缺氧誘導(dǎo)因子1α在促卵泡激素促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖與侵襲中的作用

黃 平，張立民*，黃冬冬，裴新偉，史春燕

(1.河北省滄州市中心醫(yī)院婦一科，河北 滄州 061000；2.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校診斷教研室，河北 滄州 061000)

?

·論 著·

缺氧誘導(dǎo)因子1α在促卵泡激素促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖與侵襲中的作用

黃 平1，張立民1*，黃冬冬2，裴新偉1，史春燕1

(1.河北省滄州市中心醫(yī)院婦一科，河北 滄州 061000；2.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校診斷教研室，河北 滄州 061000)

目的探討缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-induced factor-1α，HIF-1α)抑制促凋亡因子Bid、Bim、Puma在卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖與侵襲中的作用。方法培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株，并分為對(duì)照組、FSH組、HIF-1α抑制組，其中FSH組以40 U/L FSH處理SKOV3細(xì)胞48 h，HIF-1α抑制組先以HIF-1α抑制劑甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol，2ME，5 μmol/L)作用72 h，再加入FSH(40 U/L)處理48 h，采用四甲基偶氮唑藍(lán)法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，免疫蛋白印記法檢測(cè)HIF-1α及促凋亡因子Bid、Bim、Puma的表達(dá)。結(jié)果與FSH組相比，HIF-1α抑制組細(xì)胞增殖率、侵襲能力、HIF-1α表達(dá)均明顯下降(P<0.05)，促凋亡因子Bid、Bim、Puma表達(dá)明顯上升(P<0.05)。結(jié)論FSH可能通過激活HIF-1α降低促凋亡因子Bid、Bim、Puma表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖與侵襲。

卵巢腫瘤；卵泡刺激素；缺氧誘導(dǎo)因子1α

卵巢癌已成導(dǎo)致發(fā)達(dá)國(guó)家婦女死亡的第5位婦科惡性腫瘤[1]。已有研究表明，過量的卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)通過增加缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-induced factor-1α，HIF-1α)表達(dá)，促使腫瘤血管增生、轉(zhuǎn)移，但其具體發(fā)生機(jī)制至今尚未闡明[2]。Bid、Bim和Puma是Bcl-2家族重要的促凋亡因子，在引發(fā)Bax和Bak形成線粒體膜寡聚蛋白通道、釋放細(xì)胞色素C、促進(jìn)腫瘤發(fā)生和細(xì)胞凋亡中起著重要的作用[3]。本研究通過檢測(cè)FSH對(duì)加入HIF-1α抑制劑甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol，2ME)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞中Bid、Bim、Puma表達(dá)的影響，探討其腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制，旨在為臨床研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料來源 卵巢癌細(xì)胞株SKOV3由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，滄州市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代保存。注射用重組人FSH購(gòu)自瑞士Laboratoires Serono SA公司，HIF-1α抑制劑2ME購(gòu)自美國(guó)San Diego公司，兔抗人Bid、Bim、Puma抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，胎牛血清、RPMI 1640、胰蛋白酶及青霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 SKOV3細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌細(xì)胞株SKOV3接種于含有10%胎牛血清和100 kU/L青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，胰蛋白酶消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 四甲基偶氮唑藍(lán)法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞的增殖能力 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組，即對(duì)照組、FSH組、HIF-1α抑制組，其中HIF-1α抑制組中已使用HIF-1α抑制劑2ME(5 μmol/L)作用72 h。常規(guī)胰酶消化計(jì)數(shù)后，取96孔培養(yǎng)板，每孔接種200 μL(含有5×104個(gè)細(xì)胞)，均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)6～8 h，待細(xì)胞貼壁后，參考既往文獻(xiàn)[4-5]，F(xiàn)SH組更換為含有FSH 40 U/L的培養(yǎng)基，HIF-1α抑制組更換為含有FSH 40 U/L及2ME 5 μmol/L的培養(yǎng)基。將96孔培養(yǎng)板放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，以不含有細(xì)胞、只加培養(yǎng)基的空白孔作為校準(zhǔn)孔。在對(duì)照組、FSH組、HIF-1α抑制組細(xì)胞中，每孔中加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，同樣條件下繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。棄上清液后每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)并振蕩10 min，置酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A值)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)增殖率，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖率(%)=(AFSH-A空白對(duì)照)/(A對(duì)照-A空白對(duì)照)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并取均值[3]。

1.4 體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞的侵襲能力 在置有聚碳酸酯膜(8 μm孔徑)的Transwell小室底部膜的上室面使用100 mL Matrigel鋪成人工底模，37 ℃下放置2 h，并置于超凈臺(tái)內(nèi)紫外線照射風(fēng)干過夜。使用前30 min重新水化成膠。在預(yù)包被的Transwell小室中每孔加入SKOV3細(xì)胞懸液200 μL(含有2×104個(gè)細(xì)胞)，其中HIF-1α抑制組中已使用HIF-1α抑制劑2ME(5 μmol/L)作用72 h，下室加入RPMI 1640培養(yǎng)基500 μL，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，各組更換相應(yīng)培養(yǎng)基(同MTT法)并處理48 h。使用無菌棉簽擦去Transwell小室上未穿過的細(xì)胞，風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，倒置顯微鏡下(×100)計(jì)數(shù)10個(gè)不同視野中的穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并取均值[6]。

1.5 蛋白免疫印跡分析 同MTT法分組及處理， FSH組以40 U/L的FSH處理SKOV3細(xì)胞48 h，HIF-1α抑制組中先以HIF-1α抑制劑2ME(5 μmol/L)作用72 h，再加入FSH(40 U/L)處理48 h。收集各組細(xì)胞并使用裂解液(碧云天生物制劑有限公司，中國(guó))將細(xì)胞裂解，煮沸使蛋白變性，使用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物制劑有限公司，中國(guó))檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。50 μg蛋白質(zhì)上樣后6聚丙烯酰氨凝膠電泳中電流恒定進(jìn)行電泳，電壓恒定濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，TBST洗膜，分別加入兔抗人Bid、 Bim、Puma或HIF-1α(1∶500)，37 ℃ 下1 h孵育后，TBST洗膜3次，每次10 min。山羊抗兔二抗(1∶1 000)25 ℃ 1 h孵育，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光，以GADPH作為內(nèi)參照[3]。

2 結(jié) 果

2.1SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖率與細(xì)胞侵襲能力比較MTT比色法檢測(cè)顯示，SKOV3細(xì)胞在經(jīng)過濃度為40U/L的FSH處理48h后，其細(xì)胞增殖率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。 經(jīng)過HIF-1α抑制劑2ME(5μmol/L)預(yù)先處理72h后，HIF-1α抑制組細(xì)胞增殖率與FSH組相比明顯降低(P<0.05)，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。FSH組的穿過細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組(P<0.05)，而HIF-1α抑制組的穿過細(xì)胞數(shù)明顯少于FSH組(P<0.05)，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 3組SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖率和細(xì)胞侵襲能力比較

組別 細(xì)胞增殖率(%)穿過細(xì)胞數(shù)(個(gè))對(duì)照組100.00±1.1324.0±8.0FSH組173.21±0.93*125.0±16.0*HIF-1α抑制組126.73±1.18*#45.0±10.0*# F5824.930101.441 P0.0000.000

*P<0.05與對(duì)照組比較 #P<0.05與FSH組比較(SNK-q檢驗(yàn))

2.2 SKOV3細(xì)胞中HIF-1α、Bid、Bim及Puma蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組比較，F(xiàn)SH組中HIF-1α蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與FSH組比較，HIF-1α抑制組中HIF-1α表達(dá)量明顯下降(P<0.05)；與對(duì)照組比較，F(xiàn)SH組Bid、Bim和Puma蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，與FSH組比較，HIF-1α抑制組的Bid、Bim和Puma蛋白的表達(dá)明顯回升，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 SKOV3細(xì)胞中HIF-1α、Bid、Bim及Puma蛋白表達(dá)

C.對(duì)照組；F.FSH組，H.HIF-1α抑制組

表2 3組SKOV3細(xì)胞中HIF-1α、Bid、 Bim及Puma蛋白表達(dá)比較

組別 HIF-1αBidBimPuma對(duì)照組0.21±0.050.52±0.070.73±0.020.47±0.08FSH組0.93±0.05*0.25±0.04*0.27±0.03*0.11±0.06*HIF-1α抑制組0.38±0.04*#0.44±0.05*#0.52±0.03#0.32±0.05*# F321.89432.0568.71339.240 P0.0000.0000.0050.000

*P<0.05與對(duì)照組比較 #P<0.05與FSH組比較(SNK-q檢驗(yàn))

3 討 論

本研究觀察了卵巢癌SKOV3細(xì)胞在給予FSH處理和HIF-1α抑制劑后對(duì)細(xì)胞增殖率和侵襲能力的影響，并觀察了2種處理對(duì)促凋亡因子Bid、Bim、Puma的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH能夠顯著提高SKOV3細(xì)胞增殖率及侵襲能力，并降低促凋亡因子Bid、Bim、Puma的表達(dá)，但經(jīng)過HIF-1α抑制劑2ME處理后，F(xiàn)SH提高SKOV3細(xì)胞增殖率及侵襲能力的作用顯著下降，促凋亡因子Bid、Bim、Puma的表達(dá)顯著升高。表明FSH促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲的作用可能與增加HIF-1α表達(dá)后抑制Bid、Bim、Puma表達(dá)有關(guān)。

FSH作為腺垂體分泌的一種糖蛋白激素，在促進(jìn)卵巢癌的增殖及侵襲中發(fā)揮著重要的作用[7]。根據(jù)既往國(guó)內(nèi)外的研究以及我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用40 U/L FSH處理SKOV3細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖率及侵襲能力最高，同時(shí)，這一濃度在絕經(jīng)后婦女外周血FSH水平范圍內(nèi)，支持促性腺激素致癌的觀點(diǎn)[7-8]。

FSH通過激活HIF-1α在促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖與侵襲過程中發(fā)揮著重要作用[9]。本研究在給予HIF-1α抑制劑2ME處理SKOV3細(xì)胞后，HIF-1α表達(dá)下降，F(xiàn)SH提高SKOV3細(xì)胞增殖率及侵襲能力的作用也顯著下降，與之前的研究結(jié)果一致[10]。表明HIF-1α在接受到FSH信號(hào)傳導(dǎo)后可能通過抑制凋亡或促進(jìn)增殖基因的表達(dá)誘發(fā)卵巢癌細(xì)胞的增殖與侵襲。

通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，促凋亡因子Bid、Bim和Puma在接受HIF-1α抑制劑2ME處理后表達(dá)增加，說明HIF-1α的表達(dá)下降可能導(dǎo)致促凋亡因子Bid、Bim和Puma的表達(dá)上升，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bid、Bim、Puma可以通過激動(dòng)Bak、Bax或者使Bcl-2、Bcl-XL、MCL-1失活，促進(jìn)Bak和Bax形成寡二聚體，介導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)。最近引人注目的一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)表明，通過Bid、Bim和Puma基因共敲除鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Bid、Bim和Puma能夠直接激活Bax和Bak，從而啟動(dòng)凋亡程序。既往的各種研究表明Bid、Bim和Puma作為促凋亡的關(guān)鍵分子，引發(fā)Bax和Bak形成線粒體膜寡聚蛋白通道，釋放細(xì)胞色素C，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3,11]。

在體外實(shí)驗(yàn)中，結(jié)腸癌細(xì)胞已被證實(shí)在缺氧條件下Bid mRNA和蛋白表達(dá)均受到抑制，這可能是由于HIF-1α通過與Bid的啟動(dòng)子相結(jié)合抑制Bid表達(dá)所導(dǎo)致的[12]。另外一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者腫瘤組織中HIF-1α表達(dá)增高細(xì)胞和組織中伴有Bid表達(dá)的下降，而HIF-1α表達(dá)降低細(xì)胞和組織中伴有Bid表達(dá)的上升[4]。在眾多腫瘤細(xì)胞的失巢性凋亡抵抗機(jī)制中，HIF-1α減少Bim表達(dá)也成為近來所關(guān)注的熱點(diǎn)[13-14]。在卵巢癌抗藥試驗(yàn)中Puma基因表達(dá)的增加也伴有HIF-1α的表達(dá)下降[15]。以上研究及本研究結(jié)果均表明，抑制HIF-1α可能通過促進(jìn)Bid、Bim、Puma表達(dá)引發(fā)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)FSH能夠顯著提高SKOV3細(xì)胞增殖率及侵襲能力，并降低促凋亡因子Bid、Bim、Puma的表達(dá)，但經(jīng)過HIF-1α抑制劑2ME處理后，F(xiàn)SH提高SKOV3細(xì)胞增殖率及侵襲能力的作用顯著下降，而促凋亡因子Bid、Bim、Puma的表達(dá)顯著提高。說明FSH可能通過激活HIF-1α降低促凋亡因子Bid、Bim、Puma表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖與侵襲，這可能為卵巢癌的治療提供新的思路。

[1] Luvero D,Milani A,Ledermann JA. Treatment options in recurrent ovarian cancer:latest evidence and clinical potential[J]. Ther Adv Med Oncol，2014，6(5):229-239.

[2] Assou S,Haouzi D,Dechaud H,et al. Comparative gene expression profiling in human cumulus cells according to ovarian gonadotropin treatments[J]. Biomed Res Int,2013,2013:354582.

[3] Zhang L,Zhao X,Jiang X. Sevoflurane post-conditioning protects primary rat cortical neurons against oxygen-glucose deprivation/resuscitation:roles of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and bid,bim,puma[J]. Neurochem Res,2015 [Epub ahead of print].

[4] Gao C,Li S,Zhao T,et al. Scf,regulated by HIF-1α,promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell progression[J]. PloS One,2015,10(3):e0121338.

[5] Liu L,Zhang J,Fang C,et al. Oct4 mediates FSH-induced epithelial-mesenchymal transition and invasion through the ERK 1/2 signaling pathway in epithelial ovarian cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun,2015,461(3):525-532.

[6] Wen Z,Zhao S,Liu S,et al. Microrna-148a inhibits migration and invasion of ovarian cancer cells via targeting sphingosine-1-phosphate receptor 1[J]. Molecular Medicine Reports,2015 [Epub ahead of print].

[7] Yang Y,Zhang J,Zhu Y,et al. Follicle-stimulating hormone induced epithelial-mesenchymal transition of epithelial ovarian cancer cells through follicle-stimulating hormone receptor PI3K/Akt-snail signaling pathway[J]. Int J Gynecol Cancer,2014,24(9):1564-1574.

[8] Zhang HH,Xu PY,Wu J,et al. Dehydroepiandrosterone improves follicular fluid bone morphogenetic protein-15 and accumulated embryo score of infertility patients with diminished ovarian reserve undergoing in vitro fertilization:a randomized controlled trial[J]. J Ovarian Res,2014,7:93.

[9] Zhang Z,Wang Q,Ma J,et al. Reactive oxygen species regulate FSH-induced expression of vascular endothelial growth factor via Nrf2 and HIF1α signaling in human epithelial ovarian cancer[J]. Oncol Rep,2013,29(4):1429-1434.

[10] Xu CL,Lu XL,Yan XN,et al. Effects of PI3K/Akt/NF-κB signal pathway on FSH facilitation on cell proliferation and invasion by human epithelial ovarian cancer[J]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi,2012,47(2):134-138.

[11] 申薇,梁冰鋒,李秀榮,等.卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP的建立及其與凋亡途徑蛋白的關(guān)系[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,35(10):1135-1139.

[12] Chen Y,Xu G,Zheng Y,et al. Nanoformulation of D-α--tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate-b-poly(ε-caprolactone-ran-glycolide) diblock copolymer for siRNA targeting HIF-1α for nasopharyngeal carcinoma therapy[J]. Int J Nanomedicine,2015,10：1375-1386.

[13] Maroni P,Bendinelli P,Matteucci E,et al. Osteolytic bone metastasis is hampered by impinging on the interplay among autophagy,anoikis and ossification[J]. Cell Death Dis,2014,5:e1005.

[14] Whelan KA,Schwab LP,Karakashev SV,et al. The oncogene HER2/neu (ERBB2) requires the hypoxia-inducible factor HIF-1 for mammary tumor growth and anoikis resistance[J]. J Biol Chem,2013,288(22):15865-15877.

[15] Gu J,Tang Y,Liu Y,et al. Murine double minute 2 siRNA and wild-type p53 gene therapy enhances sensitivity of the SKOV3/DDP ovarian cancer cell line to cisplatin chemotherapy in vitro and in vivo[J]. Cancer letters,2014,343(2):200-209.

2015-05-13；

2015-06-25

黃平(1978-)，女，河北滄州人，河北省滄州市中心醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事婦科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:azai2005@sina.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.04.020

R737.31

B

1007-3205(2016)04-0450-04

許卓文)