李　濤,李春斌,范圣第

(1.大連民族大學(xué) 國(guó)家民委-教育部生化工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116605；2.中美華世通(武漢)生物醫(yī)藥科技有限公司，湖北 武漢 430070)

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藏紅花球莖組織培養(yǎng)條件的研究

李濤1,2,李春斌1,范圣第1

(1.大連民族大學(xué) 國(guó)家民委-教育部生化工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116605；2.中美華世通(武漢)生物醫(yī)藥科技有限公司，湖北 武漢 430070)

摘要：以藏紅花球莖側(cè)芽為外植體，通過植物組織培養(yǎng)的方式建立藏紅花快速繁殖體系。研究表明：以MS為基本培養(yǎng)基，附加0.5 mg·L-16-BA+4.0 mg·L-12,4-D，在黑暗條件下最適于藏紅花愈傷組織的誘導(dǎo)，并且20 d誘導(dǎo)率可以達(dá)到96.7 %；附加2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，在黑暗條件下最適合藏紅花叢生芽的誘導(dǎo)與增值，叢生芽誘導(dǎo)率可達(dá)96 %；附加5.0 mg·L-16-BA +1.5 mg·L-1NAA+0.3 g·L-1AC，在1 500～2 000 lx的光照條件下，30 d左右新生小球莖誘導(dǎo)率高達(dá)90 %。

關(guān)鍵詞：藏紅花；組織培養(yǎng)；愈傷組織；小球莖

藏紅花(CrocussativusL.)，別名番紅花、西紅花，屬于鳶尾科番紅花屬多年生草本植物。藏紅花原產(chǎn)于西班牙、希臘、南歐各國(guó)以及伊朗等地[1]，后經(jīng)印度傳到中國(guó)，如今在江浙和華北都有種植[2]。在治療精神類疾病、神經(jīng)退行性疾病、學(xué)習(xí)記憶障礙、心血管方面顯示出潛在的藥用價(jià)值[3-4]。由于藏紅花只能依靠球莖無性繁殖，并且在種植過程中隨著繁殖代數(shù)的增加球莖越來越小，小球莖開花少且較小，甚至不開花，從而失去了藥用價(jià)值[5]。藏紅花僅僅是柱頭入藥，但因適合其種植的地域有限且種植條件苛刻等因素，以致其產(chǎn)量極低，來源極為有限，價(jià)格昂貴。應(yīng)用植物組織細(xì)胞培養(yǎng)的方法能夠很好地解決藏紅花種球病毒積累、品質(zhì)退化、繁殖系數(shù)低甚至失去藥用價(jià)值等問題。

本實(shí)驗(yàn)以藏紅花球莖側(cè)芽為外植體，從不同培養(yǎng)條件上研究藏紅花愈傷組織、叢生芽和小球莖的發(fā)生，探索出一條人工繁殖藏紅花球莖的途徑，以期提高藏紅花的繁殖系數(shù)，解決球莖退化、資源短缺等問題。

1材料與方法

1.1材料

本實(shí)驗(yàn)室藏紅花球莖來自于大連市，取材時(shí)間為當(dāng)年的5月底，此時(shí)的球莖正處于休眠期?；九囵B(yǎng)基分別為MS、1/2MS、N6、B5培養(yǎng)基；激素分別為6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、2,4-二氯苯氧乙酸( 2,4-D )、α-萘乙酸 (NAA)、玉米素(ZT)。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制

分別以MS、1/2MS、N6和B5為基本培養(yǎng)基，所有的固體培養(yǎng)基中均添加30 g·L-1的蔗糖和6.5 g·L-1的瓊脂，調(diào)pH為5.8～6.2，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要添加6-BA、2,4-D、NAA、ZT和AC等其他附加物后分裝到培養(yǎng)小瓶中，最后在121 ℃下滅菌15 min備用。

1.2.2外植體的消毒方法

以保存于4 ℃冰箱中8周的休眠藏紅花球莖為外植體，在流水沖洗下去掉球莖表面的泥土和皮膜，剔除清洗不干凈的病斑后，將其中已萌發(fā)的芽連同球莖一起切下，在流水下沖洗過夜。在已通過紫外除菌的潔凈工作臺(tái)上將藏紅花球莖和側(cè)芽轉(zhuǎn)入到75 %乙醇滅菌1min，再轉(zhuǎn)入0.1 %～0.2 %的升汞或5 %次氯酸鈉中，消毒5～20 min，然后用無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸去多余的水分，備用。每瓶接種3個(gè)外植體，3種不同的消毒方式分別接種10瓶，一周后觀察不同的消毒劑對(duì)藏紅花染菌率的影響。

1.2.3接種及愈傷組織誘導(dǎo)

在無菌操作臺(tái)上將已消毒處理好的球莖側(cè)芽切成1 cm左右的小段,分別將其接種到添加了0.5 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-12,4-D的MS、1/2MS、N6和B5培養(yǎng)基中，分別附加不同的激素，并在不同溫度下進(jìn)行暗培養(yǎng)，觀察研究4種不同的基本培養(yǎng)基與藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)系，同時(shí)篩選出適合誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基。

1.2.4叢生芽誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)

將上述經(jīng)繼代培養(yǎng)獲得的愈傷組織切塊后分別轉(zhuǎn)接到添加了0～3 mg·L-16-BA和NAA與添加了0～3 mg·L-1ZT和NAA的MS基本培養(yǎng)基中，在優(yōu)化溫度和黑暗條件下進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)。培養(yǎng)一個(gè)月后，觀察統(tǒng)計(jì)藏紅花愈傷組織芽的分化情況，篩選出最適合藏紅花愈傷組織分化出芽的培養(yǎng)基。利用優(yōu)化的培養(yǎng)基，在優(yōu)化的溫度條件下分別以暗培養(yǎng)、光照培養(yǎng)和1 500～2 000 lx與16 h·d-1光照的方式進(jìn)行藏紅花愈傷組織叢生芽的誘導(dǎo)。將誘導(dǎo)出的叢生芽在優(yōu)化的條件下進(jìn)一步繼代培養(yǎng)。

1.2.5球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)

取經(jīng)繼代增殖培養(yǎng)后的叢生芽分別轉(zhuǎn)接到添加了0～5 mg·L-16-BA和NAA的MS+0.3 g·L-1AC培養(yǎng)基中觀察活性炭存在下激素對(duì)球莖誘導(dǎo)的作用，再向上述優(yōu)化的培養(yǎng)基中添加0～1 g·L-1AC，觀察活性炭質(zhì)量濃度對(duì)球莖誘導(dǎo)的作用，且均在優(yōu)化溫度、1 500～2 000 lx和14 h·d-1光照下培養(yǎng)。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

采用4種不同的培養(yǎng)基來進(jìn)行藏紅花愈傷組織的誘導(dǎo)，篩選出藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，結(jié)果見表1。

表1　基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表1可發(fā)現(xiàn),當(dāng)以N6為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)率為0 %，以1/2MS和B5為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)率都相對(duì)較低，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)率為83.3 %，表明最適合藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的是MS培養(yǎng)基，這也與MS培養(yǎng)基是目前使用最普遍的培養(yǎng)基，具有較高的無機(jī)鹽濃度，能夠保證組織生長(zhǎng)所需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，還能加速愈傷組織的生長(zhǎng)特點(diǎn)相吻合。

2.2不同消毒方法與外植體染菌率的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)以不同濃度的消毒劑處理不同的時(shí)間來研究不同的消毒方法對(duì)藏紅花離體培養(yǎng)染菌率的影響。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2　不同消毒方法對(duì)外植體染菌率的影響

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),在相同時(shí)間下不同消毒劑對(duì)染菌率的影響，氯化高汞的滅菌效果相對(duì)比次氯酸鈉好；在相同的消毒劑下處理不同的時(shí)間，其滅菌效果差異顯著。經(jīng)LSD法分析，處理時(shí)間在6 ，8，10 min時(shí)，滅菌效果差異非常顯著，而在10 min和15 min時(shí)滅菌效果不十分明顯。當(dāng)以升汞處理時(shí)間為6～10 min時(shí)，外植體的染菌率高達(dá)50.0 %以上， 10～15 min時(shí)，其染菌率可降低到20 %左右。然而從愈傷組織誘導(dǎo)率和消毒劑對(duì)外植體的傷害來看，并不是處理的時(shí)間越長(zhǎng)越好，當(dāng)0.1 %升汞或0.2 %升汞處理時(shí)間超過15 min后，部分外植體出現(xiàn)病變腐爛現(xiàn)象，從而導(dǎo)致其不能正常地誘導(dǎo)出愈傷組織，因此降低了愈傷組織的誘導(dǎo)率。綜合考慮愈組織誘導(dǎo)率和外植體的染菌率，認(rèn)為以75 %乙醇消毒1 min外加0.1 %升汞消毒10 min的組合方式來處理藏紅花組織培養(yǎng)中的外植體較為合適。

2.3培養(yǎng)溫度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

通過將外植體接種到相同的無菌培養(yǎng)基中，利用光照培養(yǎng)箱在(16±0.3) ℃、(18±0.3) ℃、(20±0.3) ℃、(22±0.3) ℃和(24±0.3) ℃下培養(yǎng)1個(gè)月，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

表3　溫度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

溫度過高或過低都不利于藏紅花愈傷組織的快速誘導(dǎo)和誘導(dǎo)率的提高，研究結(jié)果表明，愈傷組織的最佳誘導(dǎo)溫度為(20±0.3) ℃，因此本實(shí)驗(yàn)選擇(20±0.3) ℃作為藏紅花愈傷組織的誘導(dǎo)最佳溫度。

2.4激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將球莖側(cè)芽接種于以MS為基本培養(yǎng)基且添加了不同質(zhì)量濃度和配比的6-BA和2,4-D中，利用光照培養(yǎng)箱，在培養(yǎng)溫度為(20±0.3) ℃和黑暗條件下培養(yǎng)10 d左右，外植體切口處開始張裂，有顆粒狀的物質(zhì)出現(xiàn)時(shí)，再連續(xù)培養(yǎng)20 d左右后形成黃色顆粒狀的愈傷組織(如圖1)。

圖1　藏紅花球莖側(cè)芽愈傷組織的誘導(dǎo)

通過接種后一個(gè)月的觀察，記錄統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。在僅僅添加2,4-D時(shí)不能成功的誘導(dǎo)出愈傷組織，其誘導(dǎo)率為0 %。當(dāng)存在定量的6-BA協(xié)同作用時(shí)，2,4-D質(zhì)量濃度過高或過低都不利于愈傷組織誘導(dǎo)率提高和愈傷組織快速誘導(dǎo)，同時(shí)6-BA質(zhì)量濃度過大也不利于藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)率的提高。研究結(jié)果表明，藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的最適激素配比為0.5 mg·L-16-BA+4.0 mg·L-12,4-D，其中藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)率為96.7 %。

表4　不同激素組合對(duì)藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.5激素對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

將已形成的愈傷組織中生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)一致的轉(zhuǎn)接到附加了不同質(zhì)量濃度激素配比的分化培養(yǎng)基中，利用光照培養(yǎng)箱在(20±0.3) ℃和暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行藏紅花無菌叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，除了形成愈傷組織外，逐漸有些突起形成白色披針形的葉片，慢慢形成叢生芽(如圖2)，將叢生芽進(jìn)一步繼代培養(yǎng)以后得到更多的叢生芽(如圖3)。

圖2　藏紅花愈傷組織分化出叢生芽

通過對(duì)愈傷組織分化培養(yǎng)一個(gè)月的觀察，統(tǒng)計(jì)結(jié)果(見表5)表明，當(dāng)較高質(zhì)量濃度的6-BA與較低質(zhì)量濃度的NAA相互協(xié)同作用時(shí)，能成功誘導(dǎo)出藏紅花叢生芽，但是6-BA的質(zhì)量濃度太高或NAA的質(zhì)量濃度太低對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)都不利，其中6-BA 與ZT相比更有利于叢生芽的誘導(dǎo)，當(dāng)激素配比是2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA時(shí),藏紅花的叢生芽誘導(dǎo)率最高，且最高可達(dá)到96 %。

圖3　藏紅花的繼代增值

激素配比/(mg·L-1)外植體數(shù)/個(gè)外植體平均出芽數(shù)/個(gè)出芽率/%6-BA3+NAA0.23015506-BA3+NAA0.33020676-BA3+NAA0.43012406-BA3+NAA0.53010336-BA2+NAA0.33016536-BA2+NAA0.5302896ZT2+NAA0.530930

2.6光照對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

本實(shí)驗(yàn)均在暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行藏紅花愈傷組織的誘導(dǎo)，為了確定光照是否對(duì)藏紅花叢生芽的誘導(dǎo)有影響，又研究了光照對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響，結(jié)果見表6。

表6　光照時(shí)間對(duì)藏紅花愈傷組織分化成芽的影響

表6結(jié)果表明，在暗培養(yǎng)條件下叢生芽的誘導(dǎo)率可高達(dá)95 %，但是在光照的培養(yǎng)條件下叢生芽的誘導(dǎo)率明顯降低，最高只能到達(dá)30 %，說明光照不利于藏紅花愈傷組織進(jìn)一步誘導(dǎo)叢生芽。

2.7藏紅花球莖的誘導(dǎo)條件

2.7.1激素對(duì)球莖誘導(dǎo)的影響

通過50 d的球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)，探討不同質(zhì)量濃度的激素配比對(duì)球莖誘導(dǎo)的影響，結(jié)果見表7。在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基中，芽不能正常生長(zhǎng)，更不能誘導(dǎo)出小球莖；在僅添加1.0 mg·L-16-BA或1.0 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基中，叢生芽生長(zhǎng)十分緩慢且相對(duì)矮小，最終都不能誘導(dǎo)出小球莖。研究表明，球莖誘導(dǎo)的最佳激素配比為5.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA，球莖誘導(dǎo)最快，且能正常生長(zhǎng)，第30 d球莖誘導(dǎo)率為90 %。

表7　激素對(duì)藏紅花球莖誘導(dǎo)的影響

2.7.2活性炭與藏紅花試管球莖誘導(dǎo)的關(guān)系

考察了當(dāng)以MS為基本培養(yǎng)基，結(jié)合球莖誘導(dǎo)最佳激素配比5.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA 的條件下，不同質(zhì)量濃度的活性炭對(duì)藏紅花球莖誘導(dǎo)的影響，結(jié)果見表8。在不添加活性炭的情況下，即使培養(yǎng)基到第65 d，球莖的誘導(dǎo)率依舊為0 %；而在添加了0.3 g·L-1活性炭的培養(yǎng)基中，藏紅花小球莖的誘導(dǎo)時(shí)間最短為30 d且誘導(dǎo)率最高可達(dá)90 %(如圖4)。

表8　活性炭對(duì)藏紅花試管球莖誘導(dǎo)的影響

圖4　藏紅花球莖

3討論

有關(guān)藏紅花的組織培養(yǎng)，最近國(guó)內(nèi)外有報(bào)道利用SH和LS等作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[6-11]，但是利用常用的MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并附加與本實(shí)驗(yàn)不同的激素濃度配比時(shí)也能誘導(dǎo)出叢生芽和小球莖，可見外源激素的類型與濃度配比是藏紅花快速繁殖是否成功的關(guān)鍵。其中國(guó)內(nèi)外多以藏紅花球莖為外植體來進(jìn)行組織培養(yǎng)，然而，關(guān)于以藏紅花球莖側(cè)芽為外植體來進(jìn)行組織培養(yǎng)的報(bào)道較少。本文以藏紅花球莖側(cè)芽為外植體，建立了藏紅花球莖的快速繁殖體系，成功誘導(dǎo)出了藏紅花愈傷組織且分化出叢生芽，由叢生芽進(jìn)一步誘導(dǎo)培養(yǎng)后成功獲得了球莖，并且其誘導(dǎo)率均高于國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道。

在藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)過程中，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)率都相對(duì)比以1/2MS和B5為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)高，其中原因可能是MS培養(yǎng)基中的硝酸鹽和銨的含量較高，更有利于藏紅花球莖愈傷組織的誘導(dǎo)，并且與陳書安[12]等研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有當(dāng)細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)激素的協(xié)同作用時(shí)才能誘導(dǎo)出藏紅花愈傷組織。此外，當(dāng)存在定量的6-BA協(xié)同作用時(shí)，2,4-D質(zhì)量濃度過高或過低都不利于愈傷組織誘導(dǎo)率提高和愈傷組織快速誘導(dǎo)，同時(shí)6-BA質(zhì)量濃度過大也不利于藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)率的提高。本實(shí)驗(yàn)中愈傷組織20 d能達(dá)到96.7 %的誘導(dǎo)率，均高于國(guó)內(nèi)外相關(guān)愈傷組織誘導(dǎo)的研究[13-16]。與Zeybek[14]等研究結(jié)果相比，藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)率均顯著提高，但與Raja[16]等的研究相比，延長(zhǎng)了藏紅花愈傷組織的誘導(dǎo)時(shí)間，其中可能原因是與外植體的來源不同有關(guān)。以細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)激素協(xié)同作用來決定細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)，在藏紅花球莖誘導(dǎo)中起著決定性的作用，在僅含6-BA或2,4-D的培養(yǎng)基中，小球莖誘導(dǎo)率都較低或不產(chǎn)生小球莖。在藏紅花球莖誘導(dǎo)過程中，可以利用活性炭對(duì)激素的吸附和解吸附來調(diào)控培養(yǎng)基中的激素水平[17]，同時(shí)能通過吸附培養(yǎng)基滅菌時(shí)產(chǎn)生的糖裂解產(chǎn)物、植物分泌的酚類等抑制生長(zhǎng)的物質(zhì)[17]，促進(jìn)藏紅花試管球莖的誘導(dǎo)。

關(guān)于直接以藏紅花花柱為外植體的快速繁殖，有待進(jìn)一步的研究，以實(shí)現(xiàn)在最短的時(shí)間內(nèi)直接獲得更多的藏紅花藥用成分。

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(責(zé)任編輯鄒永紅)

Study on Tissue Culture Conditions of Saffron Corm

LI Tao1,2， LI Chun-bin1， FAN Sheng-di1

(1.Key Laboratory of Biological Chemistry Engineering -The State Ethnic Affairs Commission - Ministry of Education, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China;2.Wuhan Company Ltd, Waterstone Pharmaceuticals Group, Wuhan Hubei 430070, China)

Abstract:A rapid propagation system of saffron (Crocus sativus L.) was established here using corms of saffron as explants by means of plant tissue culture. When the corms of saffron were cultured in the dark on MS medium containing 0.5 mg/L 6-benzyladenine (6-BA) and 4.0 mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) for 20 days, the callus induction rate was as high as 96.7%. When the corms of saffron were cultured in the dark on MS medium containing 2.0 mg/L 6-benzyladenine (6-BA) and 0.5 mg/L naphthalene acetic acid (NAA) for 20 days, the callus induction rate was as high as 96%. When the corms of saffron were cultured in 1500 ～ 2000 lx lighting condition on MS medium containing 5.0 mg/L 6-benzyladenine (6-BA), 1.5 mg/L naphthalene acetic acid (NAA) and 0.3 g/L activated carbon (AC) for about 30 days, the cormels induction rate was as high as 90%.

Key words:Saffron; tissue culture; callus; cormlets

收稿日期：2016-03-18；最后修回日期：2016-03-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21372037)。

作者簡(jiǎn)介：李濤(1989-)，男，湖北天門人，大連民族大學(xué)碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物與藥物制造技術(shù)研究。通訊作者：李春斌(1973-)，男，黑龍江慶安人，副教授，博士，主要從事藥用植物組織培養(yǎng)與天然產(chǎn)物研究，Email:lcb@dlnu.edu.cn。

文章編號(hào)：2096-1383(2016)03-0212-05

中圖分類號(hào)：S567.219

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A