徐海春，王 偉，徐曉東▲

（1上海市黃浦區(qū)半淞園社區(qū)衛(wèi)生服務中心口腔科, 上海 200011；2.上海市同仁醫(yī)院口腔科, 上海 200336）

用cre-loxp鼠研究Runx2在釉質發(fā)育中的作用

徐海春1，王 偉2，徐曉東2▲

（1上海市黃浦區(qū)半淞園社區(qū)衛(wèi)生服務中心口腔科, 上海 200011；2.上海市同仁醫(yī)院口腔科, 上海 200336）

目的 為研究Runx2基因缺失對牙釉質發(fā)育的影響，擬建立Runx2基因條件性敲除的小鼠動物模型。方法 利用染色體位點特異性重組酶cre-loxp系統(tǒng)和FLP-frt的條件性基因打靶，借助于同源重組將兩個同向的loxp位點置于Runx2基因的編碼重要功能域外顯子2兩側的內含子序列中，從而獲得表型正常的Flox小鼠，為了提高ES細胞篩選的效率，插入被FRT位點瞄定的、作為選擇性篩選的陽性標記neo基因，同時插入作為負性篩選的DTA，通過電轉的方式，將構建成功的載體電導入到ES細胞，并通過對中靶的ES細胞進行篩選和鑒定，得到了同源重組正確的陽性克隆，通過顯微注射，將中靶的ES細胞導入囊胚中，將囊胚移植到代孕鼠子宮內，最終得到嵌合體小鼠，將此嵌合體小鼠與FLP工具鼠雜交，利用FRT與FLP特異性識別，去掉neo基因即可獲得陽性的loxp鼠，將其與組織特異性表達cre重組酶的轉基因小鼠雜交，特異性表達的cre重組酶將介導loxp位點間的基因片段重組。小鼠出生后經(jīng)PCR鑒別，獲得Runx2基因條件性敲除的雜合子小鼠，條件性敲除的雜合子小鼠自交或與loxp純合子小鼠雜交，小鼠出生后，PCR鑒別篩選條件性完全敲除的小鼠。RT-PCR法檢測外源性Cre基因的表達。結果 構建了cre鼠、loxp鼠和Runx2基因條件性敲除的小鼠模型。結論 利用染色體位點特異性重組酶loxp-cre系統(tǒng)和FLP-frt系統(tǒng)可以很好的研究Runx2基因缺失對牙釉質發(fā)育的影響。

cre-loxp系統(tǒng)；Runx2；基因打靶；同源重組；FLP-frt系統(tǒng)

牙釉質對牙齒的生理功能具有重要的意義。牙釉質發(fā)育離不開各種轉錄因子的作用。Runx2作為成骨細胞分化的特異性轉錄因子，在牙胚發(fā)育中具有重要作用，參與牙齒萌出時的牙槽骨改建過程，對牙周膜起重要作用[1]。有文獻表明[2]，Runx2可通過介導TGF-β1來調節(jié)成釉細胞基質金屬蛋白酶基因（MMP20）的表達。為了進一步研究Runx2在牙釉質發(fā)育中的作用，我們利用染色體位點特異性重組酶cre-loxp系統(tǒng)，構建了Runx2基因條件性敲除的小鼠動物模型，為以后研究Runx2基因介導TGF-β1調控釉質的發(fā)育奠定了基礎。

1 材 料 與 方 法

1.1 實驗動物和儀器設備、主要材料

C57BL/6背景的小鼠（廣州賽業(yè)）PCR儀（Bio-RAD7100）電泳儀（北京君意JY200C）凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智CHampGe15500）2×Easy Taq PCR Super Mix（TRAN，北京全式金） RNAiso Plus（TaKaRa，大連寶生物）Agarose-Molecular Biology Grade（invitrogen75510-019， 美國）DL-500DNA Marker（TaKaRa，大連寶生物）

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 RUNX2loxp/loxp動物模型的構建

Runx2基因位于17號染色體上，根據(jù)對其基因序列的研究，符合條件性敲除Runx2基因的條件，在其基因序列上共含7個外顯子，ATG作為起始密碼子，位于外顯子1，TGA作為終止密碼子，位于外顯子7。RUNX2loxp/loxp在胚胎干細胞中通過同源重組獲得，選擇在編碼Runx2的外顯子2的兩端插入兩個方向相同的loxp位點。為提高ES細胞篩選效率，插入作為陽性篩選、被FRT位點瞄定的neo基因，同時插入作為負篩選標記基因DTA，載體構建成功（如圖1所示）后，通過電轉方式，導入到ES細胞，并通過對中靶的ES細胞進行正負雙向篩選和鑒定，得到同源重組正確的陽性克隆。通過顯微注射，將中靶的ES細胞導入囊胚中，將囊胚移植到代孕鼠子宮內，最終得到嵌合體flox小鼠，將此嵌合體小鼠和與FLP工具鼠雜交，利用FRT與FLP特異性識別，去掉neo基因即可獲得被loxp位點瞄定的Runx2小鼠。刪除兩個同向loxp位點間的外顯子2的序列，引起外顯子2下游的移碼突變，這樣就獲得了Runx2缺失的條件性基因敲除的小鼠動物模型。

1.2.2 pRP.ExSi-Amelogenin-cre動物模型的構建

以噬菌體P1基因組DNA為模板，用上下游引物擴增出片段長1032bp的Cre，其大小與GenBank報道的片段大小相符。以其構建的pcDNA3.1-HisACre經(jīng)EcoRⅠ雙酶切鑒定正確，DNA測序經(jīng)BLAST顯示與預期結果一致。利用GatewayTechnology構建pRP.ExSi-Amelogenin-cre啟動子（如圖2所示），將其經(jīng)單酶切線性化后通過瓊脂糖凝膠電泳（10g/ L），用QIAquick Gel ExtractionKit 回收產(chǎn)物，然后把其溶解在滅菌的 5 mmol /L Tris，pH7.4，0.2 mmol /L EDTA顯微注射DNA 緩沖液中; 最后把線性化DNA 通過原核注射的方式注射于400個受精卵; 顯微注射后的受精卵回送10只C57BL/6代孕母鼠輸卵管中，受孕后出生小鼠經(jīng)PCR鑒定后，即可得到轉基因小鼠。

1.2.3 基因敲除小鼠的構建

由于Cre重組酶能特異性的識別loxp位點，將組織特異性Cre小鼠與去掉FRT位點的loxp鼠雜交，特異性表達的cre重組酶介導loxp位點間的基因片段重組，根據(jù)孟德爾遺傳定律，cre雜合子小鼠與Flox純合子小鼠雜交，小鼠出生后，經(jīng)PCR鑒定，即可獲得Runx2條件性敲除的雜合子小鼠模型，利用此雜合子小鼠自交或者此雜合子小鼠和Flox純合子小鼠雜交，根據(jù)孟德爾遺傳定律，小鼠出生后，經(jīng)PCR鑒別篩選loxp純合子同時表達cre重組酶的小鼠即為所需的Runx2條件性敲除的純合子模型。

1.2.4 PCR鑒別篩選轉基因鼠

從鼠尾提取基因組DNA，通過相應的引物利用PCR儀來鑒別篩選轉基因鼠。PCR反應條件：94℃5min，94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 20s，30個循環(huán)后72℃延伸5min，1mg/50ml的瓊脂糖凝膠電泳。PCR鑒別轉基因鼠的特異性引物:

鑒別Loxp（圖3）:

F: GGCGCCTTGTTAGAGTGGTGCCTT

R: CCTTGTGCCAGGTTAGCTGTGC

（純合子：309bp 雜合子：248bp/309bp 野生型：248bp）

鑒別Frt和Loxp（圖4）：

BZMC001_Neo_Del F: GGGGGTTTAGCACGTACAGTAGGG

BZMC001_Neo_Del R: CTCCAACTGTCCCTGTATGAACGC

（純合子：308bp 雜合子：168bp/308bp 野生型：168bp）

鑒定Cre鼠（圖5）的特異性引物：

F: CCAGCTAAACATGCTTCATCGTC

R: TGATCCTGGCAATTTCGGCTA

Internal control F：ACTCCAAGGCCACTTATCATT

Internal control R:ATTGTTACCAACTGGACGACA

目的片段：263bp，Internal control 片段:413bp)Cre鼠的鑒別只有一條目的條帶，因此不能區(qū)分純合子還是雜合子。

Runx2基因條件性敲除的小鼠鑒別篩選：利用cre重組酶表達陽性的小鼠和Flox純合子小鼠雜交，小鼠出生后，分別利用鑒別cre鼠的引物和loxp鼠的引物來篩選，F(xiàn)1代篩選出Flox雜合子同時cre重組酶表達陽性的小鼠（圖6），然后利用這些小鼠雌雄自交，或者再分別和Flox純合子小鼠交配，小鼠出生后，經(jīng)PCR鑒別篩選出Flox純合子同時cre重組酶陽性的小鼠（圖7），此小鼠即為我們所需的Runx2基因條件性敲除的純合子小鼠模型。

2 RT-PCR檢測外源性Cre基因在小鼠頜骨的表達

利用Trizol法提取出生5d的Cre陽性小鼠和WT鼠的下頜骨磨牙區(qū)的RNA。參考Reverse Transcriptase M-MLV逆轉錄1ug總RNA為cDNA。以此cDNA為模板，GAPDH作為內參，以P1：CGACCAGGTTCGTTCACTCA

P2：CAGCGTTTTCGTTCTGCCAA（184bp） 作 為引物，用RT-PCR分別檢測mCre在Cre陽性小鼠和WT小鼠下頜骨的表達。聚合酶鏈式反應條件：94℃ 5min，94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 20s，30個循環(huán)后72℃延伸5min，1mg/50ml的瓊脂糖凝膠電泳（圖8）。

3 結 果

成功構建Flox鼠和組織特異性表達的cre鼠，通過Flox鼠和組織特異性表達的cre鼠的雜交得到了Runx2條件性完全敲除的小鼠模型。

提取cre陽性小鼠和WT小鼠總RNA，利用cre特異性引物，gapdh作內參，只能在cre陽性小鼠模板中擴增出陽性條帶

圖1 BZMCOO1-mRunx2載體構建圖譜

圖2 amelx-cre基因表達載體構建圖譜

圖3

圖4

圖5 cre陽性小鼠為第15、17、19號

圖6 （1）為cre陽性小鼠與loxp純合子小鼠雜交，所生小鼠用鑒別cre鼠的引物和Internal control引物來篩選cre陽性的小鼠，其中3，4，5，7，10為cre陽性小鼠

圖6 （2）為cre鼠與loxp純合子小鼠雜交，所生小鼠用鑒別loxp的引物來篩選，均為loxp雜合子。

圖7 （1）為loxp雜合子同時cre陽性的小鼠雜交所生小鼠，用鑒別cre鼠的引物篩選，陽性小鼠為1，2，3，5，6號

圖7 （2）為loxp雜合子同時cre陽性的小鼠雜交所生小鼠，用鑒別loxp鼠的引物篩選，純合子為1，3，5號，雜合子為6，7野生型為2，4號

圖8 （1） cre特異性引物

圖8 （2） GAPDH

4 討 論

Runx2屬于Runt家族中的成員，是一種調節(jié)成骨細胞分化的轉錄因子。Runx2在骨骼形成和發(fā)育中起著重要的作用。有文獻表明，Runx2基因的移碼突變與顱骨鎖骨發(fā)育不全有密切的關系[4]。但是關于其具體的作用機制尚不清楚。Runx2基因廣泛參與牙齒發(fā)育中各組織的形成和發(fā)育[5]。因此，研究Runx2基因對牙齒發(fā)育的影響機制具有重要的意義。

轉基因動物模型越來越多的運用在生命科學的基礎研究，為我們研究生命科學提供了重要的手段。小鼠與人類的基因序列具有高度的同源性，因此我們采用小鼠的動物模型來研究人類的生命科學現(xiàn)象。利用動物模型研究生命科學現(xiàn)象有其自身的局限性。轉基因動物的胚胎致死性是影響我們實驗研究的主要問題，某些重要基因的完全性敲除可引起轉基因動物的胚胎致死性，限制了我們對其的進一步研究。Cre-loxp系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，很好的解決了這一難題。Cre-loxp系統(tǒng)利用特異性的啟動子啟動cre重組酶在特定的時間特定的組織特異性表達，使在特定的時間空間上對特定基因研究成為了可能。Runx2在牙齒和骨骼的發(fā)育中具有重要的作用[6]。缺乏Runx2基因的小鼠在出生時就死亡，沒有骨和牙齒的發(fā)育[7]。Runx2基因位于17號染色體上，根據(jù)對其基因序列的研究，符合條件性敲除Runx2基因的條件，在其基因序列上共含7個外顯子，ATG作為起始密碼子，位于外顯子1，TGA作為終止密碼子，位于外顯子7。我們選擇外顯子2作為條件性敲除的位點，在Runx2的外顯子2兩端的內含子內插入兩個loxp位點，從而獲得表型正常的Flox小鼠，為了提高ES細胞篩選的效率，插入作為選擇性篩選的陽性標記neo基因和負篩選標記基因DTA，將構建成功的載體導入到ES細胞，并通過對中靶的ES細胞進行雙向篩選和鑒定，得到了同源重組正確的陽性克隆，通過顯微注射，將中靶的ES細胞導入囊胚中，將囊胚移植到代孕鼠子宮內，最終得到嵌合體Flox小鼠，將此嵌合體小鼠和與FLP工具鼠雜交，利用FRT與FLP特異性識別，去掉neo基因即可獲得被loxp位點瞄定的Runx2小鼠，將此小鼠與FLP工具鼠雜交，利用FRT與FLP特異性識別，去掉neo基因即可獲得陽性的Flox鼠。構建amelx啟動子特異性啟動cre重組酶表達的轉基因小鼠，通過Flox鼠純合子和組織特異性表達的cre小鼠的雜交，建立creloxp系統(tǒng)，組織特異性表達的cre重組酶將介導loxp位點間的基因重組，根據(jù)孟德爾遺傳學定律，小鼠出生后經(jīng)PCR鑒定可獲得特異性基因敲除的雜合子小鼠，利用此同窩的雜合子小鼠交配或者分別和Flox純合子小鼠交配，小鼠出生后，經(jīng)PCR鑒別篩選loxp純合子同時cre重組酶表達陽性的小鼠即為所需純合子條件性完全敲除的小鼠模型。通過對Runx2基因條件性完全除的小鼠模型的觀察，我們可以很好的對Runx2基因對牙齒發(fā)育的影響展開更進一步的研究，對Runx2基因對牙釉質發(fā)育影響的分子機制展開更為深入的探索。

[1]胡佳藝,李琥,侯偉,等. RUNX家族蛋白在小鼠磨牙發(fā)育過程中的表達分析[J]. 口腔生物醫(yī)學,2012,04:193-196.

[2]孫學玲,孫巖,張娟娟,等. Runx2介導TGF-β1調控成釉細胞MMP20基因表達的研究[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志,2012,02:61-65.

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徐海春(1978-), 女 ,江蘇南京人,本科,主治醫(yī)師.

徐曉東(1974-), 男,本科,浙江鄞縣人,副主任醫(yī)師.