許春艷，孫晶

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泰山磐石散對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠母胎界面Th1/Th2細(xì)胞因子及妊娠預(yù)后的影響

許春艷，孫晶

【摘要】目的：觀察泰山磐石散對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠母胎界面Th1/Th2細(xì)胞因子及妊娠預(yù)后的影響，為泰山磐石散臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：采用經(jīng)典造模方式DBA/2小鼠與CBA/J雜交，獲得復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠模型，隨機(jī)將與DBA/2小鼠合籠的60只CBA/J妊娠小鼠分為模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組和陽性對照組；與BALB/C合籠的10只CBA/J孕鼠作為正常妊娠模型。于妊娠14 d后處死孕鼠，觀察小鼠胎盤丟失情況，并提取培養(yǎng)胎界母細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞上清液，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測上清液中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、γ干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素4（IL-4）和IL-10含量。結(jié)果：經(jīng)泰山磐石散治療后，與模型組比較，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠胎盤丟失率明顯改善，母胎界面細(xì)胞上清液中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ明顯降低，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10明顯升高，Th1/Th2免疫調(diào)節(jié)失衡明顯改善，以中藥高劑量組改善最為明顯。結(jié)論：泰山磐石散能改善復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠胎盤丟失情況，其具體機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫調(diào)節(jié)平衡實(shí)現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】泰山磐石散；流產(chǎn)，習(xí)慣性；細(xì)胞因子類；Th1細(xì)胞；Th2細(xì)胞

作者單位：110032沈陽，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

（J Int Obstet Gynecol，2016，43：214-216）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次及3次以上的自然流產(chǎn)，但大多數(shù)專家認(rèn)為連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)即應(yīng)重視并予評估［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為RSA主要病因有內(nèi)分泌因素、生殖器官異常、遺傳因素和感染因素等，但還有大部分患者原因不明，目前研究認(rèn)為免疫學(xué)因素為主要因素之一［2］。中醫(yī)學(xué)并無此病名，將其歸屬于“滑胎”、“胎漏”等研究范疇，多認(rèn)為沖任虛損、胎元不固為主要發(fā)病機(jī)制［3］。泰山磐石散出自《景岳全書》，為治療本病的常用方藥之一，本研究觀察本方對RSA小鼠妊娠預(yù)后及Th1/Th2的影響，為臨床用藥提供新的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物SPF級健康DBA/2雄性小鼠25只，BALB/C雄性小鼠5只，CBA/J雌性小鼠60只，8～10周齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物合格證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心，自由攝食予飲水。

1.1.2試劑和儀器腫瘤壞死因子α（TNF-α）、γ干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素4（IL-4）、IL-10酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱：美國，Thermo；酶標(biāo)儀：奧地利，Anthos2010。

1.1.3藥物泰山磐石散由人參3 g、炒當(dāng)歸3 g、白芍3 g、熟地3 g、續(xù)斷3 g、黃芩3 g、黃芪6 g、白術(shù)6 g、糯米6 g、炙甘草2 g、砂仁2 g組成，全部藥物均購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。1.2方法

1.2.1造模于前1晚將CBA/J雌性小鼠（60只）分別與DBA/2（25只）和BALB/C（5只）雄性小鼠合籠，雌雄比為2∶1，次日早晨行陰道涂片和陰栓檢查，檢查陽性者標(biāo)記為妊娠第1天，分別建立正常懷孕和自然流產(chǎn)模型，檢出孕14 d后處死小鼠。

1.2.2分組、給藥及取材與BALB/C合籠的10只CBA/J孕鼠作為正常懷孕模型；與DBA/2合籠的50只CBA/J孕鼠作為自然流產(chǎn)模型。10只CBA/J正常懷孕模型孕鼠作為正常組，50只CBA/J自然流產(chǎn)模型孕鼠按受孕時間先后分別分為模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組和陽性對照組。按照人與動物體表面積換算給藥，各組按如下方式處理：中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組分別給予泰山磐石散3.43 g/kg、6.86 g/kg、13.71 g/kg灌胃，2次/d；陽性對照組給予黃體酮注射液2 mg/kg腹腔注射，1次/d；正常組、模型組、陽性對照組分別給予等量生理鹽水灌胃。各組小鼠分別在孕第1天開始給藥。

1.3檢測指標(biāo)及方法

1.3.1胎盤丟失率于孕第14天，處死孕鼠，觀察胎盤是否有體積變小和出現(xiàn)組織缺血壞死，若出現(xiàn)上述情況記為胎盤丟失。胎盤丟失率=丟失胎盤數(shù)/總胎盤數(shù)×100%。

1.3.2ELISA法測定母胎界面細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10表達(dá)水平于孕第14天，處死孕鼠，無菌操作下，打開腹腔，剝離子宮，將胎盤連同蛻膜與子宮分離，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，研磨胎盤與蛻膜組織，PBS沖洗，過細(xì)胞篩，制成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×106/mL，取2 mL 置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)上清液［4］。ELISA檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3.3Th1型/Th2型免疫調(diào)節(jié)平衡指數(shù)以IFN-γ代表Th1型免疫調(diào)節(jié)，IL-4代表Th2型免疫調(diào)節(jié)，計算IL-4/IFN-γ比值，代表Th1型/Th2型免疫調(diào)節(jié)平衡指數(shù)，當(dāng)比值大于1時，表明免疫調(diào)節(jié)平衡向Th2偏移，反之向Th1偏移［5］。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正常組與模型組比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，模型組與中藥不同劑量組比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，陽性對照組與中藥高劑量組比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。定性資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠胎盤丟失率孕14 d后觀察小鼠胚胎吸收情況，模型組胎盤丟失率高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.69，P＜0.01）；中藥低、中、高劑量組和陽性對照組與模型組比較，胎盤丟失率也降低（χ2分別為3.26，3.18，2.66和4.97，P＜0.05）；而中藥高劑量組與陽性對照組的胎盤丟失率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.85，P＞0.05）。見表1。

表1　各組小鼠胎盤丟失率比較

2.2各組小鼠孕14 d母胎界面細(xì)胞Th1型/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)及免疫調(diào)節(jié)平衡情況各組小鼠孕14 d后，與正常組比較，模型組小鼠母胎界面細(xì)胞上清液中Th1型細(xì)胞因子升高（P＜0.01），Th2型細(xì)胞因子降低（P＜0.01）；而與模型組比較，中藥中、高劑量組小鼠母胎界面細(xì)胞上清液中Th1型細(xì)胞因子中IFN-γ降低（P=0.000），中藥低、中、高劑量組Th2型細(xì)胞因子升高（P＜0.05或P＜0.01），以中藥高劑量組最為明顯。中藥高劑量組與陽性對照組間比較，各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

各組小鼠孕14 d后，與正常組比較，模型組小鼠免疫調(diào)節(jié)平衡明顯向Th1型偏移，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；經(jīng)治療后，與模型組比較，中藥不同劑量組免疫調(diào)節(jié)平衡均有不同程度向Th2型偏移（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

3　討論

RSA為婦產(chǎn)科常見疾病之一，目前研究認(rèn)為，免疫因素為較為普遍的因素，占總體發(fā)病因素的50%以上［6］。近年來，Th1/Th2型細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)失衡成為RSA病因的研究熱點(diǎn)。本研究選用經(jīng)典的DBA/2小鼠與CBA/J雜交，獲得RSA小鼠模型，觀察泰山磐石散對RSA Th1/Th2型細(xì)胞因子的影響，為臨床治療提供新的理論依據(jù)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病屬于“滑胎”研究范疇，認(rèn)為脾腎虛弱、沖任不固、氣血虛弱為主要病因病機(jī)，治療多采用補(bǔ)腎益氣養(yǎng)血、固沖安胎［7］。泰山磐石散為治療本病的主要方劑之一，諸多古籍對其均有記載，如《醫(yī)統(tǒng)》卷八十五中記載，泰山磐石散又名安胎散，主治婦人氣血兩虛，身體素弱，或肥而不實(shí)，或瘦而血熱，或脾胃少食倦怠，素有墮胎之患；《胎產(chǎn)心法》中記載“凡墮胎之病多在三五七月，如前次三月曾墮，后必如期乘其所虛而亦墮，必預(yù)服尊生安胎飲，或胎元飲加減用之，或泰山磐石散、安胎萬全神應(yīng)散等方，對證擇用以預(yù)防之。”

表2　各組小鼠母胎界面細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1型/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)情況?。ā纒）

表2　各組小鼠母胎界面細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1型/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)情況?。ā纒）

注：t1（P）為正常組與模型組比較；t2（P）為中藥高劑量組與陽性對照組比較；F（P）為模型組與中藥不同劑量組比較。

組別　n　Th1　Th2　IL-4/IFN-γ IFN-γ（ng/L）　TNF-α（μg/L）　IL-4（μg/L）　IL-10（μg/L）正常組①　10　34.00±4.18　19.84±2.46　101.42±5.09　64.33±5.13　3.03±0.48模型組②　10　95.42±9.08　33.61±2.76　34.45±4.92　29.26±1.99　0.37±0.07 t1（P）　-13.96（0.000）　-8.90（0.000）　22.93（0.000）　16.67（0.000）　12.32（0.000）中藥低劑量組③　10　56.35±6.54　24.09±2.61　64.82±5.80　36.28±4.19　1.16±0.13中藥中劑量組④　10　49.30±7.34　23.05±1.78　79.21±3.74　42.99±5.25　1.63±0.21中藥高劑量組⑤　10　42.06±2.90　24.07±4.26　86.41±8.23　56.14±5.39　2.07±0.31 F（P）　9.198（0.002）　0.207（0.816）　16.849（0.000）　24.423（0.000）　20.678（0.000）組間比t（P）②∶③　1.67（0.130）　-　-4.99（0.001）　-2.30（0.047）　-4.28（0.002）②∶④　5.18（0.000）　-　-5.01（0.001）　-6.86（0.000）　-6.08（0.000）②∶⑤　6.63（0.000）　-　-9.11（0.000）　-6.35（0.000）　-7.51（0.000）陽性對照組⑥　10　39.38±5.98　23.38±2.58　88.29±6.23　62.41±8.41　2.12±0.40 t2（P）　3.27（0.210）　0.37（0.720）　-3.34（0.831）　-1.66（0.123）　-3.14（0.173）

Th1/Th2平衡對于維持正常的妊娠具有重要意義，既往研究認(rèn)為，正常妊娠是一種特殊的Th2現(xiàn)象，當(dāng)Th1/Th2平衡偏向Th1，則會導(dǎo)致RSA的發(fā)生。Th1型細(xì)胞主要分泌IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子，在抗感染等發(fā)面發(fā)揮重要作用，在妊娠過程中，Th1型細(xì)胞對滋養(yǎng)層細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用而形成免疫損傷，影響胚胎著床，甚至導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生；Th2型細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子，在妊娠過程中，Th2細(xì)胞可維持母胎界面的免疫耐受［8］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)泰山磐石散治療后，RSA小鼠胎盤丟失率明顯改善，與模型組比較，母胎界面細(xì)胞上清液中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ降低，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10升高，免疫調(diào)節(jié)平衡向Th1型偏移。本研究還表明，泰山磐石散對治療RSA具有顯著療效，以中藥高劑量效果最為明顯，且與陽性對照藥物比較，療效相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明泰山磐石散對RSA作用效果顯著，這與既往研究結(jié)果相一致［9］。其療效可能是通過調(diào)節(jié)Th1/ Th2型免疫調(diào)節(jié)平衡來實(shí)現(xiàn)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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［本文編輯秦娟］

產(chǎn)科生理及產(chǎn)科疾病

·綜述·

Influence of Taishan Panshi San to Recurrent Spontaneous Abortion Mouse Maternal-fetal Interface Th1/Th2 Cytokines and Pregnancy Prognosis

XU Chun-yan，SUN Jing. Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China

【Abstract】Objective：To investigate the effects of Taishan Panshi San on the maternal-fetal interface Th1/Th2 cytokines and pregnancy outcomes of recurrent abortion mouse，to provide a new experimental basis for clinical application of Taishan Panshi San. Methods：Classic modeling approach DBA/2 mice CBA/J hybridization，get recurrent abortion mouse models，60 CBA/J mice that randomly caged with DBA/2 mice were divided into model group pregnancy，low Chinese medicine dose group，middle Chinese medicine dose group，high Chinese medicine dose group and positive control group；10 pregnant CBA/J mice mated with BALB/C as a normal pregnancy. 14 days after pregnancy pregnant rats were sacrificed to observe the mouse placenta′s missing，and to extract oocytes cultured fetal community，24 hours latter cell supernatants were collected，Elisa assay supernatant TNF-α，IFN-γ，IL-4，IL-10 content. Results：Compare with model group，the recurrent miscarriage mouse placenta loss ratio was significantly improved after treated with Taishan Panshi San，cytokine Th1 and IFN-γ were significantly decreased in cell supernatants of mother-fetal bound，Th2 cytokines IL-4 and IL-10 were significantly increased，Th1/Th2 immunoregulatory imbalance improved significantly，the high dose Chinese tradition medicine group was the most obvious. Conclusions：Taishan Panshi San can significantly improve the placenta lost situation of recurrent abortion mouse，the specific mechanism may be achieved by adjusting the balance of Th1/Th2 immune regulation.

【Keywords】TAISHAN PANSHI POWDERS；Abortion，habitual；Cytokines；Th1 cells；Th2 cells

基金項(xiàng)目：沈陽市科技創(chuàng)新專項(xiàng)資金應(yīng)用基礎(chǔ)研究專項(xiàng)（F14-231-1-15）

通信作者：孫晶，E-mail：sunjing790825@126.com

Corresponding author：SUN Jing，E-mail：sunjing790825@126.com

收稿日期：（2015-09-26）