賈莉婷，張玉超，李　靜，張琳琳，田　遠(yuǎn)，于海洋，榮守華，邢金芳，李君芳，馬嘯天

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052

miR-200c對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響>*

賈莉婷△，張玉超，李靜，張琳琳，田遠(yuǎn)，于海洋，榮守華，邢金芳，李君芳，馬嘯天

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052

△女，1958年11月生，本科，教授，研究方向：臨床免疫學(xué)，E-mail：jialt@163.com

關(guān)鍵詞三陰性乳腺癌；miR-200c；Slug；E-cadherin；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

摘要目的：探討miR-200c對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。方法：選取三陰性人乳腺癌細(xì)胞系BT549、MDA-MB-231和非三陰性人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、SK-BR-3為研究對(duì)象，各細(xì)胞系按轉(zhuǎn)染情況分為A組(miR-200c模擬物/Lipo2000組)、B組(miR-200c陰性對(duì)照物/Lipo2000組)、C組(miR陰性對(duì)照物/Lipo2000組)、D組(Lipo2000組)、E組(空白對(duì)照組)。分別提取各組細(xì)胞的總RNA和蛋白，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Slug和E-cadherin mRNA表達(dá)水平，通過(guò)Western blot檢測(cè)Slug和E-cadherin蛋白表達(dá)水平。采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BT549和MDA-MB-231的遷移能力。結(jié)果：三陰性細(xì)胞系與非三陰性細(xì)胞系相比，E組Slug、E-cadherin在mRNA與蛋白水平的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-200c后，三陰性細(xì)胞系BT549、MDA-MB-231 Slug在mRNA和蛋白水平表達(dá)量均降低(P<0.05)，E-cadherin在mRNA和蛋白水平表達(dá)量均增高(P<0.05)，細(xì)胞遷移能力下降(P<0.05)。結(jié)論：miR-200c可通過(guò)下調(diào)三陰性乳腺癌細(xì)胞系Slug的表達(dá)，進(jìn)而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低細(xì)胞遷移能力。

三陰性乳腺癌發(fā)病年齡早、預(yù)后差、極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程。E-cadherin丟失是EMT的最主要特征，對(duì)預(yù)測(cè)乳腺癌轉(zhuǎn)移具有較高特異性[1-3]，它的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子Slug的靶向調(diào)控。miR-200c在調(diào)節(jié)乳腺癌浸潤(rùn)、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，是目前研究乳腺癌EMT的熱點(diǎn)[4-6]。迄今，僅有作者所在的課題組[7]對(duì)三陰性細(xì)胞系BT549 轉(zhuǎn)染miR-200c用于研究Slug調(diào)控EMT機(jī)制的報(bào)道，由于乳腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病，在其他細(xì)胞系中miR-200c是否通過(guò)上述途徑調(diào)控EMT尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究選用三陰性細(xì)胞系和非三陰性細(xì)胞系，觀察轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物后不同細(xì)胞系Slug和E-cadherin在mRNA、蛋白水平的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響，探討miR-200c對(duì)三陰性乳腺癌EMT的調(diào)節(jié)作用，以期為臨床診治三陰性乳腺癌提供新的靶標(biāo)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系BT549 由鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院科研中心保存，MDA-MB-231由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，MCF-7和SK-BR-3由河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤表觀遺傳實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。各株細(xì)胞特征及分離來(lái)源見(jiàn)表1。

表1　4株人乳腺癌細(xì)胞系的生物學(xué)特征

*：源自www.microrna.org。

1.1.2主要試劑和儀器Slug、E-cadherin、GAPDH基因上下游引物和miR-200c模擬物由廣州銳博公司設(shè)計(jì)和合成，miR陰性對(duì)照物購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，兔抗人Slug一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗人E-cadherin一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑、鼠抗人β-actin一抗、羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗均購(gòu)自北京鼎國(guó)公司。逆轉(zhuǎn)錄儀器和擴(kuò)增儀器均為美國(guó)Life公司產(chǎn)品，CLX Odyssey掃描儀為美國(guó)Li-Cor公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)所有細(xì)胞均用含雙抗(青霉素、鏈霉素)和體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞分別按每孔1×105個(gè)或3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板后進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)75%左右，參照Lipo2000說(shuō)明書(shū)，按轉(zhuǎn)染物不同分為：miR-200c模擬物/Lipo2000組(A組)、miR-200c陰性對(duì)照物/Lipo2000組(B組，目的是針對(duì)性地排除miR-200c模擬物分子片段對(duì)細(xì)胞的影響)、miR陰性對(duì)照物/Lipo2000組(C組，目的是作為陰性對(duì)照)，終濃度均為50 nmol/L，同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染等量Lipo2000的試劑對(duì)照組(D組)和不做任何處理的空白對(duì)照組(E組)。

1.4各組細(xì)胞中Slug和E-cadherin mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)待細(xì)胞融合度達(dá)90%以上，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR體系為20 μL，Slug、E-cadherin和GAPDH引物序列同之前研究[7]。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法對(duì)目標(biāo)因子進(jìn)行相對(duì)定量分析，設(shè)E組Slug和E-cadherin mRNA的表達(dá)量為1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6三陰性細(xì)胞遷移能力的劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)將BT549和MDA-MB-231按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度均勻接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后更換為不含抗體培養(yǎng)基，用Lipo2000對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。12 h后，用高壓滅菌的槍頭對(duì)各組細(xì)胞劃平行直線，無(wú)菌PBS清洗2遍后，用2 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0、12、24、36 h觀察各組細(xì)胞3個(gè)視野的劃痕寬度，通過(guò)Image Pro Plus 6.0計(jì)算劃痕寬度。劃痕寬度恢復(fù)率=(0 h劃痕寬度-36 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%，以劃痕寬度恢復(fù)率表示細(xì)胞遷移能力強(qiáng)弱。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間Slug、E-cadherin mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量及劃痕寬度恢復(fù)率的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1E組Slug、E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)量各株細(xì)胞系Slug、E-cadherin的基礎(chǔ)表達(dá)量見(jiàn)圖1、表2。

2.2miR-200c對(duì)不同細(xì)胞系Slug、E-cadherin表達(dá)的影響各組細(xì)胞中Slug和E-cadherin的表達(dá)量見(jiàn)表3、4，其中三陰性細(xì)胞系的Slug蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖2。

1:MCF-7;2:BT549;3:SK-BR-3;4:MDA-MB-231。圖1　E組Slug、E-cadherin的蛋白表達(dá)情況

細(xì)胞系SlugmRNA蛋白E-cadherinmRNA蛋白BT5491.00±0.01*11.09±0.94*1.00±0.01#1.57±0.40*MDA-MB-2310.78±0.08*12.27±2.15*0.93±0.06#2.37±0.47*MCF-70.41±0.110.38±0.031.35±0.0749.43±3.60#SK-BR-30.19±0.080.42±0.101.80±0.5329.27±3.42F65.65292.7216.570255.640P<0.001<0.0010.015<0.001

*：與MCF-7、SK-BR-3比較，P<0.05；#：與SK-BR-3比較，P<0.05。

表3　miR-200c對(duì)不同細(xì)胞系 Slug和E-cadherin mRNA表達(dá)水平的影響(n=3)

*：與B組、C組、D組、E組相比，P<0.05。

表4　miR-200c對(duì)不同細(xì)胞系Slug和E-cadherin蛋白表達(dá)水平的影響(n=3)

*：與B組、C組、D組、E組相比，P<0.05。

圖2　miR-200c對(duì)三陰性細(xì)胞系Slug蛋白表達(dá)的影響

2.3miR-200c對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響三陰性細(xì)胞系0、12、24、36 h的劃痕寬度恢復(fù)率見(jiàn)圖3，其中36 h的劃痕寬度恢復(fù)率見(jiàn)表5。

左：BT549；右：MDA-MB-231。圖3　不同時(shí)間點(diǎn)三陰性細(xì)胞系劃痕寬度恢復(fù)率

%

*：與B組、C組、D組、E組相比，P<0.05。

3討論

目前多數(shù)研究[8-10]報(bào)道EMT及其調(diào)控因子是治療三陰性乳腺癌的主要靶標(biāo)。Liu等[11]發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)率高、易轉(zhuǎn)移的患者中，Slug高表達(dá)和E-cadherin低表達(dá)的比例均為63.4%；Adhikary等[12]發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制Slug的表達(dá)或E-cadherin的降解，可上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，有效抑制EMT。該研究結(jié)果顯示，三陰性細(xì)胞系基礎(chǔ)表達(dá)量與非三陰性細(xì)胞系相比，Slug高表達(dá)、E-cadherin低表達(dá)，與文獻(xiàn)[11-13]報(bào)道一致，表明Slug、E-cadherin的表達(dá)高低與三陰性癌細(xì)胞的易轉(zhuǎn)移性直接相關(guān)。

前期該課題組[7]僅對(duì)三陰性細(xì)胞系BT549進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物之后其Slug mRNA和蛋白表達(dá)量均下降，E-cadherin mRNA表達(dá)量上升，且該組細(xì)胞侵襲、遷移能力均被抑制。該研究在BT549基礎(chǔ)上，增加了三陰性細(xì)胞系MDA-MB-231及兩株非三陰性細(xì)胞系MCF-7、SK-BR-3為研究對(duì)象，對(duì)不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-200模擬物，結(jié)果表明與非三陰性細(xì)胞系相比，兩株三陰性細(xì)胞的Slug mRNA與蛋白表達(dá)均明顯降低，E-cadherin mRNA與蛋白表達(dá)則明顯升高。已有研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，Slug可通過(guò)結(jié)合E-cadherin基因啟動(dòng)子的E盒而直接抑制其表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)EMT的抑制作用。由此推測(cè)，miR-200c在三陰性細(xì)胞系中可通過(guò)抑制Slug的表達(dá)而促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，最終抑制EMT進(jìn)程。結(jié)合文獻(xiàn)[14]可推測(cè)：Slug mRNA和蛋白高表達(dá)是miR-200c發(fā)揮抑制作用的前提條件之一。

三陰性乳腺癌細(xì)胞系E-cadherin低表達(dá)，細(xì)胞與細(xì)胞間黏附能力低，癌細(xì)胞遷移能力較強(qiáng)。該研究采用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察三陰性乳腺癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-200c后遷移能力的變化，結(jié)果顯示：A組的劃痕寬度恢復(fù)率低于其他組，表明miR-200c可以降低細(xì)胞遷移能力。結(jié)合Slug、E-cadherin在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況，推測(cè)在三陰性細(xì)胞系中存在可調(diào)節(jié)EMT進(jìn)程的miR-200c/Slug/E-cadherin途徑。

綜上所述，在三陰性細(xì)胞系中，miR-200c可通過(guò)下調(diào)Slug的表達(dá)而提高E-cadherin的表達(dá)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞EMT，降低乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。Slug作為miR-200c/Slug/E-cadherin調(diào)節(jié)途徑的重要環(huán)節(jié)，有望成為三陰性乳腺癌個(gè)體化治療的靶點(diǎn)之一。

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Effects of miR-200c on epithelial-mesenchymal transition of triple negative breast cancer cell lines

JIALiting,ZHANGYuchao,LIJing,ZHANGLinlin,TIANYuan,YUHaiyang,RONGShouhua,XINGJinfang,LIJunfang,MAXiaotian

ClinicalLaboratory,theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordstriple negative breast cancer;miR-200c;Slug;E-cadherin;epithelial-mensenchymal transition

AbstractAim: To investigate the role of miR-200c in the epithelial-mesenchymal transition(EMT) of triple negative breast cancer(TNBC). Methods: Human breast cancer lines TNBC cells(BT549 and MDA-MB-231), and non-TNBC cells(MCF-7 and SK-BR-3) were chosen in this study. Each cell line was transient transfected with miR-200c mimic and Lipo2000(group A), miR-200c-control and Lipo2000(group B), miR-negative control and Lipo2000(group C),reagent control(group D) and blank control(group E). Then total RNA and protein were extracted and determined by RT-RCR and Western blot, respectively. Wound healing assay was applied to determine the migratory ability of each group in BT549 and MDA-MB-231. Results: Compared with non-TNBC cells,the expression levels of Slug mRNA and protein were significantly increased,while those of E-cadherin mRNA and protein were decreased(P<0.05). In TNBC cells BT549 and MDA-MB-231, the cells transfected with miR-200c showed significant down-regulation of Slug(P<0.05), up-regulation of E-cadherin(P<0.05), and cell migratory ability was significantly decreased(P<0.05). Conclusion: miR-200c might inhibit the EMT and decrease the migratory ability of TNBC cell lines by down-regulating the expression of Slug.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.010

中圖分類號(hào)R392.1

*河南省科技廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目20140629