楊立軍

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北承德 067000)

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基質(zhì)金屬蛋白酶-2及Bax在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義

楊立軍

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北承德 067000)

[摘要]目的觀察人腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和Bax的表達(dá)，并探討二者的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法收集該院人腦膠質(zhì)瘤患者腦組織標(biāo)本50例及腦創(chuàng)傷內(nèi)減壓術(shù)中切除的腦組織標(biāo)本20例，采用Western blot和免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定腦組織中MMP-2和Bax的表達(dá)，并探討二者在膠質(zhì)瘤中的相關(guān)性。結(jié)果MMP-2在膠質(zhì)瘤腦組織中的表達(dá)高于正常腦組織(P<0.05)，在膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ級(jí)中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為26.92%，70.83%(P<0.05)；Bax在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)量低于正常腦組織，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ級(jí)中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.95%、25.0%(P<0.05)。且人腦膠質(zhì)瘤中MMP-2和Bax的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.587，P<0.01)。結(jié)論Bax蛋白表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起著抑制作用，且與MMP-2蛋白呈負(fù)相關(guān)，二者聯(lián)合檢測(cè)可為膠質(zhì)瘤的診斷提供判斷指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]人腦膠質(zhì)瘤；基質(zhì)金屬蛋白酶；Bax

膠質(zhì)瘤(glioma)是人顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，占據(jù)顱腦腫瘤的35%～60%左右，呈侵襲性生長(zhǎng)，其手術(shù)切除復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差[1-2]。盡管隨著神經(jīng)外科手術(shù)治療、基因治療、免疫治療及各種化療放療技術(shù)的發(fā)展，膠質(zhì)瘤仍不能被完全治愈，其預(yù)后生存期不到1年[3]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞無(wú)限制的惡性增殖是導(dǎo)致機(jī)體惡病質(zhì)的主要原因，而遷移、侵襲則是膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，是引起病情惡化的主要因素，因此探討針對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)相關(guān)蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)具有重要意義[4]。Bax是目前公認(rèn)的參與細(xì)胞凋亡調(diào)控作用的最常見(jiàn)抑癌蛋白，是線粒體膜上的一種促凋亡蛋白，在多種腫瘤中低表達(dá)，且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而與膠質(zhì)瘤的關(guān)系報(bào)道較少[5]。同時(shí)金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解可促進(jìn)癌細(xì)胞對(duì)周?chē)M織的浸潤(rùn)，MMP-2能降解血管基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原成分，使腫瘤細(xì)胞突破結(jié)構(gòu)屏障，與腫瘤內(nèi)血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此本研究應(yīng)用Western blot和免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接染色法(SP)測(cè)定人腦膠質(zhì)瘤腦組織中MMP-2和Bax的表達(dá)，探討二者與人腦膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性，為人腦膠質(zhì)瘤的臨床治療和預(yù)后提供判斷指標(biāo)。

1資料與方法

1.1材料收集本院外科手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本50例，其中男29例，女21例，平均年齡35歲，按WHO 2000年神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，50例標(biāo)本分為Ⅰ級(jí)11例，Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ級(jí)9例，Ⅳ級(jí)15例。另取20例腦創(chuàng)傷內(nèi)減壓術(shù)中切除的腦組織標(biāo)本作為正常對(duì)照。腫瘤組織均經(jīng)活組織病理診斷證實(shí)，均為單一腫瘤，無(wú)并發(fā)肝、腎疾病，均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2主要試劑兔抗人MMP-2，Bax單克隆抗體購(gòu)自Epitomics公司，SP法免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，ECL超敏發(fā)光試劑盒，BCA試劑盒，RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物研究所。

1.3Western blot測(cè)定腦組織中MMP-2和Bax的表達(dá)RIPA裂解液裂解組織并收獲蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。蛋白樣品上樣，十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠電泳2～3 h，濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。一抗孵育，4 ℃過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次5 min；二抗室溫孵育1～2 h。漂洗3次，每次5 min，滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity One”軟件對(duì)各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定腦組織中MMP-2和Bax的表達(dá)10%甲醛溶液固定組織，石蠟包埋，切片，抗原修復(fù)，室溫冷卻30 min，PBS沖洗2次，一抗室溫孵育，PBS沖洗2次，二抗(1∶100)37 ℃孵育，PS洗滌2次，DAB溶液顯色后沖洗、復(fù)染、脫水、透明、樹(shù)膠封片。以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.5結(jié)果判斷MMP-2和Bax蛋白染色陽(yáng)性主要定位于細(xì)胞質(zhì)，采用半定量計(jì)分法判定，高倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，分別計(jì)算500個(gè)腫瘤細(xì)胞。切片中陽(yáng)性細(xì)胞小于5%為0分，6%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，≥75%為4分；染色深度以無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色或棕褐色為3分，免疫反應(yīng)的總得分為陽(yáng)性細(xì)胞百分率與免疫染色強(qiáng)度總得分的乘積。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，Western blot結(jié)果采用t檢驗(yàn)，免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)MMP-2和Bax在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達(dá)MMP-2在正常腦組織中不表達(dá)，在人腦膠質(zhì)瘤中陽(yáng)性表達(dá)率為64.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Bax在正常腦組織中及人腦膠質(zhì)瘤中陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.0%及54.0%，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1，圖1、圖2。

A：正常腦組織，B：腦膠質(zhì)瘤腦組織。

圖1MMP-2在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達(dá)(×200)

2.2Western blot檢測(cè)MMP-2和Bax在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達(dá)MMP-2在正常腦組織中和腦膠質(zhì)瘤腦組織中蛋白灰度值分別為(0.09±0.00)及(1.58±0.31)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2、圖3。Bax在正常腦組織中和腦膠質(zhì)瘤腦組織中蛋白灰度值分別為(2.34±0.29)及(2.19±0.29)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2、圖4。

A：正常腦組織，B：腦膠質(zhì)瘤腦組織。

圖2Bax在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達(dá)(×200)

表1　MMP-2和Bax在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達(dá)[n(%)]

**:P<0.01,與正常腦組織比較。

圖3　Western blot檢測(cè)MMP-2在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達(dá)

圖4　Western blot檢測(cè)Bax在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達(dá)

表2　MMP-2和Bax在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中表達(dá)的相對(duì)值

**：P<0.01，與正常腦組織比較。

2.3免疫組化檢測(cè)MMP-2和Bax在各種類(lèi)型腦組織中的表達(dá)MMP-2在Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的陽(yáng)性率分別為26.92%，70.83%；Bax在Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的陽(yáng)性率分別為76.95%，25.0%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖5、圖6、表3。推測(cè)Bax在膠質(zhì)瘤中起抑制作用，MMP-2在膠質(zhì)瘤起促進(jìn)作用。

A：Ⅰ～Ⅱ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織，B：Ⅲ～Ⅳ腦膠質(zhì)瘤組織。

圖5免疫組化檢測(cè)MMP-2在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤腦組織中的表達(dá)(×100)

2.4MMP-2和Bax表達(dá)的相關(guān)性經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，人腦膠質(zhì)瘤腦組織中MMP-2和Bax表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.587，P<0.01)。

A：Ⅰ～Ⅱ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織，B：Ⅲ～Ⅳ腦膠質(zhì)瘤組織(×200)。

圖6免疫組化檢測(cè)Bax在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤腦組織中的表達(dá)

表3　免疫組化檢測(cè)MMP-2和Bax在各種類(lèi)型腦組織中的表達(dá)[n(%)]

**：P<0.01，與Ⅰ～Ⅱ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織比較。

3討論

膠質(zhì)細(xì)胞瘤是起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤，是顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的正常凋亡過(guò)程被抑制，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞持續(xù)不斷地進(jìn)行分裂與增殖。同時(shí)已有研究證實(shí)在腫瘤中檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)可成為腫瘤診斷和預(yù)后判斷的有效手段[6]。其中Bcl-2家族是被研究得最多的一類(lèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因。Bax是Bcl-2家族中促凋亡基因，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)過(guò)多，與Bax形成二聚體，使膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡趨勢(shì)減弱，打破了細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，使細(xì)胞數(shù)目不斷增加，從而表現(xiàn)出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，成為膠質(zhì)瘤形成的重要基礎(chǔ)。因而探討B(tài)ax在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)具有重要意義，所以本試驗(yàn)通過(guò)Western blot和免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Bax在人腦膠質(zhì)瘤腦組織中表達(dá)低于正常組織，雖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有一定趨勢(shì)。而與Bax在其他腫瘤中的低表達(dá)具有顯著性差異不同，可能是由于檢測(cè)的樣本不同，組織來(lái)源不同，樣本的年齡、性別差異有關(guān)。林英等[7]的研究顯示：在Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ級(jí)人膠質(zhì)瘤中，Bax的表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率逐漸下降。本實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了此觀點(diǎn)，但隨著病理分級(jí)的提高，其表達(dá)量也逐漸下降。說(shuō)明隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的升高，Bax表達(dá)量下降，Bax含量能一定程度上反映膠質(zhì)瘤的惡性程度。同時(shí)進(jìn)一步結(jié)合已報(bào)道文獻(xiàn)：在組織特異性啟動(dòng)子和缺氧誘導(dǎo)元件的調(diào)控下Bax的過(guò)表達(dá)是針對(duì)膠質(zhì)瘤的有效基因治療手段[8]。Tra-8 抗人DR2單抗聯(lián)合Bax過(guò)表達(dá)能顯著抑制體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及體內(nèi)U251細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)[9]。說(shuō)明膠質(zhì)瘤中Bax的過(guò)表達(dá)能顯著誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤凋亡。進(jìn)一步腺病毒轉(zhuǎn)染Bax到D54 MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合化療能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及克隆生長(zhǎng)[10]。說(shuō)明膠質(zhì)瘤中Bax的過(guò)表達(dá)能提高化療的敏感性，進(jìn)一步刺激膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。從而說(shuō)明Bax在膠質(zhì)瘤中起抑制作用，當(dāng)其過(guò)表達(dá)有可能可以提高化療的敏感性或直接抑制膠質(zhì)瘤的增殖。

膠質(zhì)瘤的侵襲性是膠質(zhì)瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，可以使膠質(zhì)瘤邊界模糊，給手術(shù)帶來(lái)困難，是患者腫瘤復(fù)發(fā)，治療困難，預(yù)后欠佳的主要原因。在膠質(zhì)瘤侵襲過(guò)程中，瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)表面受體結(jié)合后誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生MMPs，局部降解細(xì)胞外基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞通過(guò)缺失的細(xì)胞外基質(zhì)向周?chē)M織浸潤(rùn)，產(chǎn)生腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。其中MMP-2不僅可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的明膠Ⅳ型膠原等，有利于膠質(zhì)瘤細(xì)胞沿著受損的基底膜向周?chē)?rùn)，還可以通過(guò)新生毛細(xì)血管促進(jìn)膠質(zhì)瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，是惡性膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)和侵襲的標(biāo)志。因而探討MMP-2在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)具有重要意義，所以本試驗(yàn)通過(guò)Western blot和免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MMP-2在人腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)高于正常組織，與吳紅芳等[11]，Sun等[12]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明MMP-2與膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)。本文研究中亦發(fā)現(xiàn)Ⅲ～Ⅳ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤腦組織中MMP-2顯著高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)，且其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與陳廣等[13]，Kong等[14]的試驗(yàn)結(jié)果一致：MMP-2蛋白及mRNA在Ⅲ～Ⅳ級(jí)中的表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)，與膠質(zhì)瘤的惡性程度及進(jìn)展呈正相關(guān)。說(shuō)明MMP-2跟人腦膠質(zhì)瘤病理分級(jí)有一定關(guān)系。同時(shí)Kesanakurti等[15]的研究證實(shí)具有侵襲性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌大量的MMP-2，其侵襲能力，膠質(zhì)瘤惡性程度與MMP-2的表達(dá)量呈正相關(guān)。且有研究證實(shí)通過(guò)siRNA干擾MMP-2的表達(dá)，能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力[16]。從而說(shuō)明MMP-2在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用，并與膠質(zhì)瘤的高侵襲能力密切相關(guān)，抑制MMP-2表達(dá)可能一定程度上遏制膠質(zhì)瘤的侵襲程度。

同時(shí)在本研究中，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，人膠質(zhì)瘤腦組織中MMP-2和Bax表達(dá)負(fù)相關(guān)，結(jié)合已報(bào)道的Bax及MMP-2啟動(dòng)子共轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞SNU475中，可顯著促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡并抑制癌細(xì)胞侵襲[17]。推測(cè)出使Bax過(guò)表達(dá)及MMP-2低表達(dá)并轉(zhuǎn)染到體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中可一定程度上遏制膠質(zhì)瘤的增殖及侵襲。

綜上所述，Bax在人腦膠質(zhì)瘤中起抑制作用，MMP-2在人腦膠質(zhì)瘤中起促進(jìn)作用，二者都是判斷膠質(zhì)瘤惡性程度，病理分級(jí)的有效指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)或靶向治療可一定程度上改善膠質(zhì)瘤的惡性程度。

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doi:·經(jīng)驗(yàn)交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.023

作者簡(jiǎn)介：楊立軍(1968-),學(xué)士，副主任醫(yī)師,主要從事顱內(nèi)腫瘤研究。

[中圖分類(lèi)號(hào)]R739.4

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)08-1074-04

(收稿日期：2015-09-30修回日期：2015-11-26)