濾待用。膠片用蒸餾水沖洗3次后，在染液中加入0.14 mL 30%H2O2，迅速搖勻后將膠片放入，待酶帶完全出現(xiàn)后（約20 min），用自來水沖洗2～3次，拍照。

APX活性染色：采用抗壞血酸——聯(lián)苯胺染色法。染色液成分為：AsA 70.4 mg、聯(lián)苯胺溶液（2 g聯(lián)苯胺溶于18 mL溫?zé)岜姿嶂?，再加入蒸餾水72 mL）20 mL、1.2%H2O2溶液20 mL、蒸餾水60 mL。蒸餾水潤洗膠片2次，再加入40～50 mL 的染色液，直到清晰的APX帶顯現(xiàn)為止，將染色液倒掉，并用自來水沖洗幾次，照相。

CAT活性染色：參照Woodbury等的方法[14]，電泳結(jié)束后，用蒸餾水清洗膠片，0.05%H2O2溶液浸泡20 min后用蒸餾水沖洗幾次，再加入染色液（含有0.5%的氯化鐵，0.5%的鐵氰化鉀），直到顯帶為止，照相，整個(gè)過程注意避光。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Ca2+對金線蘭抗氧化酶活性的影響

2.1.1 Ca2+對金線蘭SOD活性的影響 3種濃度的Ca2+處理對金線蘭SOD酶活性的影響見圖1，可以看出SOD酶活性呈現(xiàn)“M”形的變化趨勢，即先升高后降低再升高，最后趨于穩(wěn)定。其中，1.5 mmol/L 和2.5 mmol/L Ca2+ 處理下SOD酶活性都在24 h達(dá)到最大值，而0.5 mmol/L Ca2+處理下在48 h時(shí)達(dá)到最高值。由此可知，外源鈣處理能提高SOD酶活性。

2.1.2 Ca2+對金線蘭POD活性的影響 3種濃度的Ca2+處理下金線蘭POD酶活性的變化情況見圖2，0.5 mmol/L和 1.5 mmol/L Ca2+處理下，POD酶活性變化呈現(xiàn)先升高后下降再升高的趨勢，在2.5 mmol/L Ca2+處理下，呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，可能是高濃度的Ca2+ 抑制了POD活性，一段時(shí)間適應(yīng)后出現(xiàn)上升的變化?？芍珻a2+處理對POD酶活性影響較為明顯。

2.1.3 Ca2+對金線蘭APX活性的影響 3種濃度的Ca2+處理下金線蘭APX酶活性變化情況見圖3，可以看出 0.5 mmol/L Ca2+處理下APX酶活性呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢，變化不明顯；1.5 mmol/L 和2.5 mmol/L Ca2+ 處理下，在12 h內(nèi)APX酶活性變化不明顯，而處理時(shí)間在24～72 h 時(shí)，變化較顯著，呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，可能是金線蘭APX需要一定時(shí)間來適應(yīng)較高濃度Ca2+ 的變化并作出相應(yīng)的生理響應(yīng)。

2.1.4 Ca2+對金線蘭CAT活性的影響 3種濃度Ca2+處理下金線蘭CAT酶活性變化情況見圖4，0.5 mmol/L和 1.5 mmol/L Ca2+處理下CAT酶活性先升高后下降最后趨于穩(wěn)定，且活性不同程度高于對照，2.5 mmol/L Ca2+ 處理下，在12 h內(nèi)CAT酶活性變化較小，12 h以后變化較顯著，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。說明在適宜的濃度范圍內(nèi)，Ca2+處理能有效提高CAT酶活性。

綜上所述，SOD、POD酶活性都產(chǎn)生了較大的升降變化，且隨著處理時(shí)間的延長趨于穩(wěn)定，說明植物對外界的影響有一個(gè)紊亂調(diào)整過程；APX酶活性，在較高濃度的Ca2+處理下響應(yīng)較其他酶慢；CAT活性不同程度高于對照，適當(dāng)Ca2+處理能夠明顯提高金線蘭CAT的活性且維持較高活性。其中1.5 mmol/L和2.5 mmol/L Ca2+ 處理對酶活的影響較大，0.5 mmol/L Ca2+ 處理的作用較小，其中1.5 mmol/L Ca2+ 處理24 h時(shí)金線蘭抗氧化酶活性達(dá)到最高值，2.5 mmol/L Ca2+ 處理48 h次之。

2.2 外源Ca2+對金線蘭抗氧化酶同工酶的影響

2.2.1 Ca2+對金線蘭SOD同工酶譜的影響 金線蘭經(jīng)過3種濃度的 Ca2+處理后，組培苗SOD同工酶分析結(jié)果見圖5，隨著處理濃度和時(shí)間不同，酶帶呈現(xiàn)一定的強(qiáng)弱差異，但各處

理和對照相比，都是共有5條帶，處理后并未產(chǎn)生新的酶帶，即沒有SOD同工酶產(chǎn)生。

2.2.2 Ca2+對金線蘭POD同工酶譜的影響 金線蘭經(jīng)過3種濃度的 Ca2+處理后，組培苗POD同工酶分析結(jié)果見圖6，處理濃度和時(shí)間的不同，酶帶呈現(xiàn)一定的強(qiáng)弱差異。其中，0.5 mmol/L Ca2+處理12 h和48 h時(shí)有新的酶帶產(chǎn)生，12 h時(shí)出現(xiàn)1條Rf為0.137的酶帶，48 h時(shí)出現(xiàn)2條Rf分別為0.137 和0.199的酶帶；1.5 mmol/L 和2.5 mmol/L Ca2+ 處理后并未產(chǎn)生新的酶帶，沒有POD同工酶產(chǎn)生。

2.2.3 Ca2+對金線蘭APX同工酶譜的影響 金線蘭經(jīng)過3種濃度的 Ca2+處理后，組培苗APX同工酶分析結(jié)果見圖7，處理濃度和時(shí)間不同，酶帶呈現(xiàn)一定的強(qiáng)弱差異。其中 0.5 mmol/L Ca2+處理12 h時(shí)有1條Rf為0.156的酶帶產(chǎn)生，1.5 mmol/L和2.5 mmol/L Ca2+ 處理48 h時(shí)有1條Rf為0.156的酶帶產(chǎn)生。

2.2.4 Ca2+對金線蘭CAT同工酶譜的影響 金線蘭經(jīng)過3種濃度的 Ca2+處理后，組培苗CAT同工酶分析結(jié)果見圖8，處理濃度和時(shí)間的不同，酶帶呈現(xiàn)一定的強(qiáng)弱差異，但CAT同工酶帶始終只有2條，各處理與對照的條帶基本一致，即Ca2+處理對金線蘭的CAT同工酶的表達(dá)沒有明顯影響。

3 討論

關(guān)于植物抗性機(jī)理的研究已有大量報(bào)道，但由于金線蘭分布范圍較窄，人們多關(guān)注于金線蘭的藥效、組培、人工栽培等的研究[15-17]，對于其抗性研究較少。本試驗(yàn)就Ca2+對金線蘭抗氧化酶活性及同工酶的影響進(jìn)行研究，探討信號物質(zhì)Ca2+對金線蘭抗氧化酶的活性及表達(dá)的影響。

Ca2+作為第二信使，在植物的信號傳遞中起重要作用。關(guān)于植物逆境脅迫下鈣信使和抗氧化酶系統(tǒng)關(guān)聯(lián)的研究報(bào)道有很多[18-22]，表明外源鈣處理對植株SOD、CAT、POD、APX酶活都有一個(gè)紊亂調(diào)整過程，有助于緩解脅迫的危害，這與本試驗(yàn)結(jié)果類似。

低濃度 Ca2+處理時(shí)，POD同工酶有新增酶帶，高濃度時(shí)沒有新增酶帶，但谷俊濤等、翁笑艷等的研究結(jié)果表明Ca2+濃度越大，POD同工酶組分越復(fù)雜[1-2]，本試驗(yàn)結(jié)果與之有差異；同工酶電泳發(fā)現(xiàn)不同濃度 Ca2+處理下未產(chǎn)生新SOD同工酶和CAT同工酶，這與王長義等的研究結(jié)果[23]不同，可能不同植物對Ca2+的響應(yīng)和調(diào)節(jié)能力存在差異，這有待進(jìn)一步探討。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，外源Ca2+可以影響金線蘭抗氧化酶活性，對APX和POD的同工酶表達(dá)有調(diào)控作用，參與了金線蘭消除體內(nèi)自由基的過程，推測Ca2+能夠使金線蘭某些特定抗氧化酶同工酶表達(dá)，從而能夠激活相應(yīng)保護(hù)機(jī)制，減少和緩解逆境對自身的傷害。

結(jié)合抗氧化酶活性與同工酶譜的分析，可以推測低濃度的Ca2+短時(shí)間（6 h）處理對同工酶的誘導(dǎo)作用較為明顯，而較高濃度的Ca2+（1.5～2.5 mmol/L）長時(shí)間（24～48 h）處理對酶活性變化作用較大。此外同工酶的產(chǎn)生與酶活性變化沒有明顯的相關(guān)性，Ca2+不只是通過誘導(dǎo)新同工酶產(chǎn)生調(diào)節(jié)酶的活性，同時(shí)可能存在其他調(diào)節(jié)途徑。

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