微波輔助蛋白質水解-反相高效液相色譜法測定羅非魚皮中的羥脯氨酸

趙　艷,宋　軍,楊發(fā)樹,張艷紅,張鳳枰,劉耀敏,范秀麗

(通威股份有限公司水產畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農業(yè)部重點實驗室,成都　610041)

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微波輔助蛋白質水解-反相高效液相色譜法測定羅非魚皮中的羥脯氨酸

趙艷,宋軍,楊發(fā)樹,張艷紅,張鳳枰,劉耀敏,范秀麗

(通威股份有限公司水產畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農業(yè)部重點實驗室,成都610041)

摘要：為測定羅非魚(Oreochromis niloticus)皮中羥脯氨酸含量，建立了微波輔助蛋白質水解-反相高效液相色譜法。實驗采用9-芴基甲氧基羰酰氯(FMOC-Cl)為衍生試劑，應用ZORBAX SB-C18色譜柱，以0.05 mol/L的醋酸鈉溶液和甲醇為流動相進行梯度洗脫，DAD檢測器在262 nm處進行檢測，外標法定量。結果顯示，羥脯氨酸線性關系良好，相關系數為0.999 9，回收率92.00%～103.25%，相對標準偏差2.53%～3.61%，檢出限為0.2 mg/g。

關鍵詞：微波輔助蛋白質水解；反相高效液相色譜法；羅非魚皮；羥脯氨酸

羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)是膠原蛋白的主要組成成分，不屬于20種常見的氨基酸。目前，常見的三種膠原蛋白是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中Ⅰ型膠原蛋白是動物皮的主要成分之一，它含有大量的脯氨酸和羥脯氨酸(HYP)。羥脯氨酸約占膠原蛋白中氨基酸總量的10%，而在其它蛋白質中含量甚微，這使得它幾乎成為膠原蛋白所特有的成分，因而可通過測定羥脯氨酸含量來計算膠原蛋白的含量，從而確定膠原蛋白的總體水平[1]。

目前，測定羥脯氨酸的方法有多種，包括分光光度法[2-3]、毛細管電泳法[4-5]、離子色譜法[6]、高效液相色譜法[7-9]和高效液相色譜串聯質譜法[10-12]等，其中以高效液相色譜法最為常用。羥脯氨酸通常以蛋白質的形式存在于樣品中，首先需要進行水解，解離為游離態(tài)羥脯氨酸后才能測定。目前通常用常規(guī)酸水解法[13]。然而常規(guī)酸水解方法耗時，步驟繁瑣，且水解過程不易控制。而采用微波輔助蛋白質水解樣品，避免以上麻煩，并且易于控制酸水解條件，重現性好。目前利用微波輔助蛋白質水解前處理方法，采用高效液相色譜儀測定羥脯氨酸的系統(tǒng)研究，在國內尚未見報道。本實驗采用微波輔助蛋白水解結合反相高效液相色譜法對羅非魚皮中的羥脯氨酸的測定進行了研究。

1材料與方法

1.1儀器、試劑和材料

實驗用羅非魚魚皮從市場購買。

Agilent 1260 高效液相色譜儀，G4212B DAD檢測器 美國Agilent公司；ETHOS 1微波水解儀 意大利Milestone公司；Allegra 64 R離心機 BECKMAN COULTER公司；KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CP225D 電子分析天平 德國Sartorius公司。

L-羥脯氨酸(L-HYP，純度99%)標準品、 9-芴基甲氧基羰酰氯(FMOC-Cl) Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇(色譜純) 美國Fisher公司；乙酸鈉、硼酸(均為分析純) 國藥集團化學試劑公司；其它試劑均為優(yōu)級純；水為Milli-Q Gradient超純水。

1.2標準溶液和衍生溶液的配制

準確稱取50 mg羥脯氨酸(99%)，用0.1 mol/L的HCI溶液定容至100 mL容量瓶，配成質量濃度為0.5 mg/mL標準品儲備液，可根據需要稀釋成系列標準溶液。

0.05 mol/L FMOC衍生試劑配制：稱取0.13 g FMOC，用丙酮溶解，并定容至10 mL。

0.2 mol/L硼酸緩沖液(pH 9.0)：用NaOH調節(jié)pH值。

1.3HPLC分析條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱，150 mm×4.6 mm,5 μm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測器：DAD檢測器，波長為262 nm；進樣體積：20 μL。流動相A：甲醇，流動相B：0.05 mol/L的醋酸鈉溶液；梯度洗脫條件見表1。

表1　梯度洗脫條件

1.4供試樣品溶液的制備

1.4.1樣品水解

1.4.1.1常規(guī)酸水解法

參照文獻[13]水解方法進行樣品前處理。所有樣品重復3次測定，結果取平均值。

1.4.1.2微波輔助蛋白質水解法

將樣品解凍、絞碎，準確稱取樣品50 mg(精確至0.01 mg)于微波水解石英杯中，加入6 mol/L HCL溶液0.5 mL，依次放置于水解槽中，水解主控罐內加入6 mol/L HCI溶液120～150 mL，蓋好水解罐。將水解罐放入密封裝置中，擰緊，插入溫度傳感器，抽真空，充入高純氮氣以保護樣品，重復3 次。在1 000 W 功率條件，常溫至160 ℃升溫20 min，160 ℃溫度保持20 min，當溫度冷卻至室溫后打開密封裝置，取出水解槽，將微波水解瓶逐一取下后，將水解液全部轉移至50 mL容量瓶中，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調至中性，超純水定容至50 mL。

1.4.2衍生

取過濾后的稀釋液100 μL于5 mL 具塞離心管中，依次加入硼酸緩沖液900 μL，FMOC衍生試劑300 μL，漩渦混勻，衍生10 min，0.22 μm濾膜過濾，待高效液相色譜儀測定。

2結果與分析

2.1樣品前處理條件的選擇

2.1.1微波輔助蛋白質水解條件的優(yōu)化

固定微波時間20 min，考察不同微波水解溫度(140 、150、160 、170 ℃)的影響(圖1)，以及固定微波溫度，考察不同微波水解溫度保持時間(10、20、30 min)對實驗結果的影響(圖2)，最終選擇160 ℃溫度保持20 min為最佳條件。

2.1.2微波水解法與常規(guī)水解法的比較

采用微波法水解測定樣品中羥脯氨酸含量的同時，運用傳統(tǒng)的常規(guī)酸水解法110 ℃水解22 h進行測定，并將測得的結果用T檢驗法進行了比較，結果見表2。結果表明，兩種水解方法測定結果的相對偏差均小于3.0%，經T檢驗，微波水解法與常規(guī)水解法測定結果不存在顯著差異(P>0.05)，在所選擇的條件下微波輔助蛋白質水解測定結果與常規(guī)法一致。

圖1　不同微波水解溫度的HYP含量變化曲線

圖2　不同微波水解時間的HYP含量變化曲線

2.1.3衍生試劑的選擇

氨基酸分析中常用的柱前衍生試劑有鄰苯二甲醛(OPA)、丹磺酰氯(DANSYL-C1)、異硫氰酸苯酯(PITC) 和9-芴基甲氧基羰酰氯 (FMOC-Cl)等。OPA只能與一級胺反應，DANSYL-C1與PITC雖能與羥脯氨酸直接反應，但前者反應活性較差，速度慢，后者需專門的衍生裝置在無水條件下進行。魚皮的水解產物中存在很多種氨基酸，大部分為一級胺，因此國內外有不少文獻采用雙衍生劑的方法，即先用OPA封閉所有的一級胺，除去OPA與一級胺衍生物后，再用FMOC-Cl與羥脯氨酸反應，方法復雜、費時。本試驗采用FMOC-Cl直接衍生羅非魚魚皮水解液，通過優(yōu)化液相色譜分離條件即可分離出羥脯氨酸，并排除了其它干擾峰。

表2　兩種水解方法羥脯氨酸含量的比較(n=3)

2.2高效液相色譜分析條件的選擇

采用Agilent 1260 高效液相色譜儀，比較ZOBAX XDB C18柱和ZOBAX SB-C18柱對羥脯氨酸的分離效果，發(fā)現ZOBAX XDB C18柱出峰時間靠前，且峰形較差，而使用ZOBAX SB-C18柱取得了良好的分離效果，標準品分離效果見圖3和圖4。

圖3　ZOBAX XDB C18色譜柱分離圖

2.3線性關系及檢出限的考察

將羥脯氨酸配制成1，2，5，10，25，50 μg/mL的系列標準溶液。按照上述色譜條件進樣，以HYP濃度為橫坐標(x) ，對應的峰面積為縱坐標(y) ，繪制標準曲線，見圖5?；貧w方程：y=106.312 9x+2.919 8，相關系數為0.999 9，表明在1～50 μg/mL 范圍內線性關系良好。以3倍信噪比計算檢出限，本方法檢出限為0.2 mg/g。

圖4　ZORBAX SB-C18色譜柱的分離圖

圖5　HYP峰面積與標液濃度標準曲線

2.4方法的精密度和回收率試驗

為考察方法的精密度和可靠性，在樣品中分別添加3個濃度水平的標準溶液，每水平3個平行樣，按照1.4樣品溶液制備方法進行處理，用1.3儀器條件進行測定，回收率結果見表2。結果顯示，羥脯氨酸的回收率92.0%～103.0%，相對標準偏差2.53%～3.61%，符合試驗要求。

表3　羥脯氨酸的回收率和測定的相對標準偏差(n=3)

2.5羅非魚皮中羥脯氨酸的測定

按照1.4樣品溶液制備方法進行處理，對羅非魚皮中的羥脯氨酸進行了提取，按照1.3儀器條件進行測定，得到羥脯氨酸的HPLC 圖譜，見圖6。

圖6　羅非魚魚皮中羥脯氨酸的色譜圖

3討論

3.1微波輔助蛋白質水解的優(yōu)勢

對比微波水解法和常規(guī)水解方法，兩種水解方法測定結果的相對偏差均小于3.0%，經T檢驗，微波水解法與常規(guī)水解法測定結果不存在顯著差異(P>0.05)。而且微波水解時間約為常規(guī)水解方法的1/10，大大縮短了分析時間，提高了檢測效率。

3.2衍生試劑及液相色譜條件的選擇

羅非魚皮中存在很多氨基酸及其代謝物，大部分為一級胺，可以和OPA迅速發(fā)生反應，而HYP具有二級胺結構，不能直接與OPA反應，但可與異硫氰酸苯酯(PITC)或FMOC反應并形成穩(wěn)定的衍生物。有些研究用OPA與一級胺衍生物，再用FMOC衍生羥脯氨酸進行分離。此法雖選擇性好但樣品處理費時，不適合處理大批量樣品。本試驗采用FMOC-Cl直接衍生羅非魚魚皮水解液，并選用適合分離極性化合物的ZOBAX SB-C18色譜柱，通過優(yōu)化液相色譜分離條件即可分離出羥脯氨酸，并排除了其它干擾峰。

利用微波輔助蛋白質水解-反相高效液相色譜法測定羅非魚皮中的羥脯氨酸，方法簡便快速、重現性好、分離效果良好、靈敏度高、檢測結果可信度高，可以滿足魚皮中羥脯氨酸的檢測需要。

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(責任編輯：鄧薇)

Determination of hydroxyproline in the skin of Oreochromis niloticus by reversed-phase high performance liquid chromatography after microwave-assisted acid hydrolysis of protein

ZHAO Yan,SONG Jun,YANG Fa-shu,ZHANG Yan-hong,ZHANG Feng-ping,LIU Yao-min,FAN Xiu-li

(KeyLaboratoryofAquatic,Livestock,PoultryNutritionandHealthyCulturing,MinistryofAgriculture,TongweiCo.,Ltd.,Chengdu610041,China)

Abstract：A method was established for the determination of hydroxyproline in the skin of tilapia(Oreochromis niloticus)by reversed-phase high performance liquid chromatography after microwave-assisted acid hydrolysis of protein.After derivatization by 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl),separation and quantification was achieved on a ZORBAX SB-C18column by gradient elution with methanol and 0.05 mol/L sodium acetate buffer.The detection was carried out with diode array detector (DAD)by absorbance at 262 nm.The external standard calibration curves were used for quantification.There were good linear correlations for hydroxyproline (r=0.999 9).Average spike recovery of hydroxyproline was 92.00%～103.25%,with relative standard devitations 2.53%～3.61%,and the limit of detection for hydroxyproline was 0.2 mg/g.This method is simple,sensitive,reproducible and suitable for the determination of hydroxyproline in fish skin.

Key words：microwave-assisted acid hydrolysis of protein;reversed-phase high performance liquid chromatography;skin of Oreochromis niloticus;hydroxyproline

收稿日期：2015-06-02；

修訂日期：2015-12-09

第一作者簡介：趙艷(1983-)，女，高級工程師，研究方向為水產品營養(yǎng)評價和食品及飼料產品質量安全檢測。E-mail：zhao518yan@126.com

中圖分類號：TS254.7

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)03-0099-05

資助項目：四川省科技支撐計劃項目(2011NZ0071)