高效液相色譜法檢測醬油中羥脯氨酸的含量研究

□ 李晨輝 周小虎 邵陽學(xué)院生物與化學(xué)工程系

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高效液相色譜法檢測醬油中羥脯氨酸的含量研究

□ 李晨輝 周小虎 邵陽學(xué)院生物與化學(xué)工程系

醬油是人們?nèi)粘Ｉ钪斜貍涞恼{(diào)味品之一，在醬油當(dāng)中，具有羥脯氨酸的成分，在檢測醬油中羥脯氨酸含量的實驗中，可應(yīng)用高效液相色譜法。利用乙醇提取樣品，衍生試劑采用2，4-二硝基氟苯，采用360 n m的波長，采用5 μm 4.6 mm×250 mm的色譜柱。通過相應(yīng)的實驗操作，獲得醬油當(dāng)中羥脯氨酸的含量數(shù)據(jù)。

實驗操作

實驗材料和實驗儀器

在實驗當(dāng)中，采用了羥脯氨酸二甲基甲酰胺、2，4-二硝基氟苯、乙腈、碳酸氫鈉、乙酸鈉、磷酸二氫鉀、冰乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、1%DNFB衍生溶液、羥脯氨酸對照品儲備液以及羥脯氨酸對照品工作溶液等實驗材料。實驗儀器則主要包括離心機、工作站、柱溫箱、自動進樣器、紫外檢測器以及高效液相色譜儀等。實驗樣品的來源主要是自制酸水解蛋白液、自購樣品等。

實驗方法和實驗步驟

在實驗當(dāng)中，首先在1 mL樣品中加入3 m L乙醇，混合離心之后，在10 mL棕色容量瓶中放置0.25 mL上清液，將1.0 mL碳酸氫鈉、0.75 mL水加入其中，并加入1 mL DNFB，均勻混合后進行30 min、60℃的衍生。冷卻到室溫，再加入磷酸二氫鉀溶液，搖勻過濾，最后進行進樣分析。實驗中采用5 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱，流動相分別為乙腈-水、乙酸鈉，柱溫為30℃、流速為每分鐘1.0 m L，檢測波長為360 mm，進樣量為10 μL。

結(jié)果分析

檢測條件

在選擇檢測條件的過程中，首先對樣品進行前處理，對于樣品不進行水解，而是直接進行提取，選擇乙醇作為提取溶劑，消除樣品中色素的干擾。在選擇衍生試劑的過程中，根據(jù)實際要求，采用了DNFB試劑，因為其具有穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、成本低、時間短的優(yōu)勢。最后選擇流動相的梯度，對羥脯氨酸采用配比不同的流動相進行洗脫操作，觀察干擾峰、目標(biāo)峰、色譜峰等情況?；诖?，得出5.1 min的羥脯氨酸保留時間。

線性范圍和檢出限

對羥脯氨酸對照品工作溶液進行前處理之后進行上機測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積對濃度，得出線性回歸方程，y = 321.04x + 767.74。在10～320 mg/L羥脯氨酸比濃度下，峰面積、質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系較為良好。采用3倍信噪比，對羥脯氨酸進行計算，得到了2.5 mg/L的檢出限。

方法回收率和精密度實驗

在不含有羥脯氨酸成分的醬油樣品中，分別加入10、40、160 mg/L的羥脯氨酸對照品，進行相應(yīng)的前處理之后，對回收實驗進行操作。針對各個試樣，分別進行6次平行處理，在不同的添加水平當(dāng)中，得到的平均回收率分別為110.18%、97.79%、101.15%。因此總的來看，此種方法能夠得到97.19%～110.18%的回收率，能夠控制在3%以下的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

樣品測定

在動物水解蛋白液當(dāng)中，羥脯氨酸的含量分別為豬瘦肉水解溶液中92.32 mg/L，豬皮水解液中3 850.45 mg/L，普遍具有較高的羥脯氨酸含量。經(jīng)過計算，在豬瘦肉水解液、豬皮水解液當(dāng)中，相對羥脯氨酸含量分別為37.03 mg/g和855.55 mg/g。在純釀造醬油當(dāng)中，羥脯氨酸的含量通常為0.67～1.93 mg/g。在自制水解植物蛋白液當(dāng)中，在豆粕、麩皮、小麥水解液當(dāng)中，都檢測出了羥脯氨酸，含量約為9.51～20.11 mg/g。

由此可見，在動植物水解蛋白液當(dāng)中，都含有羥脯氨酸，但植物水解蛋白液中的含量要明顯低于動物水解蛋白液。所以，通過對醬油樣品中羥脯氨酸含量的測定，就能夠判斷其中是否添加了酸水解動植物蛋白液。對購買的酸水解植物蛋白液樣品進行檢測，其中羥脯氨酸的含量為2.90～16.00 mg/g，要比純釀造醬油含量高。對在市場中購買的醬油樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中的羥脯氨酸含量為0.81～7.88 mg/g，同時，有四種醬油樣品中的羥脯氨酸含量要明顯比純釀造醬油高，因此，其中可能摻入了水解蛋白液。

結(jié)論

在人們的日常生活當(dāng)中，醬油是一種必不可少的重要調(diào)味品。在眾多醬油品類當(dāng)中，純釀造醬油是最為健康的，但同時成本也是比較高的。因此，很多商家將水解蛋白液添加在醬油當(dāng)中，冒充純釀造醬油進行銷售。對此，可以采用高效液相色譜法對醬油當(dāng)中的羥脯氨酸含量進行檢測，根據(jù)測得結(jié)果判斷醬油當(dāng)中是否摻入了水解蛋白液。

作者簡介：李晨輝（1992-）男，云南曲靖人，本科。研究方向：食品科學(xué)。周小虎（1989-）男，湖南邵陽人，碩士研究生，助教。研究方向：食品科學(xué)。