李從虎，田振華，劉文濤，李國英*

1. 四川大學(xué)皮革化學(xué)與工程教育部重點實驗室，四川 成都 610065 2. 安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 安慶 246011

同步熒光光譜技術(shù)研究膠原基表面活性劑溶液中分子的聚集行為

李從虎1, 2，田振華1，劉文濤1，李國英1*

1. 四川大學(xué)皮革化學(xué)與工程教育部重點實驗室，四川 成都 610065 2. 安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 安慶 246011

基于膠原基表面活性劑(collagen-based surfactant，CBS)中酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的熒光特性，應(yīng)用恒波長差(Δλ)為15 nm的同步熒光光譜技術(shù)研究CBS濃度、溶液pH值、NaCl濃度和溫度對其在水溶液中分子的聚集行為的影響，并以溫度為外擾，利用二維同步熒光相關(guān)分析研究CBS分子中Tyr殘基和Phe殘基隨溫度變化的響應(yīng)順序。結(jié)果表明，CBS分子在261和282 nm處出現(xiàn)了分別歸屬于Phe和Tyr的特征吸收峰。隨著CBS濃度的升高，CBS分子中Phe殘基和Tyr殘基數(shù)量逐漸增多使CBS分子聚集程度增加，并導(dǎo)致熒光強度增強；CBS溶液pH值(pH 5.0)在等電點附近時，由于CBS分子的疏水作用和氫鍵形成能力加強，導(dǎo)致CBS分子聚集程度增強；CBS溶液中NaCl濃度的升高，則使CBS分子間排斥力減弱，從而導(dǎo)致CBS分子的聚集；然而溫度升高，CBS由聚集狀態(tài)逐漸變?yōu)閱畏肿訝顟B(tài)，因猝滅、變性以及氫鍵形成能力降低，熒光強度逐漸降低。以溫度為外擾的二維同步熒光相關(guān)光譜分析可知：低溫下(10～40 ℃ )，CBS聚集體隨溫度升高逐漸松散，位于聚集體內(nèi)部的Phe殘基比Tyr殘基優(yōu)先響應(yīng)；而在45～70 ℃時，CBS由單分子狀態(tài)逐步水解為無規(guī)卷曲構(gòu)造，Tyr殘基的間距變大，氫鍵形成能力大大降低，Tyr殘基比Phe殘基優(yōu)先響應(yīng)。

膠原；表面活性劑；同步熒光光譜；二維相關(guān)光譜；聚集行為

引 言

天然膠原是一種具有生物活性的高分子蛋白質(zhì)，由于其具有低抗原性、生物相容性以及優(yōu)良的保濕和促進表皮細(xì)胞生長繁殖的優(yōu)異性能[1]，而廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和組織工程等領(lǐng)域。作為纖維蛋白質(zhì)，當(dāng)環(huán)境條件如濃度、pH、溫度和離子強度變化時，膠原在溶液中以聚集體形式存在[2]。因此，研究膠原或其衍生物在溶液中的聚集行為對膠原產(chǎn)品的生產(chǎn)、改善膠原的理化特性具有重要的指導(dǎo)意義[3]。

1978年，Willianms等[4]采用濁度法研究了膠原在生理條件下的自聚集行為，然而濁度法靈敏度較低限制了其應(yīng)用范圍。膠原含有苯丙氨酸(Phe)殘基和酪氨酸(Tyr)殘基，因此可利用Phe和Tyr的熒光特性對其進行熒光測定[5]。同步熒光光譜技術(shù)屬于熒光分析法的一種，由于該法具有靈敏度高且可窄化譜帶和提升分辨率的優(yōu)點[6]，被眾多學(xué)者用于分析和推斷膠原分子在溶液中的構(gòu)象變化。應(yīng)用該技術(shù)，Li等[7]發(fā)現(xiàn)甘油可促進膠原聚集體的分散，而異丙醇可促進膠原的聚集。

本研究曾利用膠原側(cè)鏈自由氨基同時與月桂酰氯和琥珀酸酐反應(yīng)制備得到一種新型的膠原基表面活性劑(CBS)[8-9]，其結(jié)構(gòu)簡式如圖1所示，其中月桂酰和琥珀酰殘基分別作為疏水長鏈和親水基團。CBS不僅維持了膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)特征，而且具有良好的表面活性，對蛋白類生物質(zhì)資源的高效利用具有良好的促進作用。利用同步熒光光譜技術(shù)考察CBS濃度、pH、NaCl濃度以及溫度對CBS在水溶液中構(gòu)象變化的影響。此外，以溫度為外擾，采用二維熒光光譜技術(shù)，研究CBS分子在溶液中的變化情況。

Fig.1 Structural scheme of CBS[9]

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)：阿拉丁生物試劑有限公司；Cary Eclipse熒光分光光度計：G9800A，美國Agillent Technology公司；超級恒溫槽：CH1006，上海衡平儀器廠。

1.2 方法及數(shù)據(jù)處理

1.2.1 CBS的制備

參照文獻[8]制備CBS海綿，并將其置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸同步熒光光譜

精確稱取一定質(zhì)量的Tyr和Phe分別溶解于0.1 mol·L-1的HCl和水中得到濃度為0.1 mmol·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液靜置除泡后，在20 ℃下，用熒光分光光度計以波長差(Δλ)為15 nm對樣品進行掃描，確立標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰的位置。波長掃描范圍為235～450 nm，狹縫寬度為5 nm。

1.2.3 CBS濃度對CBS聚集行為的影響

將CBS海綿溶于0.01 mol·L-1的PBS中(pH 7.4)得到濃度范圍為0.1～0.9 mg·mL-1的樣品溶液，濃度間隔0.1 mg·mL-1。在20 ℃下，用熒光分光光度計以Δλ=15 nm對樣品進行掃描，得到樣品的同步熒光光譜。

1.2.4 pH對CBS聚集行為的影響

將CBS溶液(0.4 mg·mL-1)的pH值調(diào)至3.0～9.0，pH間隔為1.0，考察不同pH值條件下CBS的同步熒光光譜。

1.2.5 離子強度對CBS聚集行為的影響

于0.4 mg·mL-1的CBS溶液(PBS, pH 7.4)中添加NaCl，使NaCl終濃度范圍為20～140 mmol·L-1，濃度間隔20 mmol·L-1，隨后以Δλ=15 nm測定CBS溶液的同步熒光光譜。

1.2.6 溫度對CBS聚集行為的影響

將0.4 mg·mL-1的CBS溶液(PBS，pH 7.4)置于超級恒溫槽中恒溫30 min，測定不同溫度下CBS溶液的同步熒光光譜，溫度范圍10～70 ℃，溫度間隔5 ℃。

1.2.7 二維同步熒光光譜

根據(jù)不同溫度下的CBS水溶液的同步熒光光譜數(shù)據(jù)，采用2Dshige軟件(Kwansei Gakuin)生成以溫度為外擾的CBS二維同步熒光相關(guān)光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸同步熒光光譜

雖然CBS分子沒有色氨酸殘基，但具有苯環(huán)的Tyr和Phe殘基可以作為研究CBS在溶液中聚集行為的內(nèi)源性分子探針。參照文獻[7]選取Δλ=15 nm，研究了Tyr和Phe標(biāo)準(zhǔn)品的同步熒光譜圖。從圖2中可以看出，在Δλ=15 nm時，Tyr和Phe分別在282和261 nm處出現(xiàn)尖的吸收峰。

Fig.2 Synchronous fluorescence spectra of Tyr and Phe

2.2 CBS濃度對CBS聚集行為的影響

圖3為CBS在Δλ=15 nm的同步熒光光譜圖。由圖可見，CBS在261和282 nm分別出現(xiàn)了屬于Phe和Tyr的吸收峰。隨著CBS濃度的升高，吸收峰不斷增強，表明CBS聚集程度逐漸增加。Shi等[10]認(rèn)為膠原聚集程度隨其濃度增大而增強的機理是隨著膠原濃度的增大，多肽鏈上的疏水氨基酸殘基的疏水作用逐漸取代電子間的相互排斥作用，同時肽鏈上的肽鍵參與氫鍵的形成，最終促進了膠原的聚集。因此，隨著CBS濃度的增加，具有疏水性的Phe殘基含量不斷增加并參與氫鍵的形成而生成疏水核，而具有親水性的Tyr殘基數(shù)量也逐漸增加，并在疏水核外部靠近形成大量氫鍵[11]，最終使CBS分子不斷聚集，從而導(dǎo)致吸收峰強度逐漸增強。

Fig.3 Synchronous fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity (b) of CBS under various concentrations 1 to 9 denoted to the concentration from 0.1 to 0.9 mg·mL-1

圖3(b)中可以看出，CBS濃度與其在261和282 nm的熒光強度呈線性關(guān)系，線性系數(shù)良好，表明在一定濃度范圍內(nèi)可利用同步熒光光譜技術(shù)對CBS進行定量檢測。

2.3 pH對CBS聚集行為的影響

圖4為pH對CBS熒光強度的影響。從圖4(a)中可以看出，CBS在261和282 nm處有吸收峰，且峰位置不隨pH值的變化而變化。在圖4(b)中可以看出，CBS的吸收峰強度隨pH值的升高，出現(xiàn)先增強而后降低的趨勢。在pH 5.0時，CBS的吸收峰最強，表明其聚集程度最大。Yan等[3]發(fā)現(xiàn)當(dāng)鱈魚皮膠原溶液的pH值接近膠原等電點時，其分子聚集能力最強。CBS等電點為4.93[8]，當(dāng)溶液pH值接近等電點時，分子間電荷排斥力最弱。此時，疏水作用增強，CBS分子大量聚集形成疏水核，Phe殘基聚集在疏水核內(nèi)部參與氫鍵形成，而Tyr殘基位于核外部并相互靠近形成氫鍵[11]，最終導(dǎo)致熒光強度增加。

Fig.4 Synchronous fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity (b) of CBS under different pH values

2.4 離子強度對CBS聚集行為的影響

NaCl濃度對CBS的熒光強度的影響如圖5(a)和(b)所示。從圖中可以看出，在261 nm處，吸收峰的峰強隨NaCl濃度的增大，總體呈現(xiàn)增加的趨勢，然而當(dāng)NaCl濃度大于60 mmol·mL-1時，Phe吸收峰強度又出現(xiàn)不規(guī)律的趨勢，可能是因為位于疏水核內(nèi)部的Phe殘基難以被激發(fā)造成的。在282 nm處，吸收峰強度隨NaCl濃度的增大而增大，這可能是由于CBS分子的電子篩選作用使分子間排斥力減弱[12]，導(dǎo)致CBS分子不斷聚集，Tyr殘基間的間距變短并形成相對穩(wěn)定的氫鍵[11]從而使其熒光增強。

Fig.5 Synchronous fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity (b) of CBS under various NaCl concentrations

Fig.6 Synchronous fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity (b) of CBS under different temperatures 1 to 13 denoted to the temperature of 10 to 70 ℃, temperature interval is 5 ℃

2.5 溫度對CBS聚集行為的影響

圖6為CBS在不同溫度下的同步熒光光譜。從圖6(a)中可以看出，CBS的吸收峰位置沒有出現(xiàn)任何變化。隨著溫度的升高，261和282 nm處的熒光強度呈下降的趨勢[圖6(b)]，且可分為3個階段：低溫區(qū)(10 ～30 ℃)，Tyr和Phe的熒光強度降低；中溫區(qū)(30～40 ℃)，CBS的疏水區(qū)域被破壞，CBS分子束開始松散，部分Phe和Tyr殘基間的氫鍵被破壞，因而熒光強度急劇下降，此階段也可認(rèn)為是CBS分子的變性階段；高溫區(qū)(40～70 ℃)，CBS完全變性，親水性增強，Tyr或Phe殘基間的氫鍵被大量破壞，使其熒光強度繼續(xù)降低。溫度升高，熒光基團與溶劑分子之間的碰撞猝滅機會增大，影響了熒光基團的電子躍遷，并導(dǎo)致熒光強度降低。

2.6 二維同步熒光光譜分析

根據(jù)2.5溫度對CBS聚集行為的影響可分為低溫區(qū)、中溫區(qū)和高溫區(qū)三個階段，因此，分別對三個溫度區(qū)間的熒光強度進行二維處理以便更深入了解溫度對CBS聚集行為的影響(如圖7所示)。圖7(a)，7(c)和7(e)分別為CBS在10～25，30～40和45～70 ℃的同步相關(guān)譜圖。同步相關(guān)譜圖中存在自相關(guān)峰和交叉峰[φ(V1，V2)]，自相關(guān)峰強弱代表微觀環(huán)境對分子微結(jié)構(gòu)運動的影響；交叉峰主要表明基團之間的協(xié)同作用[13]。改變溫度源自Phe和Tyr的261和282 nm的熒光強度在溶液中變化方向相同，均產(chǎn)生正的自相關(guān)峰。同時也出現(xiàn)了正的同步交叉峰(261，282)和(282，261)。在10～25 ℃時，CBS結(jié)構(gòu)未破壞，位于疏水核內(nèi)部的Phe殘基受溫度影響較大，對溫度更敏感，導(dǎo)致自相關(guān)峰(261，261)強度高于(282，282)處自相關(guān)峰；30～70 ℃時，CBS分子的三股螺旋結(jié)構(gòu)逐步轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲構(gòu)型，具有穩(wěn)定三股螺旋構(gòu)型的Tyr殘基間的氫鍵受溫度影響較大，對溫度更敏感，因此自相關(guān)峰(282，282)更強。

Fig.7 2D fluorescence spectra of CBS during varying temperature from 10～70 ℃(a), (c), (e): Synchronous spectra; (b), (d), (f): Asynchronous spectra; (a), (b): 10～25 ℃; (c), (d): 30～40 ℃; (d), (e): 45～70 ℃

圖7(b)，7(d)和7(f)分別是CBS在10～25，30～40和45～70 ℃的異步相關(guān)譜圖。異步相關(guān)譜圖中主要存在異步交叉峰[φ(V1，V2)]，它可輔助提供分子的基團變化的先后順序。在10～40 ℃中，(261，282)均出現(xiàn)正的交叉峰；而在45～70 ℃中，(261，282)卻出現(xiàn)負(fù)的交叉峰。根據(jù)Noda判斷規(guī)則[14]，CBS基團的變化順序如表1所示：在10～40 ℃下，261 nm(Phe殘基)優(yōu)先于282 nm(Tyr殘基)；45～70 ℃下，282 nm(Tyr殘基)優(yōu)先于261 nm(Phe殘基)。這可能是因為Phe殘基的熒光效率及其形成氫鍵的能力較Tyr殘基低，低溫時，CBS聚集體逐步松散，疏水核內(nèi)部的Phe殘基優(yōu)先響應(yīng)。而45～70 ℃時，CBS由單分子狀態(tài)水解為無規(guī)卷曲構(gòu)型，Tyr殘基的間距變大，不參與氫鍵的形成，導(dǎo)致Tyr殘基優(yōu)先響應(yīng)。

Table 1 Synchronous, asynchronous 2D correlation intensities and the order of intensity variations between two bands of CBS

a:ν1先于ν2指在升溫過程中，相對于ν2，ν1處的熒光強度值首先發(fā)生變化

3 結(jié) 論

采用同步熒光光譜技術(shù)研究CBS分子的聚集行為，發(fā)現(xiàn)其在261和282 nm處出現(xiàn)了Phe和Tyr的吸收峰。隨CBS和NaCl濃度的增大，CBS分子聚集體體積逐漸增大；當(dāng)CBS溶液pH值接近CBS等電點時，CBS聚集強度達到最大；然而，由于熒光效率降低和變性作用，溫度的升高卻降低了熒光強度。以溫度為外擾的二維同步熒光光譜分析技術(shù)可知，CBS基團的優(yōu)先順序為：在10～40 ℃下，Phe殘基優(yōu)先于Tyr殘基；而在45～70 ℃下，Tyr殘基優(yōu)先于Phe殘基。

[1] Li G, Fukunaga S, Takenouchi K. International Journal of Cosmetic Science, 2005, 27: 101.

[2] K?ster S, Evans H M, Wong J Y, et al. Biomacromolecules, 2008, 9: 199.

[3] Yan M, Li B, Zhao X, et al. Food Hydrocolloids, 2012, 29: 199.

[4] Williams B R, Gelman R A, Poppke D C, et al. Journal of Biological Chemistry, 1978, 253: 6578.

[5] Wu K, Liu W, Li G. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2013, 102: 192.

[6] Digambara Patra, Mishra A K. Trends in Analytical Chemistry, 2002, 21(12): 787.

[7] Li J, Li G. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 48: 364.

[8] Li C, Tian H, Duan L, et al. International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 57: 92.

[9] Li C, Liu W, Duan L, et al. Journal of Applied Polymer Science, 2014, 131: 40174.

[10] Shi X, Ma W, Sun C, et al. Biomaterials, 2001, 22: 1627.

[11] Pardrick S B, Miranker A D. J. Mol. Biol., 2001, 308: 783.

[12] Aewsiri T, Benjakul S, Visessanguan W, et al. Food and Bioprocess Technology, 2011, 6(3): 671.

[13] Tian H, Chen Y, Ding C, et al. Carbohydrate Polymers, 2012, 89: 542.

[14] Noda I. Applied Spectroscopy, 1993, 47: 1329.

*Corresponding author

Aggregation Behavior of Collagen-Based Surfactant Molecules in Aqueous Solutions Based on Synchronization Fluorescence Spectrum Technology

LI Cong-hu1, 2,, TIAN Zhen-hua1, LIU Wen-tao1, LI Guo-ying1*

1. The Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering of Ministry of Education, Sichuan University, Chengdu 610065, China

2. College of Life Sciences, Anqing Normal University, Anqing 246011, China

Due to the intrinsic fluorescence characteristic of tyrosine (Tyr) and phenylalanine (Phe), synchronization fluorescence spectrum technology which adopted the constant wavelength difference (Δλ=15 nm) was selected to investigate the effects of collagen-based surfactant (CBS) concentration, pH, NaCl concentration and temperature on the aggregation state of CBS molecules in aqueous solutions. Meanwhile, temperature-dependent two-dimensional (2D) synchronization fluorescence correlation analyses was used to investigate the variation order of Tyr and Phe residues in CBS molecules with the change of temperature. The results showed that the characteristic absorption peaks located at 261 and 282 nm were attributed to Phe and Tyr, respectively. With the increase of CBS concentration, the amount of Phe and Tyr residues increased gradually which resulted in the increase of aggregate degree of CBS molecules and then led to the increase of fluorescence intensity. When the pH value (pH 5.0) of CBS solutions was close to the isoelectric point of CBS, the aggregate degree of CBS molecules increased due to the increase of the hydrophobic interaction and the formation ability of hydrogen bond. Additionally, with the increase of NaCl concentration, the repulsion force for inter/intra-molecules of CBS decreased, which helped to improve the aggregation behavior of CBS molecules. However, with the increase of temperature, the aggregation state of CBS was changed to be monomolecular state, and then resulted in the decrease of the fluorescence intensity gradually due to the quenching, the denaturation and the decrease of hydrogen bond formation ability. Furthermore, temperature-dependent 2D synchronization fluorescence correlation spectroscopy demonstrated that at lower temperature (10～40 ℃), the aggregate state of CBS changed to be loose state and then Phe residues located in the inside of the aggregate varied before Tyr residues; while in the heating process of 45～70 ℃, the monomolecular state of CBS changed to be random coil conformation, the separation distance between Tyr residues increased and the hydrogen bond formation ability reduced strongly, which led to Tyr residues changed before Phe residues.

Collagen; Surfactant; Synchronous fluorescence spectroscopy；Two-dimensional correlation spectroscopy；Aggregation behavior

Sep. 30, 2014; accepted Dec. 18, 2014)

2014-09-30，

2014-12-18

國家自然科學(xué)基金項目(21276167；21076129) 資助

李從虎，1987年生，安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院講師 e-mail: lch87108@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: liguoyings@163.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)01-0151-06